توصيف مستقلة تماما وجمع البيانات من بلورات جزيئات البيولوجية
Summary
وهنا، نحن تصف كيفية استخدام الفرز الآلي وخيارات جمع البيانات المتاحة في بعض بيملينيس السنكروتروني. العلماء إرسال عينات كريوكوليد إلى السنكروتروني، ويتم فحص خصائص الحيود ومجموعات البيانات التي تم جمعها ومعالجتها و، حيثما أمكن، حل هيكل ينفذ — كل ذلك دون تدخل بشري.
Abstract
الحزم الأشعة السينية عالية-تألق مقترنة بأتمتة أدت إلى استخدام بيملينيس على أساس السنكروتروني البلورات بالأشعة السينية الجزيئات (MX) للمشاريع الأكثر تحديا حتى في الأحياء الهيكلية. ومع ذلك، معظم المرافق لا تزال تتطلب وجود عالم في الموقع لإجراء التجارب. جيل جديد من بياملينيس الآلي مخصصة لتوصيف التلقائي بالكامل، وجمع البيانات من بلورات الجزيئات البيولوجية الكبرى قد وضعت مؤخرا. وتمثل هذه بياملينيس أداة جديدة لعلماء الأحياء الهيكلية لفحص نتائج المحاكمات تبلور الأولية و/أو جمع عدد كبير من مجموعات البيانات الحيود، المستعملين دون الحاجة إلى التحكم في بيامليني بأنفسهم. هنا نعرض كيفية إعداد تجربة للفرز التلقائي، وجمع البيانات، وكيف يتم إجراء تجربة على بيمليني، كيفية معالجة مجموعات البيانات الناتجة عن ذلك، وكيف، عندما يكون ذلك ممكناً، يتم حلها بنية بلورية جزيء ضخم البيولوجية.
Introduction
تحديد هيكل ثلاثي الأبعاد للبروتينات معينة أمر حاسم في علم الأحياء. المعلومات مشتق من القيام حتى يلقي الضوء على الوظيفة البيولوجية وعلى الشكل والنوعية للمواقع النشطة و/أو الملزمة الواردة في جزيء قيد الدراسة. في كثير من الحالات، وهذا ما يسمح آليات العمل تحديد، أو عند الاقتضاء، المحتملة جزيئات علاجية توضع. الإرسال المتعدد هو الأسلوب الأكثر استخداماً للحصول على المعلومات الهيكلية، ولكن عنق زجاجة هو تحديد الظروف المثلى للحصول على بلورات ديفراكتينج جيدا. ولذلك، تبلور المحاكمات تجري في ظروف مختلفة عديدة وفرزا، ثم العثور على بلورات أفضل التي ستستخدم لجمع البيانات الحيود. أتمتة برنامج الإعداد من بلورة تجارب1 وضوح ساعد في هذا الصدد. ومع ذلك، الخطوات اللاحقة (أي تركيب الكريستال والفرز الحيود وجمع البيانات الحيود) عادة ما تنفذ يدوياً، تناول الكثير من الوقت والجهد والموارد. أتمتة حيود التحري وجمع البيانات، لذلك، يعني مكسب هائل في الوقت والكفاءة.
حيود التحري وجمع البيانات في نطاق يتم في أغلب الأحيان في بيملينيس السنكروتروني MX التي سهلت التشغيل الآلي إلى حد كبير هذه العملية. ومع ذلك، في معظم الحالات، من الضروري للعلماء أن يكونوا موجودين في بيمليني أثناء تجربة أو لتشغيلها عن بعد. جيل جديد من بيملينيس MX مؤتمتة بالكامل في الآونة الأخيرة نمواً2. وهنا، لا يحتاج المستخدمون يكون حاضرا، أما جسديا أو عن بعد، خلال جلسة تجريبية. يسمح هذا العلماء إلى أنفاق المزيد من الوقت على أقل من المهام الروتينية، بدلاً من أيام أسرة الإنفاق، وكثيراً ما ليال وبلورات التحري وجمع البيانات الحيود. بيامليني مؤتمتة بالكامل الأول في العالم هو “واسع الآلي عينة مختارة متكاملة مرفق” (ماسيف-1، ID30A-1)2،3 في مرفق الإشعاع السنكروتروني الأوروبية (أسرف). أنها بيئة عينة فريدة من نوعها التي تعمل فيها ديوار المحتوية على العينة ذات قدرة عالية بالترادف مع مغير عينة روبوتية التي تعمل أيضا بيمليني جونيوميتير4،5. كتلة صخرية-1 هو بيمليني أوندولاتور مجهزة بمفرده-فوتون-عد هجين بكسل كاشف6، التي تعمل في موجه ثابتة من 0.969 (12.84 كيلو إلكترون فولط) مع شعاع الأشعة سينية مكثفة (2 × 1012 الفوتونات/s). يمكن ضبط حجم الحزمة في الموضع عينة بين الحد أدنى من 10 ميكرون (جولة شعاع) بحد أقصى 100 ميكرومتر x 65 ميكرومتر (الأفقية بحجم شعاع عمودي). في المتوسط، يمكن بيمليني العملية، في تلقائية تماما أزياء بلورات 120 (انظر أدناه)، في 24 ساعة. تشغيل بيامليني يستند إلى سلسلة من مهام سير العمل7، كل منها يأخذ قرارات ذكية استناداً إلى نتائج الخطوات السابقة في سير العمل، لضمان قياس أفضل البيانات الممكنة من العينة قيد الدراسة. على وجه الخصوص، تقييم خصائص الحيود عينة فردية تأخذ بعين الاعتبار كريستال حجم والتمويه ويضمن، حيث الكريستال أكبر من شعاع الأشعة السينية، أن يستخدم فقط المنطقة أفضل من الكريستال للبيانات اللاحقة جمع. وهكذا، الأمثل مجموعات البيانات الحيود للقرار كحد أقصى مع الإشعاع المصغر الأضرار2،3. تطالب بروتوكولات جمع البيانات، مثل استراتيجيات جمع حلزونية الزائفة (موقف متعدد) البيانات لكلا حيود الشاذة الأصلية وطول موجي واحد (SAD) جمع البيانات، وهي أيضا متاحة8.
تجارب تلقائية تماما في كتلة صخرية-1 إشراك كريوكولينج وتركيب البلورات على جبل مغناطيسي عينة مناسبة لمستوى المعدات المطلوب بيامليني دبابيس العمود الفقري9، إدخال المعلمات التجريبية المرغوب في ‘ الحيود خطة ‘الجدول في”النظام المتكامل””البروتين البلوري” بيملينيس (إيسبيب)10، نظام إدارة معلومات المستندة إلى ويب لتجارب MX، وإرسال العينات إلى بيمليني. في أسرف، جميع تكاليف النقل للعينات من بيامليني التي يدعمها “مكتب المستخدم أسرف” (انظر الموقع الإلكتروني ل أسرف11 لمزيد من التفاصيل). كتلة صخرية-1، لا توجد قيود على حجم التكرار الحلقي أو نوعية الكريستال. عند اختيار خطة حيود لبلورة معين، يمكن للمستخدم استخدام الإعدادات الافتراضية أما أو اختر من سير العمل المحددة، والتي يمكن أن تكون مخصصة لكل عينة. وتتوفر العديد من مهام سير العمل مبرمجة مسبقاً. في سير العمل مكسبريسي3 ، تتم محاذاة الحلقة المحتوية على عينة أولاً إلى موقف العينة استخدام التوسيط الضوئية. ثم، المستندة إلى أشعة X توسيط يضمن أن المنطقة أفضل من الكريستال يتم توسيط لشعاع الأشعة السينية. ثم تحسب استراتيجيات جمع البيانات استخدام عيدنا، إطارا لتطوير التطبيقات المستندة إلى البرنامج المساعد خاصة لتحليل البيانات على شبكة الإنترنت في مجال تجارب الأشعة السينية، آخذا في الاعتبار كريستال حجم والتمويه في الوقت الحقيقي في بيمليني. عقب جمع مجموعة من البيانات حيود كامل، هذا هو ثم معالجتها باستخدام سلسلة من أنابيب معالجة البيانات الأوتوماتيكية12 وتتاح النتائج التفتيش وتحميل في إيسبيب. سير العمل3 SAD مكسبريسيتهدف إلى سيلينوميثيونيني التي تحتوي على بلورات البروتين المستهدف ويستغل حقيقة أن الطاقة التشغيلية من كتلة صخرية-1 فقط فوق حافة ك سراج الدين. هنا، هو استراتيجية جمع البيانات عيدنا مكسبريسي الأمثل لجمع البيانات حزين (أي التكرار عالية، ومع قرار تعيين إلى حيث Rالدمج بين أزواج بيجفوت أقل من 5%). شاشة خصائص الحيود سلسلة من بلورات دون جمع البيانات اللاحقة، يمكن استخدام سير العمل3 مكسسكوريلإجراء تقييم جودة كاملة من بلورات تحليلها. في سير العمل3 مكسبريسي، جمعت 180 ° للتناوب البيانات باستخدام ذبذبات 0.2 ° واستخدام زاوية phi البداية والقرار تحدد استراتيجية عيدنا. مكسبريسو 3 يتضمن قرارا بريوبسيرفيد في سير العمل (الافتراضي: ددقيقة = 2). جعل تقييما أولياً لبلورات الناتجة عن بلورة لمحاكمة، وتقدم سير العمل3 مكسبريسم. وهذا ينفذ شبكة جرعة عالية المسح الضوئي عبر اتجاه أوسع لدعم نموذج مع لا جمع البيانات أو توسيط. في الآونة الأخيرة، كانت اثنين سير التجربة الجديدة، مكسبريسب ، و MXPressP_SAD، والقيام بعمليات جمع البيانات بسيودوهيليكال، نفذت8. تنفيذ كافة الخطوات في كافة مهام سير العمل التي يمكن اتباعها على الإنترنت وفي الوقت الحقيقي من المستخدم، وعن طريق إيسبيب.
هنا نعرض كيفية إعداد تجربة MX مؤتمتة بالكامل في كتلة صخرية-1 وكيفية استرجاع وتحليل البيانات الناتجة عن هذه التجربة. على سبيل مثال، نحن نستخدم جليكاين المتقدرية البشرية الانقسام ونظام البروتين ح (جكش). هذا البروتين الذي يحتوي على حامض يبويتش جزء من نظام الانقسام جليكاين المسؤولة عن تدهور جليكاين. يتضمن هذا النظام كذلك البروتين ف، decarboxylase بيريدكسال جليكاين تعتمد على الفوسفات والبروتين T، إنزيم تيتراهيدروفولاتي-التي تتطلب والبروتين L، نازعة ليبواميدي. جكش ينقل مجموعة ميثيلاميني جليكاين من البروتين ف للبروتين T. عيوب في البروتين ح هي السبب في هايبرجليسينيميا نونكيتوتيك (نخ) في13من البشر.
Protocol
Representative Results
Discussion
بياملينيس التلقائي بالكامل توفر الآلي توصيف وجمع البيانات من إعداد كبيرة من بلورات الجزيئات دون الوجود عالم، أما في بيامليني أو عن بعد، يجري المطلوبة. وقد بياملينيس مؤتمتة بالكامل باستخدام العديد من المزايا مقارنة بالتشغيل اليدوي. المثال، النموذج الآلي التوسيط، استناداً إلى شبكة الأشعة السينية، وخط المسح الضوئي، وهو أكثر دقة من التي يؤديها بالعين البشرية أنه لا يتأثر بالتأثيرات الحرارية أو الضوئية. في الواقع، توفر هذه الشبكة وخط بمسح بيانات إضافية (أي أبعاد مفصلة للبلورة وأفضل ديفراكتينج منطقة الكريستال) التي تعتبر هامة في تحديد حجم الحزمة الصحيحة لاستخدامها لجمع البيانات – خاصة بالنسبة لبلورات صغيرة 18-وكثيراً ما يؤدي إلى تحسين نوعية البيانات الحيود التي تم الحصول عليها. وعلاوة على ذلك، بالاستفادة من المعلمات المعرفة من قبل المستخدم في إعداد تجارب التلقائي، خطوات سير العمل المحددة في يمكن تكييفها لتناسب النظام قيد الدراسة، وبالتالي زيادة تحسين معدل نجاح التجربة.
آخذا معا، موثوقية مهام سير العمل المتوفرة، الوصول مباشرة إلى بيمليني (المستخدمين جدولة ذاتيا، باستخدام تقويم [انظر أعلاه])، ونهج مؤتمتة بالكامل لكتلة صخرية-1 يوفر صارمة، الفائق، وتوفير الوقت بديل لتجارب MX العملي الكلاسيكي والقدرة على تنفيذ إجراءات أكثر تقدما والتطبيقات في مهام سير العمل التلقائية. في المستقبل القريب، سيتم تنفيذ كريستال رسم الخرائط في 3D19 لتحسين الدقة من الأشعة السينية التوسيط، بينما سيكون آليا بروتوكولات أكثر تعقيداً، مثل كريستال الجفاف تجارب20،. ويؤمل أن تصبح جمع بيانات مستقلة تماما أسلوب قياسي في MX، توفير بيانات عالية الجودة للشاشات جزء جزيء صغير، والاستفادة المثلى من فحص عدد كبير من سوء ديفراكتينج بلورات وتوفير المرحلة تلقائياً مزيد من المعلومات لحل الكريستال هياكل حيثياته. في تركيبة مع التطورات في حصاد الآلي لبلورات21، بإمكانية حل بنية بلورية البروتين كخدمة الآلي يمكن أن يصبح حقيقة واقعة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون أسرف بيامتيمي.
Materials
| Beamline MASSIF-1 | ESRF | ||
| BL21DE3 | New England Biolabs | C2527I | |
| chloramphenicol | Roth | 3886.1 | |
| Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K | Merck Millipore | UFC803024 | |
| Dialyzing membrane | Spectrumlabs | 132655 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dnase | Roche | 11284932001 | |
| DTT | Euromedex | EU0006-B | |
| EDTA- free protease inhibitors | Roche | 4,693,159,001 | |
| glycerol | VWR Chemicals Prolabo | 14388.29T | |
| His-trap HP | GE healthcare | 17-5247-01 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-500G | |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B | |
| LB medium | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| lipoic acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| loop | Hampton Research | HR8-124 | |
| lysozyme | Roche | 10 837 059 001 | |
| MonoQ 5/50 GL | GE healthcare | 17-5166-01 | |
| NaCl | Fisher Chemical | S/3160/60 | |
| Sonicator vibra cell 75/15 | SONICS | ||
| SPINE pucks | MiTeGen | SKU: M-CSM003-0001A | |
| Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B | |
| Sodium Formate | Sigma-Aldrich | 1064430500 | |
| GCSH purification buffer | 20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl | ||
| GCSH cryo-protection buffer | 0.25 M Sodium Formate pH 4, 30% glycerol | ||
| Programs: | |||
| MxCube | Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010) | local development | |
| ISPyB | ESRF | Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535 | local development |
| MXCube2 | ESRF | Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014). | local development |
| BES workflow server | Brockhauser, S. et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012). | ||
| DOZOR | ESRF | Bourenkov and Popov, unpublished | local development |
| BLISS beamline control | Guijarro, M. et al. BLISS – Experiments Control for ESRF EBS Beamlines. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, Barcelona, Spain. doi: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018). | local development | |
| AUTO processing of images | Monaco, S. et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013) | local development | |
| BEST and EDNA | Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009). | local development | |
| CCP4 | Winn, M.D. et al. Overview of the CCP 4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011). | ||
| Phaser MR | McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007). | ||
| Coot | Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004). | ||
| refmac5 | Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method. Acta Crystallographica Section D. 53, 240–255 (1997). | ||
| Matthews | Matthews, B.W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968). |
References
- Hui, R., Edwards, A. High-throughput protein crystallization. Journal of Structural Biology. 142 (1), 154-161 (2003).
- Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
- Svensson, O., Malbet-Monaco, S., Popov, A., Nurizzo, D., Bowler, M. W. Fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (8), 1757-1767 (2015).
- Cipriani, F., et al. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68, 1393-1399 (2012).
- Nurizzo, D., et al. RoboDiff: combining a sample changer and goniometer for highly automated macromolecular crystallography experiments. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (8), 966-975 (2016).
- Bowler, M. W., Svensson, O., Nurizzo, D. Fully automatic macromolecular crystallography: the impact of MASSIF-1 on the optimum acquisition and quality of data. Crystallography Reviews. 22 (4), 233-249 (2016).
- Brockhauser, S., et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).
- Svensson, O., Gilski, M., Nurizzo, D., Bowler, M. W. Multi-position data collection and dynamic beam sizing: recent improvements to the automatic data-collection algorithms on MASSIF-1. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74, 433-440 (2018).
- Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).
- Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
- Monaco, S., et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).
- Kikuchi, G., Motokawa, Y., Yoshida, T., Hiraga, K. Glycine cleavage system: reaction mechanism, physiological significance, and hyperglycinemia. Proceedings of the Japan Academy. Series B, Physical and Biological Sciences. 84 (7), 246-263 (2008).
- Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. S. XDSAPP2.0. Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 1085-1092 (2016).
- Vonrhein, C., et al. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).
- Winter, G. xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
- Higashiura, A., et al. High-resolution X-ray crystal structure of bovine H-protein at 0.88 Å resolution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (6), 698-708 (2010).
- Sanishvili, R., et al. A 7 µm mini-beam improves diffraction data from small or imperfect crystals of macromolecules. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (4), 425-435 (2008).
- Bowler, M. W., et al. Diffraction cartography: applying microbeams to macromolecular crystallography sample evaluation and data collection. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (8), 855-864 (2010).
- Bowler, M. W., et al. Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration. Crystal Growth & Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).
- Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
