Site yönettiği Mutagenesis in Vitro ve Escherichia Coli etkileşimlerde RNA ile örneği Vivo deneyler için
Summary
Mutagenesis site yönettiği belirli mutasyonların Deoksiribonükleik asit (DNA) tanıtmak için kullanılan bir tekniktir. Bu iletişim kuralı site yönettiği mutagenesis ile 2 adım nasıl açıklar ve ilgi herhangi bir DNA parçası geçerlidir yaklaşım 3 adımlı polimeraz zincir tepkimesi (PCR) dayalı.
Abstract
Site yönettiği mutagenesis küçük kodlamayan ribonükleik asit (sRNA) molekülleri ve hedef haberci RNA (mRNA) arasındaki etkileşimi araştırmak için DNA belirli mutasyonların tanıtmak için kullanılan bir tekniktir. Buna ek olarak, site yönettiği mutagenesis belirli protein bağlayıcı siteleri için RNA eşlemek için kullanılır. 2-adım ve 3-adım dayalı PCR giriş mutasyonların açıklanmıştır. Tüm protein-RNA ve RNA, RNA-RNA etkileşim çalışmaları ile ilgili bir yaklaşımdır. Kısacası, teknik astar istenen mutation(s) ile 2 veya 3 adımda bir PCR ürünü mutasyon ile sentezleme PCR aracılığıyla tasarlama üzerinde dayanır. PCR ürünü daha sonra klonlama için kullanılır. Burada, nasıl site yönettiği mutagenesis mutasyonlar sRNA, McaS ve mRNA, RNA, RNA-RNA ve RNA-protein etkileşimleri araştırmak için csgD, tanıtmak için her iki 2 ve 3 adım yaklaşım ile gerçekleştirileceğini açıklar. RNA etkileşimleri araştırmak için bu tekniği uygulamak; Ancak, tüm mutagenesis çalışmaları (örneğin, DNA-protein etkileşimleri, amino asit ekleme/değiştirme/silme) için uygun bir tekniktir. Mutasyon doğal olmayan üsler dışında herhangi bir tür tanıtmak mümkün ama tekniği yalnızca PCR ürünü aşağı akım uygulama (örneğin, klonlama ve daha fazla PCR için şablon) için kullanılması durumunda geçerlidir.
Introduction
Tüm yapılar hücrenin DNA’sının sırayla kodlanır ettiği DNA kez için bir yaşam hücre planı denir. Doğru çoğaltma ve DNA tamir mekanizmaları mutasyonların sadece çok düşük oranları, doğru kodlanmış genler fonksiyonların sürdürülmesi için gerekli olduğu ortaya emin olun. Değişiklikleri DNA dizisinin farklı düzeylerde DNA’sını (transkripsiyon faktörleri ve enzimleri tarafından tanınması), sonra RNA (ikincil yapı değişiklik ve baz çifti tamamlayıcılık) ve/veya protein (amino başlayarak birbirini izleyen işlevleri etkileyebilir asit oyuncu değişikliği, silme, ekleme veya çerçeve-vardiya). Birçok mutasyonlar gen işlevini önemli ölçüde etkilemez ise bazı mutasyonlar DNA büyük etkileri olabilir. Böylece, mutagenesis site yönettiği belirli DNA siteleri her düzeyde önemi eğitim için değerli bir araçtır.
Bu iletişim kuralı belirli mutasyonlar tanıtmak için kullanılan bir hedeflenen mutagenesis yaklaşımı açıklar. Protokol iki farklı PCR stratejileri üzerinde dayanır: 2 adım veya 3 adımlı PCR. 2-adım PCR istenen mutasyon 5′ uç ya da ilgi DNA 3′ sonu yakın ise geçerlidir (< 200 baz çifti (bp) sonundan itibaren) ve 3-adım PCR tüm durumlarda geçerlidir.
2-adım PCR yaklaşımda, 3 astar tasarlanmıştır, hangi bir astar kümesi DNA’sı (astar 1 ve 3, ileriye ve geriye doğru sırasıyla) faiz yükseltmek için tasarlanmıştır ve tek bir astar mutasyon birleştirmek için tasarlanmıştır. Mutasyon 5′ ucu ve ileriye doğru bir yönelim yakın ise mutasyon 3′ ucu yakın ise astar (astar 2) tanıtımı mutasyon geriye doğru bir yönelim olmalı. İlk PCR adımda astar 1 + 2 ya da 2 + 3 5′ uç veya 3′ ucu yakın küçük bir parça sırasıyla güçlendirir. Elde edilen PCR ürünü sonra iki adımda bir astar astar 1 veya 3, böylece bir PCR ürünü faiz (Şekil 1A) DNA’daki bir mutasyon ile sonuçlanan ile kullanılır.
3-adım PCR 4 astar tasarlanmış, astar kümesi DNA’sı (astar 1 ve 4, ileriye ve geriye doğru sırasıyla) faiz yükseltmek için tasarlanmıştır ve astar bir dizi belirli mutasyonlar tamamlayıcılık örtüşen ile birleştirmek için tasarlanmıştır (astar 2 ve 3, geri ve ileri, sırasıyla). Bir ve iki adımda, astar 1 + 2 ve 3 + 4 5′ ve 3′ son yükseltmek. Üç adımda elde edilen PCR urun adım bir ve iki şablon olarak kullanılır ve astar 1 + 4 ile güçlendirilmiş. Böylece, elde edilen PCR ürünü istediğiniz mutasyon (Şekil 1B) ile ilgi DNA’sı.
Mutasyona uğramış DNA-ebilmek var olmak kullanılmış için aşağı akım herhangi bir uygulama iken, bu iletişim kuralını DNA klonlama vektör yeniden birleştirmek açıklar. Vektörel çizimler klonlama kullanım kolaylığı klonlama gibi çeşitli avantajları vardır ve özelliklere bağlı olarak belirli deneysel uygulamalar Yöneyin. Bu özellik genellikle RNA etkileşimi çalışmalar için kullanılır. Başka bir RNA etkileşim çalışmaları için karmaşık başka bir RNA1,2 veya protein3,ile4RNA’ın yapısal sondalama tekniğidir. Mutagenesis site yönettiği ve sonraki klonlama için etkileşim çalışmaları içinde vivo izin ise ancak, yapısal sondalama sadece tüp bebek gerçekleştirilir.
Site yönettiği mutagenesis yoğun olarak burada sunulan RNA etkileşim çalışmaları için kullanılmıştır. Ancak, anahtar yöntemi ile ilgili 2 – veya 3-adım PCR DNA herhangi bir parça için geçerlidir ve böylece sadece RNA-etkileşim çalışmaları için sınırlı.
Teknik ve olası kullanımları örneklemek için bölgeler için mRNA, csgD, Escherichia coli (e.coli) çoğu düzenleme önemli karakterizasyonu kullanılır. E. coli, csgD içinde küçük kodlamayan RNA tarafından McaS, protein, protein-ifade CsgD2,4,5bastırmak için Hfq, ile işbirliği içinde hedeflenmektedir. Teknik mutasyonlar McaS arasındaki csgD Bankası eşleştirme bölge ve csgDHfq bağlama site tanıtmak için kullanılır. Elde edilen DNA sonra sonraki deneyler için uygun bir vektör içine klonlanmış. Tekniğin aşağı akım uygulamalar içinde vivo, tüp bebek deneyleri içerir. İçin örnek, örnek 1 içinde vivo bir western blot yöntemi kullanarak karakterizedir ve örnek 2 tüp bebek bir elektroforetik hareketlilik üst karakter tahlil (Emsan) kullanarak karakterizedir. Her iki durumda da, o resimli nasıl site yönettiği mutagenesis birlikte diğer teknikleri ile ilgi bir gen hakkında biyolojik sonuçlar yapmak için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Site yönettiği mutagenesis farklı uygulamaları geniş bir dizi var ve burada, bir içinde vivo ve tüp bebek deney temsilcisi sonuçlarından nasıl biyolojik sonuçlar yöntemi kullanarak yapmak için örnek olarak dahil edildi. Site yönettiği mutagenesis uzun süre RNA etkileşim çalışmaları için altın standart olmuştur. Aşağı akım deneyleri ve deneyler gen ürünlerinde fonksiyonları içinde belirli DNA siteleri ve onların önemi hakkında sonuçlara (örneğin, Batı leke veya Emsan) ile ilgili mut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Güney Danimarka Üniversitesi açık erişim ilkesi hibe teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Anti-GroEL antibody produced in rabbit | Merck | G6532 | Primary antibody |
| Azure c200 | Azure | NA | Gel imaging workstation |
| Custom DNA oligo | Merck | VC00021 | |
| DeNovix DS-11 | DeNovix | NA | Spectrophotometer for nucleic acid measurements |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Scientific | R0611 | |
| Ethidium bromide solution 1 % | Carl Roth | 2218.1 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | Fermentas | SM0333 | |
| Gerard GeBAflex-tube Midi | Gerard Biotech | TO12 | Dialysis tubes for electro elution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704406 | Horizontal electrophoresis system |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Merck | F3165 | Primary antibody |
| Mouse Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0447 | HRP conjucated secondary antibody |
| NucleoSpin miRNA | Macherey Nagel | 740971 | RNA purification |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Scientific | NP0323BOX | Bis-Tris gels for protein separation |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | DNA polymerase |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Rabbit Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0448 | HRP conjucated secondary antibody |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| SigmaPlot | Systat Software Inc | NA | Graph and data analysis software tool |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | PCR machine |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Ligase |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Scientific | B49 |
References
- Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5′ mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
- Jorgensen, M. G., et al. Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Antal, M., et al. A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter. The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).
- Andreassen, P. R., et al. sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA. Nucleic Acids Research. , (2018).
- Thomason, M. K., et al. A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- . JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites. Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
