Summary

מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

Published: February 05, 2019
doi:

Summary

מוטגנזה היא טכניקה המשמשת להציג מוטציות ספציפיות חומצה deoxyribonucleic (DNA). פרוטוקול זה מתאר איך לעשות מוטגנזה בצעד 2, 3-צעד תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) המבוסס על הגישה, אשר חלים על כל מקטע DNA עניין.

Abstract

מוטגנזה היא טכניקה המשמשת להציג ספציפי מוטציות ב- DNA כדי לחקור את האינטראקציה בין מולקולות חומצה ריבונוקלאית (sRNA) קטנות ללא קידוד RNAs שליח היעד (mRNAs). בנוסף, מוטגנזה משמש כדי למפות אתרי קישור ספציפי חלבון ה-RNA. הקדמה PCR המבוסס על שלבים 2 ו- 3-צעד של מוטציות מתואר. הגישה היא רלוונטי כל חלבון-RNA ולימודי אינטראקציה RNA-RNA. בקיצור, השיטה מסתמכת על עיצוב תחל עם mutation(s) הרצויה, 2 או 3. הצעדים של ה-PCR סינתזה של מוצר ה-PCR עם המוטציה. המוצר PCR משמש לאחר מכן לקראת שיבוט. כאן, אנו נתאר כיצד לבצע מוטגנזה עם הגישה 2 – ו 3-צעד שני להציג מוטציות של sRNA, McaS של ה-mRNA, csgD, לחקור RNA-RNA ו- RNA חלבונים. אנו מיישמים את הטכניקה הזו לחקור אינטראקציות RNA; עם זאת, השיטה היא החלים על כל לימודי מוטגנזה מכוונת (למשל, אינטראקציות חלבון-דנ א, חומצה אמינית החלפת/מחיקה/הוספה). ניתן להציג כל סוג של מוטציה חוץ בסיסים הלא טבעי אבל הטכניקה ישימה רק אם מוצר ה-PCR יכול לשמש עבור יישום במורד הזרם (למשל, שיבוט, תבנית נוספת PCR).

Introduction

הדנ א הוא המכונה לעתים קרובות ה-blueprint של תא חי מאז מבני התא מקודדים את רצף ה-DNA שלו. שכפול מדויק מנגנוני תיקון DNA על מנת להבטיח כי רק מאוד נמוכים של מוטציות מתרחשות, שהוא חיוני לקיום פונקציות הנכון של גנים מקודד. שינויים של רצף הדנ א יכול להשפיע על פונקציות רציפות ברמות שונות החל עם ה-DNA (זיהוי על-ידי גורמי שעתוק, אנזימי הגבלה), ואז RNA (זוג בסיסים משלימים את החסר והשינויים מבנה שניוני) ו/או חלבון (אמינו החלפות חומצה, מחיקות, תוספות או מסגרת-משמרות). בעוד מוטציות רבות אינן משפיעות על תפקוד הגן באופן משמעותי, יש מוטציות ב- DNA יכולים להיות השלכות ענקיות. לפיכך, מוטגנזה הוא כלי רב ערך עבור לומד את החשיבות של אתרים DNA ספציפיים בכל הרמות.

פרוטוקול זה מתאר גישה מוטגנזה מכוונת יישוב נוהג להציג מוטציות ספציפיות. הפרוטוקול מסתמכת על שתי אסטרטגיות שונות של ה-PCR: צעד 2 או של PCR 3-צעד. 2-שלב ה-PCR ישימה אם המוטציה הרצוי קרוב בקצה 5′ או 3′ הסוף של ה-DNA של הריבית (< 200 בסיסי זוגות (bp) מסוף) ואת ה-PCR 3-צעד ישימה בכל המקרים.

בגישה PCR דו-שלבי, תחל 3 מיועדים שבו ערכה אחת של תחל נועד להגביר את ה-DNA של הריבית (primers 1 ו- 3, קדימה, הפוך, בהתאמה), יחיד פריימר נועדה לשלב את המוטציה. המוטציה היכרות עם פריימר (פריימר 2) צריך להיות כיוון הפוך, אם המוטציה קרוב לסוף 5′, כיוון קדימה אם המוטציה קרוב בקצה 3′. בשלב הראשון PCR, פריימר 1 + 2 או 3 2 + מגביר קטע קטן קרוב 5′ קצה או 3′ בסוף, בהתאמה. PCR ובמוצר משמשת פריימר בשלב שתיים עם פריימר 1 או 3, ובעקבותיה במוצר ה-PCR עם מוטציה ב- DNA של עניין (איור 1 א’).

ב- PCR 3-צעד, תחל 4 מיועד, שבו ערכה אחת של תחל נועד להגביר את ה-DNA של הריבית (primers 1 ו- 4, קדימה, הפוך, בהתאמה), סט צבעי יסוד אחד נועדה לשלב מוטציות ספציפיות עם חופפים משלימים את החסר (תחל 2 ו- 3, הפוך, קדימה, בהתאמה). בשלב הראשון והשני, תחל 1 + 2 ו- 3 + 4 להגביר בקצה 5′ ו 3′. בשלב 3, מוצרי ה-PCR וכתוצאה מכך צעד ראשון, שני משמשים כתבניות ומצויים מוגבר עם תחל 1 + 4. לכן, ובמוצר PCR הוא ה-DNA של עניין עם המוטציה הרצוי (איור 1B).

בעוד ה-DNA מוטציה יכול לשמש עבור כל יישום במורד הזרם, פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב את הדנ א מחדש לתוך השיבוט וקטור. השימוש של שיבוט וקטורים יש מספר יתרונות כגון הקלות של שכפול ויישומים ספציפיים ניסיוני תלוי בתכונות של וקטור. תכונה זו משמשת לעתים קרובות ללימודי אינטראקציה עם ה-RNA. טכניקה נוספת ללימודי אינטראקציה עם ה-RNA היא חיטוט מבנית של הרנ א במתחם עם עוד RNA1,2 או חלבון3,4. עם זאת, חיטוט מבניים מבוצעת רק במבחנה ואילו מוטגנזה ו שיבוט עוקבות לאפשר ללימודי אינטראקציה ויוו.

מוטגנזה בהרחבה שימש לחקר אינטראקציה RNA כפי שהוצג כאן. עם זאת, שיטת המפתח לגבי 2 או 3-צעד PCR החלים על כל פיסת דנ א, ובכך לא רק מוגבל ללימודים RNA-אינטראקציה.

כדי להדגים את הטכניקה ואת השימושים האפשריים שלו, משמש אפיון אזורי חשוב post-transcriptional ויסות mRNA, csgD, של Escherichia coli (e. coli). ב e. coli, csgD מכוון על ידי קטן ללא קידוד RNA, McaS, בשיתוף עם חלבון, Hfq, להדחיק חלבון-ביטוי של4,2,CsgD5. הטכניקה משמשת כדי להציג מוטציות באזור בסיס תיאום בין csgD לבין McaS, לאתר איגוד Hfq של csgD. ה-DNA שהושג לאחר מכן שוכפל לתוך וקטור מתאים לניסויים הבאים יישומים במורד הזרם של הטכניקה כוללים ניסויים במבחנה וגם ויוו. להמחשה, דוגמה 1 מאופיין ויוו שימוש assay תספיג והוא דוגמה 2 מאופיין במבחנה באמצעות assay משמרת של ניידות electrophoretic (EMSA). בשני המקרים, זה מאויר איך מוטגנזה יכול לשמש בשילוב עם טכניקות אחרות כדי להפוך ביולוגי מסקנות לגבי הגן עניין.

Protocol

1. וקטור בחירה לבחור וקטור לבצע ניסויים במורד הזרם. כל וקטור הוא ישים עבור שיטה זו PCR 2 – ו 3-צעד. בהתבסס על הבחירה של וקטור, לבחור אנזימי הגבלה המתאים עבור שכפול. 2. פריימר עיצוב עבור אתר ביים מוטגנזה מכוונת להחליט בכל שלב 2 או 3-צעד PCR האסטרטגיה (2-שלב זה רק עבור מ…

Representative Results

לחקור RNA אינטראקציות מנשר post-transcriptional של csgD, מלכודת וקטור זוגי נבחר: אחד לבטא את csgD mRNA ועוד לבטא את קטן ללא קידוד RNA, McaS. csgD היה משובטים לתוך pBAD33, אשר הוא אראבינוז, inducible פלסמיד בינוני-העתק בהתנגדות כלורמפניקול, McaS היה משובטים לתוך מיני pNDM220 R1, אשר הוא פלסמיד inducibl…

Discussion

מוטגנזה יש מגוון רחב של יישומים שונים, כאן, התוצאות נציג של ויוו, ניסוי המבחנה נכללו בתור דוגמאות כיצד להפוך את מסקנות ביולוגי בטכניקה. מוטגנזה כבר זמן רב תקן הזהב ללימודי אינטראקציה RNA. כוחה של השיטה טמון השילוב של היכרות עם מוטציות הרלוונטיים עם מבחני במורד הזרם, ניסויים (למשל, תספיג או EMSA)…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצה להודות באוניברסיטת דרום דנמרק גישה פתוחה מדיניות מענקים.

Materials

Anti-GroEL antibody produced in rabbit Merck G6532 Primary antibody
Azure c200 Azure NA Gel imaging workstation
Custom DNA oligo Merck VC00021
DeNovix DS-11 DeNovix NA Spectrophotometer for nucleic acid measurements
DNA Gel Loading Dye (6X) Thermo Scientific R0611
Ethidium bromide solution 1 % Carl Roth 2218.1
GeneJET Gel Extraction Kit Thermo Scientific K0691
GeneRuler DNA Ladder Mix Fermentas SM0333
Gerard GeBAflex-tube Midi Gerard Biotech TO12 Dialysis tubes for electro elution
MEGAscript T7 Transcription Kit Invitrogen AM1334
Mini-Sub Cell GT Cell Bio-Rad 1704406 Horizontal electrophoresis system
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse Merck F3165 Primary antibody
Mouse Immunoglobulins Dako Cytomation P0447 HRP conjucated secondary antibody
NucleoSpin miRNA Macherey Nagel 740971 RNA purification
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Scientific NP0323BOX Bis-Tris gels for protein separation
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531S DNA polymerase
PowerPac HC High-Current Power Supply Bio-Rad 1645052
Rabbit Immunoglobulins Dako Cytomation P0448 HRP conjucated secondary antibody
SeaKem LE Agarose Lonza 50004
SigmaPlot Systat Software Inc NA Graph and data analysis software tool
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096 PCR machine
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202 Ligase
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201S
TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) Thermo Scientific B49

References

  1. Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5′ mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
  2. Jorgensen, M. G., et al. Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
  3. Antal, M., et al. A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter. The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).
  4. Andreassen, P. R., et al. sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA. Nucleic Acids Research. , (2018).
  5. Thomason, M. K., et al. A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
  6. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  7. . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  8. . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  9. . JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  10. Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).
  11. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  12. Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites. Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).
  13. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  14. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).

Play Video

Cite This Article
Andreassen, P. R., Pettersen, J. S., Jørgensen, M. Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli. J. Vis. Exp. (144), e58996, doi:10.3791/58996 (2019).

View Video