マルチ セグメントの注入キャピラリー電気泳動質量分析法による高スループットかつ包括的な薬物監視

盲目の尿サンプルは、聖ヨセフ病院 (ハミルトン、オンタリオ、カナダ)、ハミルトン統合研究倫理委員会で承認されたその研究で気分障害クリニックから博士ページ Zainab Samaan によって提供された親切。 1. 試薬、サンプル ソリューションの準備 背景電解質の作製 背景電解質 (BGE) 隔週、1 M ギ酸による pH 1.8、有機修飾剤として 15 %v/v アセトニ トリル 50 mL を準備します。 割り切れる 1.9 mL はギ酸株式 (26.5 M) を 50 mL メスフラスコに集中し、7.5 mL のアセトニ トリルと脱イオン水 50 mL に合計ボリュームをもたらすに 40.6 mL を追加します。15 分のためのソリューションを超音波照射し、タイトなシールと滅菌ボトルにそれを転送します。 シース液の準備 シース液毎週、60: 40 (MeOH:H2O) の 0.1% ギ酸を含む 200 mL を準備します。 分注 200 μ L 120 mL メタノール、H2O 外装の液体と 15 分のドガの 80 mL を含むボトルにギ酸 (26.5 M 在庫)。 次に、次の参照のイオン、プリン、時の各 10 μ L を追加 (2,2,3,3 tetrafluoropropoxy) mで一定質量の信号を提供するシース液に phosphazine (HP-921)/z 121.05087 とm/z 922.00979、それぞれ。注: これらの参照イオン リアルタイム質量補正を可能にする、分離中に潜在的なマトリックスによるイオン抑制や促進効果の監視も。 標準的な準備 臨床スクリーニングのカットオフ × 3 で 84 薬パネル混合物レベル (L6)14 1 mL のメタノール、化学物質の供給者から購入薬標準を使用してを含む標準溶液を準備します。48 重水素内部薬剤基準 (d-ISs) メタノール 1 mL 中 84 薬物混合物よりも 10 倍高い濃度での混合物を別途ご用意します。さらに、4 の 200 μ M を含む原液を準備-フルオロ-L-フェニルアラニン (F Phe) と 3-クロロ-L-チロシン (Cl Tyr) 1 mL の脱イオン H2o. 4-fluorophenylalanine (F Phe、10 μ L) と 3 chlorotyrosine (Cl Tyr、10 μ L) を合計する認定合成尿行列 (40 μ L) で 10 倍希釈だけでなく、上記の 84 薬物混合物 (20 μ L) と 48 d-ISs (20 μ L) の 5 倍希釈を実行します。250 μ L 遠心管中 100 μ L のボリューム。 外部校正曲線の準備 4 連で (後述)、5 点外部較正曲線を準備 (n = 4) 84-薬剤の標準的な混合物および 1.3.1 の手順で、対応する d-ISs の 48 を使用して 20 の動的範囲を越えて。たとえば、5 点外部校正曲線を作るため 2-、4-、10-、20-84-薬物混合物 (L6、ステップ 1.3.1) を希釈することを確認し、40、一致する d ISs (20 μ L) と 4 F Phe (10 倍希釈の 5 倍希釈を準備する必要があるに対し10 μ L) と Cl Tyr (10 μ L) 追加は、100 μ L の総ボリュームを作成する合成尿行列。場合一致する d-が特定の薬剤を使用できない場合、データの正規化は使用 4-F-Phe の代理として。注: 追加 d ISs 間干渉の包含を避けるため (等圧) CE 分離により完全に解決されない場合は、パネル内の他の DoA と。 尿サンプル準備 知られている処方薬歴を持つ 10 の臨床的にうつ病患者の代表的なコホートから提供朝尿サンプルを解凍します。分析のため解凍する必要になるまで、コレクション後-80 ° C で尿を格納します。注: は、尿や DoA の代謝産物とその抱合体の化学的安定性への影響のためのコレクションの後室温で遅延ストレージの複数の凍結融解サイクルを避けてください。 渦提供早朝尿サンプルを 30 s、それらを遠心沈降の 14,000 × gで 1 分。その後、前述の 10 μ L 分注処理尿 10 μ L を d の-は、および 5 μ L の脱イオン H2O と 1 分の渦の F-ペー/Cl-Tyr および 25 μ L (3 通技術の精度を評価するためにこの手順を繰り返します)。上記の混合物の 20 μ L 因数を分析用ポリプロピレン バイアルに転送します。 2. CE TOF MS システムのセットアップ コーティングしていない石英キャピラリー調節パラメーター 規格・外部校正曲線、1.3 から 1.5 のセクションで尿試料 50 μ m、360 μ m の外径の内径とコーティングされていないオープン管状石英ポリイミド被覆キャピラリーを使用して離れていると135 cm のキャピラリー長さの合計。メモ: ダイヤモンド カッター工具は、フラッシュ、スムーズなカットを確認する検査がさらに一貫性のある毛細血管を確保するために使用されます。 約 7 mm の遠位キャピラリー、両端からキャピラリー ウィンドウ メーカーを使用してサンプルのキャリー オーバーを減らすために、潜在的なポリイミドが有機溶剤に接触すると膨潤を防止するポリイミド コーティングを削除します。 CE 噴霧器針からキャピラリー出口の約 2 mm 突出して 2 つの 360 ° ターンをループすることによって CE カートリッジのキャピラリーの入口をインストールすることを確認します。慎重に、ce CE カートリッジをインストール、ときに毛細血管をエアコン、イオン源から CE 噴霧器を配置します。注記: 安定したエレクトロ スプレーの MS に結合する場合、電流を確保するために重要ですが一貫して毛細血管のコンセントを切り取る。この作品で使用された 2 つの異なるスプレーヤー: CE 噴霧器を用いてサンプル分析と LC 噴霧器を用いて質量の校正。 イオン源に配置されていない CE スプレーでエアコン毛細管を実行することを確認します。イオン源における LC 噴霧器を置きます。メモ: これは TOF MS に結合されてその後同軸シース液界面の汚染を回避しながら質量校正できます。 ベンダーのソフトウェア計測器を制御し、次の順序で 4 つの異なる溶媒のため 30 分でフラッシュの期間を設定するために使用フラッシュ関数(940 mbar) を選択して新しい毛細血管を条件: メタノール、1 M NaOH、脱イオン水と BGE。キャピラリーをご利用期間中にスタンバイにイソクラティック ポンプを配置することを確認します。 メタノール/H2O 任意の残留塩堆積物を削除するに浸したティッシュで拭きます CE MS 噴霧器を拭いてください。 サンプルを分析する前に CE MS システムの毎日の予防保守を実行します。(入口) CE 電極を拭くが、イソプロパノールを使用し、塩の蓄積を回避し、潜在的なサンプルのキャリー オーバーを制限することが重要である-MS インターフェイスをきれいにする (50: 50) の混合物を水メタノールを使用します。 イオン源から LC 噴霧器を削除し、CE MS の同軸シース液界面で新しくエアコン毛細管の洗浄スプレーを配置します。 イソクラティック ポンプをオンにし、適用電圧 30 kV 15 分尿検査の前に安定した CE の現在のプロファイルが実現されていることを確認します。 CE を使用して注入し、分離の条件 CE パラメーターを設定し、ステップを前処理に計測器を制御するため使用されるベンダー ソフトウェアを開きます。600のフラッシュ機能に設定 s BGE バイアル位置を指定するとします。注: 外部の水チラーは、これはボリューム制限サンプルの大規模なバッチを分析する際にサンプルの蒸発を防ぐために必要な冷却機能、サンプル トレイがない CE システムに接続する必要があります。 流体 5 100 mbar でサンプルを注入する注入機能を設定 s と界面注入 30 BGE スペーサー 75 kV s。注: このプロセスを繰り返します各サンプル注入 (異なるバイアル位置) から合計 11 個別のサンプルの分析のためのソフトウェアのメソッド プログラム内で自動的に実行される (同じバイアル位置) から BGE スペーサーが続くと、同じは MSI 形式を使用する場合を実行します。10 尿サンプルを分析各 MSI CE MS 実行の最初のサンプル位置としてスクリーニングのカットオフで 84 パネル薬剤混合した後ランダムな順序でレベルを注入します。 設定電圧30 kV、カートリッジ温度25 ° C と合計実行時間40 分、時刻表が分離中 2分 mbar の圧力勾配を 0 分から 40 分に適用します。注記: グラデーション圧力を可能にするいくつかの弱く、基本的なベンゾジアゼピン系を含む遅い移行する医薬品及び中性/酸性薬物 (例えばアセトアミノフェン、バルビツール酸塩) の溶出分離中に適用されます。しかし、最も基本的な到来方向及びその代謝物は 25 分、アンフェタミン、オピオイド、アルカロイドの他のクラスなどの陽イオンとして移行します。 次の日まで低圧 (50 mbar) BGE で毛細血管を洗浄するサンプルの収集が完了した後を確認します。600 用キャピラリーをそれ以外の場合、リンス高圧 (900 mbar) 水とし、600 s s の空気、し、次の使用までスプレー ホルダーに格納します。 イソクラティック ポンプと液体をシース シース液 (60 0.1 %v/v ギ酸: 40 MeOH:H2O) を提供するのに CE MS 噴霧器に 10 μ L/分の速度で無限大のイソクラティック ポンプと無限脱を使用します。 TOF MS 設定 TOF MS 同軸シース液エレクトロ スプレー イオン源と加熱窒素ガスは CE 単位装備されていることを確認します。 肯定的なイオン検出質量mのスパンの下で TOF MS を操作/z 50-1,700、データ集録レートを 500 ms/スペクトルの。プロファイルと”.d”ファイル形式でデータが格納されている重心の両方を確認します。 エレクトロ スプレー イオン化条件を設定: 2,000 V で Vcap とノズルの電圧、10 psi でネブライザーガス、乾燥ガス 300 ° C、3.5 L/分 195 ° C でのシース ガス流で 8 L/分で配信さらに、それぞれ 120、65、および 750 V、fragmentor、スキマー、Oct1 RF の MS 電圧設定を設定します。注: Vcap とノズルの電圧としてネブライザーガス オフになっていた MSI-CE-MS の使用シリアル サンプル注入シーケンス中に、エレクトロ スプレー電流を防ぐために電気泳動の分離の開始後 1 分で引き返した予定されていた吸引効果によるエラー。 ベンダーのソフトウェア (資材表) を使用して計測器制御やデータ集録を実行します。 データ分析 処理、データの平滑化、および代表 DoA の抽出したイオン エレクトロフェロ (EIEs) の統合とその代謝物を含むベンダーのソフトウェアを使用して MSI CE MS データを分析します。 ソフトウェアを開き、次のパラメーターを設定します。 クロマト グラム、[抽出データ形式、およびクロマト グラムと質量スペクトル データ形式のプロファイルモードにします。 スムージング機能機能の幅の 15 ポイントを「二次/立方サビツキー ・ ゴーレイを選択します。 統合 (MS)をクリック、するアジャイルインテグレーター、ピーク フィルターの下で最大 11 ピーク制限の最大数が選択されます。 ビューをクリックして、統合ピーク ・ リストをクリックし、ピーク数、保持時間(RT)、ピーク面積、ピーク高さ、および信号対雑音比(SNR) を選択します。 一意のメソッド名の下でこれらのパラメーターを保存します。プロセスにこのメソッドを適用し、各データ セットを解釈します。注: ピーク番号一覧表、RT、ピーク面積、高さ、および SNR が右側に表示されます。測定 RT と統合されたピーク面積を d いずれか対応する到来方向毎のデータ正規化を実行-は (ない場合) または分析の精度を向上させる F Phe に。 3. 尿と外部校正曲線の解析 MSI-CE-MS で使用される異なるシリアル注入構成 薬物異性体/等圧線解像度 (図 1 a) を示すために使用、最初のシリアル サンプル注入構成繰り返される 5 の注射は d と 84 の医薬品基準の混合物に実行されることを確認-は 4-F-ペー/Cl-Tyr に続く 6 回目空白のサンプルは、人工尿、注入と標準的な薬物混合物の 5 つの追加の注射。 知られている処方 (図 2 a)、患者個々 の尿サンプルの到来方向の検出を示すために使用する 2 番目のシリアル サンプルの注入構成で 84 薬標準混合物の混合物である最初のサンプルのプラグインを確認します。患者から無作為化 10 の希釈尿注射続くカットオフ スクリーニング レベル (肯定的な制御) x 1: #293、#88、#309、#43、#281、#64、#221、#208、#183、#50。 単一の実行、外部校正曲線の獲得を説明するために使用される 3 番目のシリアル サンプル注入構成 0.25 に対応する 20 線形ダイナミック レンジで DoA の calibrant ソリューションが準備されていることを確認、倍、1 倍、0.5 x 2.5 x、5 倍の人工尿行列の追加は d は、F-ペー/Cl-チロシンラジカルを一致すると共に、カットオフ濃度 (n = 4)。