Diferenciación eficiente de células madre pluripotentes humanas en células hepáticas
Summary
Este protocolo detalla un método monocapa y libre de suero para generar eficientemente células similares a hepatocitos a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC) en 18 días. Esto implica seis pasos a medida que los hPSCs se diferencian secuencialmente en tipos celulares intermedios como la raya primitiva, el endodermo definitivo, los progenitores posteriores del antebrazo y del brote hepático antes de formar células similares a los hepatocitos.
Abstract
El hígado desintoxica sustancias nocivas, secreta proteínas vitales y ejecuta actividades metabólicas clave, sosteniendo así la vida. En consecuencia, la insuficiencia hepática, que puede ser causada por la ingesta crónica de alcohol, hepatitis, intoxicación aguda u otros insultos, es una afección grave que puede culminar en sangrado, ictericia, coma y eventualmente la muerte. Sin embargo, los enfoques para tratar la insuficiencia hepática, así como los estudios de la función hepática y la enfermedad, se han visto obstaculizados en parte por la falta de un abundante suministro de células hepáticas humanas. Con este fin, este protocolo detalla la diferenciación eficiente de las células madre pluripotentes humanas (hPSC) en células similares a hepatocitos, guiadas por una hoja de ruta de desarrollo que describe cómo se especifica el destino hepático en seis pasos de diferenciación consecutivos. Mediante la manipulación de vías de señalización del desarrollo para promover la diferenciación hepática y suprimir explícitamente la formación de destinos celulares no deseados, este método genera eficientemente poblaciones de progenitores de cogollos hepáticos humanos y células similares a hepatocitos en los días 6 y 18 de diferenciación psC, respectivamente. Esto se logra a través del control temporal-preciso de las vías de señalización del desarrollo, ejercido por pequeñas moléculas y factores de crecimiento en un medio de cultivo libre de suero. La diferenciación en este sistema se produce en monocapas y produce células similares a hepatocitos que expresan enzimas de hepatocitos características y tienen la capacidad de injertar un modelo de ratón de insuficiencia hepática crónica. La capacidad de generar eficientemente un gran número de células hepáticas humanas in vitro tiene ramificaciones para el tratamiento de la insuficiencia hepática, para la detección de drogas, y para estudios mecánicos de enfermedad hepática.
Introduction
El propósito de este protocolo es diferenciar eficientemente las células madre pluripotentes humanas (hPSC) enpoblaciones enriquecidas de progenitores de cogollos hepáticos y células similares a hepatocitos 2. El acceso a un suministro listo de progenitores hepáticos humanos y células similares a hepatocitos acelerará los esfuerzos para investigar la función hepática y la enfermedad y podría permitir nuevas terapias de trasplante celular para la insuficiencia hepática3,4, 5. Esto ha demostrado ser difícil en el pasado ya que los hPSC (que incluyen células madre pluripotentes embrionarias e inducidas) pueden diferenciarse en todos los tipos celulares del cuerpo humano; consecuentemente, ha sido difícil diferenciarlos exclusivamente en una población pura deun solo tipo celular, como las células hepáticas 6.
Para diferenciar con precisión los hPSC en células hepáticas, primero es fundamental entender no sólo cómo se especifican las células hepáticas, sino también cómo se desarrollan los tipos de células no hepáticas. El conocimiento de cómo se desarrollan las células no hepáticas es importante para suprimir lógicamente la formación de linajes no hepáticos durante la diferenciación, guiando así exclusivamente a los hPSC hacia un destino hepático2. En segundo lugar, es esencial delinear los múltiples pasos de desarrollo a través de los cuales los hPSCs se diferencian hacia un destino hepático. Se sabe que los hPSC s diferencian secuencialmente en múltiples tipos de células conocidas como la raya primitiva (APS), el endoderm definitivo (DE), el anteegut posterior (PFG) y los progenitores de los cogollos hepáticos (LB) antes de formar células similares a hepatocitos (HEP). Trabajos anteriores revelaron las señales que especificaban el destino hepático y las señales que suprimieron la formación de tipos alternativos de células no hepáticas (incluidos los progenitores estomacales, pancreáticos e intestinales) en cada opción de linaje del desarrollo2, 7 , 8.
Colectivamente, estos conocimientos han dado lugar a un método monocapa libre de suero para diferenciar los hPSC hacia la racha primitiva, endoderm definitivo, la proegut posterior, los progenitores de los cogollos hepáticos y, por último, las células similares a los hepatocitos2. En general, el método consiste en la sembración de hPSCs en monocapa a una densidad adecuada, preparando seis cócteles de medios de diferenciación (que contienen factores de crecimiento y moléculas pequeñas que regulan diversas vías de señalización del desarrollo), y consecuentemente añadiendo estos medios para inducir la diferenciación en el transcurso de 18 días. Durante el proceso, no se necesita pasar las células. Cabe destacar que este método incluye explícitamente señales que suprimen la formación de tipos de células no hepáticas, este enfoque de diferenciación1 genera de manera más eficiente progenitores hepáticos y células similares a hepatocitos en comparación con los existentes métodos de diferenciación2,9,10,11,12. Además, el protocolo descrito en este texto permite la generación más rápida de hepatocitos que, enúltima instancia, expresan niveles más altos de factores y enzimas de transcripción hepática que los producidos por otros protocolos 9,10 , 11 , 12.
El protocolo descrito aquí tiene ciertas ventajas sobre los protocolos de diferenciación actuales. En primer lugar, implica la diferenciación monocapa de los hPSC, que es técnicamente más simple en comparación con los métodos de diferenciación tridimensional, como los que se basan en cuerpos embrionarios13. En segundo lugar, este método aprovecha un avance reciente mediante el cual las células de endodermo definitivas(un precursor temprano de las células hepáticas) pueden generarse de manera eficiente y rápida dentro de los 2 días posteriores a la diferenciación de hPSC 2,7, permitiendo así la posterior producción de hepatocitos con mayor pureza. En tercer lugar, en comparaciones en paralelo, las células similares a los hepatocitos producidas por este método2 producen más ALBUMIN y expresan niveles más altos de factores de transcripción hepática y enzimas en comparación con los hepatocitos producidos en otros métodos10, 11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método permite la generación de poblaciones enriquecidas de progenitores de cogollos de cogollos hepáticos, y posteriormente células similares a hepatocitos, a partir de hPSCs. La capacidad de generar poblaciones enriquecidas de células hepáticas humanas es importante para la utilización práctica de dichas células. Los métodos anteriores para generar hepatocitos a partir de hPSC produjeron poblaciones de células impuras que contenían células hepáticas y no hepáticas que, al transplantarse en roedores,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Bing Lim por las discusiones y al Instituto Stanford de Biología de Células Madre y Medicina Regenerativa por el apoyo a la infraestructura. Este trabajo fue apoyado por el Instituto de Medicina Regenerativa de California (DISC2-10679) y el Stanford-UC Berkeley Siebel Stem Cell Institute (a L.T.A. y K.M.L.) y el Stanford Beckman Center for Molecular and Genetic Medicine, así como el Anonymous, Familias Baxter y DiGenova (a K.M.L.).
Materials
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
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