Differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane nelle cellule del fegato
Summary
Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo monostrato e privo di siero-per generare in modo efficiente cellule simili a epatociti da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in 18 giorni. Ciò comporta sei passaggi in quanto gli hPSC si differenziano in sequenza in tipi di cellule intermedie come la striscia primitiva, l’endoderma definitivo, il foregut posteriore e i progenitori del germoglio epatico prima di formare cellule simili a epatociti.
Abstract
Il fegato disintossica le sostanze nocive, secerne proteine vitali ed esegue attività metaboliche chiave, sostenendo così la vita. Di conseguenza, l’insufficienza epatica, che può essere causata dall’assunzione cronica di alcol, dall’epatite, dall’avvelenamento acuto o da altri insulti, è una condizione grave che può culminare nel sanguinamento, nell’itterizia, nel coma e infine nella morte. Tuttavia, approcci per trattare l’insufficienza epatica, così come gli studi di funzione epatica e malattia, sono stati ostacolati in parte dalla mancanza di un abbondante apporto di cellule epatiche umane. A tal fine, questo protocollo descrive in dettaglio l’efficiente differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in cellule simili agli eatociti, guidate da una roadmap di sviluppo che descrive come il destino del fegato è specificato attraverso sei fasi di differenziazione consecutive. Manipolando i percorsi di segnalazione dello sviluppo per promuovere la differenziazione del fegato e per sopprimere esplicitamente la formazione di destini cellulari indesiderati, questo metodo genera in modo efficiente popolazioni di progenitori di germogli di fegato umani e cellule simili a epatociti entro i giorni 6 e 18 della differenziazione PSC, rispettivamente. Ciò si ottiene attraverso il controllo temporale preciso dei percorsi di segnalazione dello sviluppo, esercitati da piccole molecole e fattori di crescita in un mezzo di coltura senza siero. La differenziazione in questo sistema si verifica nei monostrati e produce cellule simili a epatociti che esprimono enzimi epaticiti caratteristici e hanno la capacità di innestare un modello murino di insufficienza epatica cronica. La capacità di generare in modo efficiente un gran numero di cellule epatiche umane in vitro ha ramificazioni per il trattamento dell’insufficienza epatica, per lo screening farmacologico e per gli studi meccanicistici delle malattie epatiche.
Introduction
Lo scopo di questo protocollo è quello di differenziare in modo efficiente le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) in popolazioni arricchite di progenitori di gemme del fegato e cellule simili a epatociti2. L’accesso a una fornitura pronta di progenitori epatici umani e cellule simili a epatociti accelererà gli sforzi per indagare sulla funzione epatica e sulla malattia e potrebbe consentire nuove terapie di trapianto di cellule per l’insufficienza epatica3,4, 5. Ciò si è dimostrato impegnativo in passato poiché gli hPSC (che includono cellule staminali pluripotenti embrionali e indotte) possono differenziarsi in tutti i tipi di cellule del corpo umano; di conseguenza, è stato difficile differenziarli esclusivamente in una popolazione pura di un tipo a singola cellula, come le cellule epatiche6.
Per differenziare con precisione gli hPSC in cellule epatiche, in primo luogo è fondamentale capire non solo come vengono specificate le cellule epatiche, ma anche come si sviluppano i tipi di cellule non epatiche. La conoscenza di come si sviluppano le cellule non epatiche è importante per sopprimere logicamente la formazione di lignaggi non epatici durante la differenziazione, guidando così esclusivamente hPSC verso un destino epatico2. In secondo luogo, è essenziale delineare i molteplici passaggi di sviluppo attraverso i quali gli hPSCs si differenziano verso un destino epatico. È noto che gli hPSC si differenziano in sequenza in più tipi di cellule note come striscia primitiva (APS), endodermi definitivo (DE), foregut posteriore (PFG) e progenitori di gemme epatiche (LB) prima di formare cellule simili a epatociti (HEP). I lavori precedenti hanno rivelato i segnali che specificano il destino del fegato e i segnali che sopprimevano la formazione di tipi alternativi di cellule non epatiche (compresi i progenitori di stomaco, pancreatici e intestinali) ad ogni scelta di lignaggio dello sviluppo2, 7 (in questo stato , 8.
Collettivamente, queste intuizioni hanno dato origine a un metodo monostrato privo di siero per differenziare gli hPSC verso la striscia primitiva, l’endoderma definitivo, il foregut posteriore, i progenitori delle gemme del fegato e, infine, le cellule simili a epatociti2. Nel complesso il metodo prevede la seeding di hPSC in un monostrato ad una densità appropriata, preparando sei cocktail di supporti di differenziazione (contenenti fattori di crescita e piccole molecole che regolano varie vie di segnalazione dello sviluppo), e l’aggiunta sequenziale di questi mezzi di comunicazione per indurre la differenziazione nel corso di 18 giorni. Durante il processo, non è necessario passare le cellule. Da notare, poiché questo metodo include esplicitamente segnali che sopprimono la formazione di tipi di cellule non epatiche, questo approccio di differenziazione1 genera in modo più efficiente progenitori epatici e cellule simili a epatociti rispetto a quelli esistenti metodi di differenziazione2,9,10,11,12. Inoltre, il protocollo descritto in questo testo consente la generazione più rapida di epatociti che in ultima analisi esprimono livelli più elevati di fattori ed enzimi di trascrizione epatica rispetto a quelli prodotti da altri protocolli9,10 , 11 Del sistema di , 12.
Il protocollo qui descritto presenta alcuni vantaggi rispetto agli attuali protocolli di differenziazione. In primo luogo, comporta la differenziazione del monostrato degli hPSC, che è tecnicamente più semplice rispetto ai metodi di differenziazione tridimensionali, come quelli che si basano su corpi embrionali13. In secondo luogo, questo metodo sfrutta un recente progresso in base al quale le cellule endodermiche definitive (un precursore precoce delle cellule epatiche) possono essere generate in modo efficiente e rapido entro 2 giorni dalla differenziazione hPSC2,7, consentendo così la successiva produzione di epatociti con maggiore purezza. In terzo luogo, nei confronti affiancati, le cellule simili agli epatociti prodotte da questo metodo2 producono più ALBUMIN ed esprimono livelli più elevati di fattori di trascrizione epatica ed enzimi rispetto agli epatociti prodotti in altri metodi10, 11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo metodo consente la generazione di popolazioni arricchite di progenitori di germogli di fegato, e successivamente cellule simili a epatociti, da hPSCs. La capacità di generare popolazioni arricchite di cellule epatiche umane è importante per l’utilizzo pratico di tali cellule. I metodi precedenti per generare epatociti da hPSC hanno prodotto popolazioni di cellule impure contenenti cellule epatiche e non epatiche che, dopo il trapianto in roditori, hanno prodotto ossa e cartilagine oltre al tessuto epatico<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Bing Lim per le discussioni e lo Stanford Institute for Stem Cell Biology & Regenerative Medicine per il supporto infrastrutturale. Questo lavoro è stato sostenuto dal California Institute for Regenerative Medicine (DISC2-10679) e dallo Stanford-UC Berkeley Siebel Stem Cell Institute (a L.T.A. e K.M.L.) e dallo Stanford Beckman Center for Molecular and Genetic Medicine, nonché dall’Anonymous, baxter e DiGenova (a K.M.L.).
Materials
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
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