יעיל הבידול של תאים האדם Pluriפוטנטי לתוך תאי הכבד
Summary
פרוטוקול זה מפרט מונאולייר, שיטה נטולת סרום להפקת ביעילות תאים של hepatocyte מתאי גזע בעלי עוצמה מרבית (hPSCs) בתוך 18 ימים. זה כרוך שישה שלבים כמו hPSCs ברציפות להבדיל לתוך תא ביניים-סוגים כגון הרצף הפרימיטיבי, אנדופעיים מוחלט, האחורי הקדמי ואת ניצן הכבד ושלתי לפני היווצרות תאים hepatocyte כמו.
Abstract
הכבד מטהר חומרים מזיקים, מפריש חלבונים חיוניים, ומבצע פעילויות מטבולית מפתח, ובכך לקיים חיים. כתוצאה מכך, אי ספיקת כבד-אשר יכול להיגרם על ידי צריכת אלכוהול כרונית, צהבת, הרעלה חריפה, או עלבונות אחרים-הוא מצב חמור שיכול להגיע לדימום, צהבת, תרדמת, ובסופו של דבר מוות. עם זאת, גישות לטיפול בכישלון בכבד, כמו גם מחקרים של תפקוד הכבד ומחלות, היו מעטים בחלקם על ידי חוסר אספקה בשפע של תאי הכבד האנושיים. למטרה זו, פרוטוקול זה מפרט את הבידול היעיל של תאי גזע בעלי עוצמה אנושית (hPSCs) לתוך תאים של hepatocyte, מונחה על ידי מפת דרכים התפתחותית המתארת כיצד מצוין גורל הכבד על פני שישה צעדי בידול רצופים. על ידי מניפולציה מסלולים התפתחותיים איתות כדי לקדם בידול הכבד, כדי לדכא במפורש את היווצרות של גורלות תא בלתי רצויים, שיטה זו מפיקה ביעילות אוכלוסיות של ושלתי הכבד האנושי ניצן ו hepatocyte-תאים כמו יום 6 ו -18 של PSC בידול, בהתאמה. הדבר מושג באמצעות שליטה מדויקת באופן זמני של משעולים אותות התפתחותיים, המופעל על ידי מולקולות קטנות וגורמי גדילה במדיום תרבות ללא סרום. הבידול במערכת זו מתרחשת במונאולאיירס ומניב תאים הירופציט המבטאים אנזימים מאפיינים מאופיינים ובעלי יכולת לעבור מודל עכבר של אי ספיקת כבד כרונית. היכולת לייצר ביעילות מספר גדול של תאי כבד אנושיים בתוך מבחנה יש השלכות לטיפול בכשל בכבד, לסינון תרופות, ולמחקרים מכניסטיים של מחלות כבד.
Introduction
המטרה של פרוטוקול זה היא להבדיל ביעילות בתאי גזע בעלי עוצמה אנושית (hPSCs) לתוך אוכלוסיות מועשר של הכבד ניצן ושלתי ו hepatocyte תאים2. גישה לאספקת מוכן של הכבד האנושי ושלתי ו hepatocyte תאים להאיץ את המאמצים לחקור את תפקוד הכבד ואת המחלות יכול לאפשר טיפולים חדשים השתלת תאים לכשל בכבד3,4, 5. המשך זה הוכיח מאתגרת בעבר מאז hPSCs (אשר כוללים מעובריים והמושרה תאים גזע pluripotent יכול להבדיל לכל תא-סוגי הגוף האנושי; כתוצאה מכך, היה קשה להבדיל באופן בלעדי לאוכלוסיה טהורה של סוג תא אחד, כגון תאי כבד6.
כדי להבדיל בדיוק hPSCs לתוך תאי הכבד, הראשון הוא קריטי להבין לא רק איך תאי הכבד מצוינים אלא גם איך התאים שאינם בתוך הכבד להתפתח. הידע של איך לפתח את התאים שאינם בכבד חשוב לדכא באופן הגיוני את היווצרות של שאינם בכבד במהלך הבידול, ובכך בלעדית המנחה hPSCs לעבר גורל הכבד2. שנית, חיוני להתוות את הצעדים ההתפתחותיים שדרכם hPSCs להבדיל לקראת גורל כבד. ידוע כי hPSCs ברציפות להבדיל לתוך תא מרובים סוגים הידועים כרצף פרימיטיבי (APS), אנדופפיל מוחלט (DE), האחורי הקדמי (PFG) ואת הכבד ניצן ושלתי (LB) לפני יצירת התאים האלה כמו החציט (הפטיטיס). בתחילת העבודה חשף את האותות המציינים את גורל הכבד ואת האותות שדיכא את היווצרות של התאים החלופיים שאינם בכבד (כולל הקיבה, הלבלב, ואת המעיים ושלתי) בכל בחירה התפתחותית השושלת2, מיכל סבן , שמונה.
באופן קולקטיבי, תובנות אלה העניק עלייה ללא סרום, שיטה מונאולייר להבדיל hPSCs לכיוון הרצף הפרימיטיבי, אנדופעור מוחלט, האחורי הקדמי, הכבד ניצן ושלתי ולבסוף, hepatocyte כמו תאים2. באופן כללי השיטה כרוכה בזריעת hPSCs במונאולייר בצפיפות מתאימה, הכנת שישה קוקטיילים של בידול מדיה (המכיל גורמי גדילה ומולקולות קטנות המתוסתים שיטות איתות התפתחותיות שונות), ו ברציפות הוספת מדיה אלה כדי לגרום לבידול במהלך 18 ימים. במהלך התהליך, אין צורך בשלב ההתיישנות של תאים. של הערה, כי שיטה זו כוללת במפורש אותות לדכא את היווצרות סוגי תאים שאינם של הכבד, גישה זו בידול1 ביתר יעילות יוצר ושלתי כבד ותאים hepatocyte בהשוואה למצב הנמצא בידול שיטות2,9,10,11,12. יתר על כן, הפרוטוקול המתואר בטקסט זה מאפשר את הדור מהר יותר של hepatocytes כי בסופו של דבר לבטא רמות גבוהות יותר של מקדמי שעתוק הכבד ואנזימים מאלה המיוצרים על ידי פרוטוקולים אחרים9,10 , מיכל בן 11 , . שתיים עשרה
לפרוטוקול המתואר כאן יש יתרונות מסוימים בנוגע לפרוטוקולי הבידול הנוכחיים. ראשית, היא כרוכה בבידול מונאולייר של hPSCs, שהוא מבחינה טכנית פשוטה יותר לעומת שיטות בידול תלת ממדיות, כגון אלה המסתמכים על גופים embryoid13. שנית, שיטה זו מנצלת מראש לאחרונה לפיה התאים הניתנים לעור מוחלט (מקודמן מוקדם לתאי הכבד) יכול להיות ביעילות ובמהירות שנוצר בתוך 2 ימים של hpsc בידול2,7, ובכך מאפשר את הבאים ייצור הפטוציטים בטוהר מוגבר. שלישית, בהשוואות זה לצד זה, התאים האחרים המיוצרים על-ידי שיטה זו2 יוצרים אלבומין נוסף ומבטאים רמות גבוהות יותר של גורמי שעתוק בכבד ואנזימים לעומת hepatocyte המיוצרים בשיטות אחרות10, 11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטה זו מאפשרת את הדור של אוכלוסיות מועשר של ושלתי הכבד ניצן, ולאחר מכן התאים של hepatocyte, מ hPSCs. היכולת ליצור אוכלוסיות מועשר של תאי כבד אנושיים חשובה לניצול מעשי של תאים כאלה. השיטות הקודמות להפקת hepatocytes מ hPSCs הניבו אוכלוסיות תאים טמא המכיל הן הכבד והן תאים שאינם בכבד, על השתלת לתוך מכרסמים, הנ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים בינג Lim לדיונים ומכון סטנפורד עבור ביולוגיה של תאי גזע & רפואה רגנרטיבית לתמיכה בתשתיות. עבודה זו נתמכת על ידי המכון הקליפורני לרפואה רגנרטיבית (DISC2-10679) ואת סטנפורד-UC ברקלי מכון תאי גזע של המכון (ל L.T.A. ו K.M.L.) ואת סטנפורד בקמן המרכז לרפואה מולקולרית וגנטית, כמו גם אנונימי, משפחות בקסטר ודיג’נובה (ל-K.M.L.).
Materials
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
References
- Bernal, W., Wendon, J. Acute Liver Failure. New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Fisher, R. A., Strom, S. C. Human Hepatocyte Transplantation: Worldwide Results. Transplantation. 82, 441-449 (2006).
- Dhawan, A. Clinical human hepatocyte transplantation: Current status and challenges. Liver transplantation. 21, S39-S44 (2015).
- Salama, H., et al. Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in 48 Patients with End-Stage Chronic Liver Diseases. Cell Transplantation. 19, 1475-1486 (2017).
- Tan, A. K. Y., Loh, K. M., Ang, L. T. Evaluating the regenerative potential and functionality of human liver cells in mice. Differentiation. 98, 25-34 (2017).
- Loh, K. M., et al. Efficient Endoderm Induction from Human Pluripotent Stem Cells by Logically Directing Signals Controlling Lineage Bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
- Zhao, D., et al. Promotion of the efficient metabolic maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes by correcting specification defects. Cell Research. 23, 157-161 (2012).
- Si Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 297-305 (2010).
- Carpentier, A., et al. Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screen. Stem Cell Research. 16, 640-650 (2016).
- Avior, Y., et al. Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes. Hepatology. 62, 265-278 (2015).
- Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
- Rostovskaya, M., Bredenkamp, N., Smith, A. Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370, 20140365 (2015).
- Haridass, D., et al. Repopulation Efficiencies of Adult Hepatocytes, Fetal Liver Progenitor Cells, and Embryonic Stem Cell-Derived Hepatic Cells in Albumin-Promoter-Enhancer Urokinase-Type Plasminogen Activator Mice. The American Journal of Pathology. 175, 1483-1492 (2009).
