Différenciation efficace des cellules souches pluripotentes humaines en cellules hépatiques
Summary
Ce protocole détaille une méthode monocouche, sans sérum, pour générer efficacement des cellules hépatocytes à partir de cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) en 18 jours. Cela implique six étapes que les hPSC se différencient séquentiellement en types de cellules intermédiaires tels que la strie primitive, endoderm définitif, prégut postérieur et progéniteurs de bourgeons hépatiques avant de former des cellules hépatocytes.
Abstract
Le foie détoxifie les substances nocives, sécrète des protéines vitales et exécute des activités métaboliques clés, soutenant ainsi la vie. Par conséquent, l’insuffisance hépatique, qui peut être causée par une consommation chronique d’alcool, une hépatite, un empoisonnement aigu ou d’autres insultes, est une affection grave qui peut entraîner des saignements, une jaunisse, un coma et, éventuellement, la mort. Cependant, les approches pour traiter l’échec de foie, aussi bien que des études de la fonction et de la maladie de foie, ont été bloquées en partie par l’absence d’un approvisionnement abondant des cellules humaines de foie. À cette fin, ce protocole détaille la différenciation efficace des cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) en cellules hépatocytes, guidée par une feuille de route développementale qui décrit comment le destin du foie est spécifié à travers six étapes consécutives de différenciation. En manipulant les voies de signalisation développementale pour favoriser la différenciation du foie et pour supprimer explicitement la formation de destins cellulaires indésirables, cette méthode génère efficacement des populations d’ancêtres de bourgeons hépatiques humains et de cellules hépatocytes par les jours 6 et 18 de la différenciation de la CFP, respectivement. Ceci est réalisé par le contrôle temporel-précis des voies de signalisation développementale, exercé par de petites molécules et des facteurs de croissance dans un milieu de culture sans sérum. La différenciation dans ce système se produit dans les monocouches et donne des cellules hépatocyte-comme qui expriment les enzymes caractéristiques d’hépatocyte et ont la capacité d’engraft un modèle de souris de l’échec chronique de foie. La capacité de générer efficacement un grand nombre de cellules hépatiques humaines in vitro a des ramifications pour le traitement de l’insuffisance hépatique, pour le dépistage des médicaments, et pour les études mécanistes de la maladie du foie.
Introduction
Le but de ce protocole est de différencier efficacement les cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) en populations enrichies d’ancêtres de bourgeons hépatiques et de cellules hépatocytes2. L’accès à un approvisionnement prêt des progéniteurs humains de foie et des cellules hépatocyte-comme accélérera des efforts pour étudier la fonction et la maladie hépatiques et pourrait permettre de nouvelles thérapies cellulaires de transplantation pour l’échecde foie 3,4, 5. Cela s’est avéré difficile dans le passé depuis hPSCs (qui comprennent les cellules souches embryonnaires et induites pluripotentes) peut se différencier en tous les types cellulaires du corps humain; par conséquent, il a été difficile de les différencier exclusivement en une population pure d’un seul type cellulaire, comme les cellules hépatiques6.
Pour différencier précisément les hPSC en cellules hépatiques, il est d’abord essentiel de comprendre non seulement comment les cellules hépatiques sont spécifiées, mais aussi comment les types de cellules non hépatiques se développent. La connaissance de la façon dont les cellules non hépatiques se développent est importante pour supprimer logiquement la formation de lignées non hépatiques pendant la différenciation, guidant ainsi exclusivement les hPSC vers un destin de foie2. Deuxièmement, il est essentiel de délimiter les multiples étapes de développement par lesquelles les HPSC se différencient vers un destin de foie. On sait que les hPSC se différencient séquentiellement en plusieurs types de cellules connus sous le nom de strie primitive (APS), endoderm définitif (DE), foregut postérieur (PFG) et progéniteurs de bourgeons hépatiques (LB) avant de former des cellules hépatocytes (HEP). Des travaux antérieurs ont révélé les signaux spécifiant le destin du foie et les signaux qui ont supprimé la formation de différents types de cellules non hépatiques (y compris les progéniteurs de l’estomac, du pancréas et de l’intestin) à chaque choix de lignée développementale2, 7 Annonces , 8.
Collectivement, ces idées ont donné lieu à une méthode monocouche sans sérum pour différencier les hPSC s’orientent vers les stries primitives, l’endoderm définitif, le foregut postérieur, les progéniteurs de bourgeons hépatiques et enfin, les cellules hépatocytes2. Dans l’ensemble, la méthode consiste à ensemencer des hPSC dans une monocouche à une densité appropriée, à préparer six cocktails de médias de différenciation (contenant des facteurs de croissance et de petites molécules qui régulent diverses voies de signalisation du développement), et séquentiellement l’ajout de ces médias pour induire la différenciation au cours de 18 jours. Pendant le processus, aucun passage des cellules n’est nécessaire. Il convient de noter, parce que cette méthode comprend explicitement des signaux qui suppriment la formation de non-foie cell-types, cette approche de différenciation1 génère plus efficacement progéniteurs du foie et les cellules hépatocytes-like par rapport à existant méthodes de différenciation2,9,10,11,12. En outre, le protocole décrit dans ce texte permet la génération plus rapide d’hépatocytes qui expriment finalement des niveaux plus élevés de facteurs et d’enzymes de transcription hépatique que ceux produits par d’autres protocoles9,10 , 11 Ans, états-unis ( , 12.
Le protocole décrit ici présente certains avantages par rapport aux protocoles actuels de différenciation. Tout d’abord, il implique la différenciation monocouche des hPSC, ce qui est techniquement plus simple par rapport aux méthodes de différenciation tridimensionnelle, telles que celles qui reposent sur des corps embryonnaires13. Deuxièmement, cette méthode exploite une avancée récente par laquelle les cellules endoderm définitives (un précurseur précoce des cellules hépatiques) peuvent être générées efficacement et rapidement dans les 2 jours suivant la différenciation hPSC2,7, permettant ainsi la suite production d’hépatocytes avec une pureté accrue. Troisièmement, dans les comparaisons côte à côte, les cellules hépatocytes produites par cette méthode2 produisent plus d’ALBUMIN et expriment des niveaux plus élevés de facteurs et d’enzymes de transcription hépatique comparés aux hépatocytes produits dans d’autres méthodes10, 11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette méthode permet la génération de populations enrichies d’ancêtres de bourgeons hépatiques, puis de cellules semblables à des hépatocytes, à partir de hPSC. La capacité de générer des populations enrichies de cellules hépatiques humaines est importante pour l’utilisation pratique de ces cellules. Les méthodes précédentes pour produire des hépatocytes à partir des hPSCont ont donné des populations impures de cellules contenant des cellules de foie et non-foie qui, sur la transplantation dans des rong…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Bing Lim pour ses discussions et le Stanford Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine pour le soutien de l’infrastructure. Ce travail a été soutenu par le California Institute for Regenerative Medicine (DISC2-10679) et le Stanford-UC Berkeley Siebel Stem Cell Institute (à L.T.A. et K.M.L.) et le Stanford Beckman Center for Molecular and Genetic Medicine ainsi que les Anonymous, Familles Baxter et DiGenova (à K.M.L.).
Materials
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
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