التمايز الفعال للخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى في خلايا الكبد
Summary
يفصّل هذا البروتوكول طريقة أحادية الطبقة وخالية من المصل لتوليد خلايا شبيهة بخلايا الكبد بكفاءة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى (hPSCs) في غضون 18 يومًا. وهذا ينطوي على ست خطوات كما hPSCs تميز بالتتابع إلى أنواع الخلايا المتوسطة مثل خط البدائية, endoderm النهائي, القلفة الخلفية وذرية برعم الكبد قبل تشكيل الخلايا الشبيهة بالكبد.
Abstract
يزيل الكبد السموم من المواد الضارة، ويفرز البروتينات الحيوية، وينفذ الأنشطة الأيضية الرئيسية، وبالتالي الحفاظ على الحياة. وبالتالي، فإن فشل الكبد – الذي يمكن أن ينجم عن تناول الكحول المزمن، والتهاب الكبد، والتسمم الحاد، أو غيرها من الإهانات – هو حالة خطيرة يمكن أن تتوج بالنزيف واليرقان والغيبوبة والموت في نهاية المطاف. ومع ذلك, وقد أحبطت نُهج لعلاج فشل الكبد, فضلا عن دراسات وظائف الكبد والمرض, جزئيا بسبب عدم وجود إمدادات وفيرة من خلايا الكبد البشرية. ولهذا الغرض، يفصّل هذا البروتوكول التمايز الفعال للخلايا الجذعية البشرية المتعددة القوى (hPSCs) في الخلايا الشبيهة بخلايا الكبد، مسترشدة بخارطة طريق تنموية تصف كيفية تحديد مصير الكبد عبر ست خطوات تمايز متتالية. من خلال التلاعب مسارات الإشارات التنموية لتعزيز تمايز الكبد وقمع تشكيل مصائر الخلايا غير المرغوب فيها بشكل صريح، تولد هذه الطريقة بكفاءة مجموعات من الذرية برعم الكبد البشري والخلايا الشبيهة بالكبد بحلول أيام 6 و18 من التمايز PSC، على التوالي. ويتحقق ذلك من خلال التحكم الدقيق زمنياً في مسارات الإشارات التنموية، التي تمارسها الجزيئات الصغيرة وعوامل النمو في وسط ثقافة خالية من المصل. التمايز في هذا النظام يحدث في الطبقات الأحادية وينتج الخلايا الشبيهة بخلايا الكبد التي تعبر عن إنزيمات خلايا الكبد المميزة ولها القدرة على تطعيم نموذج الماوس من فشل الكبد المزمن. القدرة على توليد بكفاءة أعداد كبيرة من خلايا الكبد البشرية في المختبر له تداعيات لعلاج فشل الكبد، لفحص المخدرات، وللدراسات الميكانيكية لأمراض الكبد.
Introduction
الغرض من هذا البروتوكول هو التمييز بكفاءة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى (hPSCs) في السكان المخصب من الذرية برعم الكبد والخلايا الشبيهة بخلايا الكبد2. الوصول إلى إمدادات جاهزة من الذرية الكبد البشري والخلايا الشبيهة بخلايا الكبد تسريع الجهود للتحقيق في وظائف الكبد والمرض ويمكن تمكين علاجات زرع الخلوية الجديدة لفشل الكبد3،4، 5. وقد ثبت أن هذا الأمر ينطوي على تحديات في الماضي لأن الـ hPSCs (التي تشمل الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثة متعددة القوى) يمكن أن تفرق في جميع أنواع الخلايا في جسم الإنسان؛ وبالتالي، كان من الصعب تمييزها حصرا إلى مجموعة نقية من نوع خلية واحدة، مثل خلايا الكبد6.
للتمييز الدقيق hPSCs في خلايا الكبد, أولاً من المهم أن نفهم ليس فقط كيف يتم تحديد خلايا الكبد ولكن أيضا كيف تتطور أنواع الخلايا غير الكبد. معرفة كيفية تطور الخلايا غير الكبدية من المهم أن تقمع منطقيا تشكيل السلالات غير الكبد ية أثناء التمايز، وبالتالي توجيه حصرا hPSCs نحو مصير الكبد2. ثانياً، من الضروري تحديد الخطوات التنموية المتعددة التي تميز من خلالها المراكز hPSCs نحو مصير الكبد. ومن المعروف أن hPSCs تميز بالتتابع إلى أنواع متعددة من الخلايا المعروفة باسم خط البدائية (APS)، endoderm النهائي (DE)، القلفة الخلفية (PFG) وذرية برعم الكبد (LB) قبل تشكيل الخلايا الشبيهة بالخلايا الكبدية (HEP). كشف العمل في وقت سابق عن إشارات تحدد مصير الكبد والإشارات التي قمعت تشكيل أنواع الخلايا البديلة غير الكبد (بمافي ذلك المعدة والبنكرياس والذرية المعوية) في كل اختيار النسب التنموي2، 7 , 8.
وبشكل جماعي، أدت هذه الرؤى إلى طريقة أحادية الطبقة خالية من المصل للتمييز بين hPSCs نحو خط بدائي، بطانة الجلد النهائي، القلفة الخلفية، الذرية برعم الكبد وأخيرا، الخلايا الشبيهة بالخلايا الكبدية2. وبشكل عام، تنطوي الطريقة على بذر الـ hPSCs في طبقة أحادية الكثافة، وإعداد ستة كوكتيلات من وسائط التمايز (التي تحتوي على عوامل نمو وجزيئات صغيرة تنظم مختلف مسارات الإشارات التنموية)، إضافة هذه الوسائط بالتتابع للحث على التمييز على مدى 18 يوما. خلال هذه العملية، لا حاجة إلى تمرير الخلايا. من الجدير بالذكر، لأن هذه الطريقة تشمل صراحة الإشارات التي تقمع تشكيل أنواع الخلايا غير الكبدية، وهذا النهج التمايز1 أكثر كفاءة يولد الذرية الكبد والخلايا الشبيهة بالخلايا الكبدية بالمقارنة مع الموجودة طرقالتمايز 2،9،10،11،12. وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكول الموصوف في هذا النص يتيح الجيل الأسرع من خلايا الكبد التي تعبر في نهاية المطاف عن مستويات أعلى من عوامل النسخ الكبدي والانزيمات من تلك التي تنتجها بروتوكولات أخرى9،10 , 11 , 12.
البروتوكول الموضح هنا له مزايا معينة على بروتوكولات التمايز الحالية. أولاً، ينطوي على تمايز أحادي الطبقة بين hPSCs، وهو أبسط من الناحية الفنية مقارنة بأساليب التمايز ثلاثية الأبعاد، مثل تلك التي تعتمد على الأجسام الجنينية13. ثانيا، يستغل هذا الأسلوب تقدما في الآونة الأخيرة حيث خلايا endoderm النهائي (مقدمة مبكرة لخلايا الكبد) يمكن أن تولد بكفاءة وسرعة في غضون 2 أيام من التمايز hPSC2،7، وبالتالي تمكين اللاحقة إنتاج خلايا الكبد مع زيادة النقاء. ثالثا، في مقارنات جنبا إلى جنب، والخلايا الشبيهة بخلايا الكبد التي تنتجها هذه الطريقة2 تنتج المزيد من ALBUMIN والتعبير عن مستويات أعلى من عوامل النسخ الكبدي والانزيمات مقارنة مع خلايا الكبد المنتجة في طرق أخرى10، 11و12 .
Protocol
Representative Results
Discussion
هذه الطريقة تمكن من توليد السكان المخصب من الذرية برعم الكبد، والخلايا الشبيهة بالكبد في وقت لاحق، من hPSCs. القدرة على توليد السكان المخصب من خلايا الكبد البشرية مهم للاستخدام العملي لهذه الخلايا. الطرق السابقة لتوليد خلايا الكبد من hPSCs أسفرت عن مجموعات الخلايا غير النقية التي تحتوي على كل …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر بينغ ليم على المناقشات ومعهد ستانفورد لبيولوجيا الخلايا الجذعية والطب التجديدي لدعم البنية التحتية. وقد دعم هذا العمل معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (DISC2-10679) ومعهد ستانفورد-يو سيبير سيبل للخلايا الجذعية (إلى L.T.A. وK.M.L.) ومركز ستانفورد بيكمان للطب الجزيئي والوراثي وكذلك المجهول، [بإكستر] و [دجنوفا] أسرات (إلى [ك.م.ل.]).
Materials
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
References
- Bernal, W., Wendon, J. Acute Liver Failure. New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Fisher, R. A., Strom, S. C. Human Hepatocyte Transplantation: Worldwide Results. Transplantation. 82, 441-449 (2006).
- Dhawan, A. Clinical human hepatocyte transplantation: Current status and challenges. Liver transplantation. 21, S39-S44 (2015).
- Salama, H., et al. Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in 48 Patients with End-Stage Chronic Liver Diseases. Cell Transplantation. 19, 1475-1486 (2017).
- Tan, A. K. Y., Loh, K. M., Ang, L. T. Evaluating the regenerative potential and functionality of human liver cells in mice. Differentiation. 98, 25-34 (2017).
- Loh, K. M., et al. Efficient Endoderm Induction from Human Pluripotent Stem Cells by Logically Directing Signals Controlling Lineage Bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
- Zhao, D., et al. Promotion of the efficient metabolic maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes by correcting specification defects. Cell Research. 23, 157-161 (2012).
- Si Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 297-305 (2010).
- Carpentier, A., et al. Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screen. Stem Cell Research. 16, 640-650 (2016).
- Avior, Y., et al. Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes. Hepatology. 62, 265-278 (2015).
- Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
- Rostovskaya, M., Bredenkamp, N., Smith, A. Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370, 20140365 (2015).
- Haridass, D., et al. Repopulation Efficiencies of Adult Hepatocytes, Fetal Liver Progenitor Cells, and Embryonic Stem Cell-Derived Hepatic Cells in Albumin-Promoter-Enhancer Urokinase-Type Plasminogen Activator Mice. The American Journal of Pathology. 175, 1483-1492 (2009).
