Primaire cel cultuur van gezuiverde erge of glutamaterge neuronen opgericht door fluorescentie-geactiveerde cel sorteren

Alle procedures en het onderhoud van dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtsnoeren, de Duitse wet op dierenwelzijn en de Europese Raad Richtlijn 86/609/EEG betreffende de bescherming van dieren, in de aanwezigheid van machtigingen van lokale autoriteiten (LaGeSo Berlin, T-0215/11). Opmerking: Dit protocol beschrijft de cultuur van gezuiverde neuronen van een enkele transgene muis of rat pup (postnatale dag 0 – 2). Alle technieken moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd. Alle oplossingen moeten worden gesteriliseerd met behulp van een 0,2 µm filter (Zie tabel van materialen). Glas-dekglaasjes en dissectie gereedschap moet warmte worden gesteriliseerd voor 3 uur bij 185 ° c. 1. coating glas-Dekglaasjes met poly-L-lysine Bereid glas-dekglaasjes door het ontdooien van een 5 mL hoeveelheid 200 µ g/mL poly-L-lysine (PLL) oplossing. Verdun deze voorraad oplossing tot 20 µ g/mL door toevoeging van 45 mL zuivere injectie grade water. Filter-Steriliseer de oplossing in een nieuwe 50 mL conische buis. Label deze buis als “PLL steriel”.Opmerking: Gebruik water opgeslagen bij kamertemperatuur om het ontdooi proces te versnellen. Voeg 100 steriele, ronde, 12 mm glas-dekglaasjes toe aan de steriele PLL-oplossing. Schud de tube om de 5 – 10 min, voor 2 – 3 min, om gelijkmatige coating te garanderen. Bedek de-dekglaasjes op deze manier voor 1 h.Opmerking: De Duits-vervaardigde ronde glas-dekglaasjes (diameter = 12 mm) hebben de voorkeur, aangezien zij een betrouwbare cultuur oppervlakte verstrekken en gemakkelijk in de putten van een 24-goed cel cultuur plaat passen. Na 40 min van PLL coating, neem 2 stukjes tissue papier en leg ze plat in de stroom kast. Steriliseer het papier met behulp van 70% ethanol, dan plat om plooien te verwijderen en te laten drogen. Na het coaten van de glazen-dekglaasjes voor 1 h met PLL, Verwijder overtollige PLL oplossing en voeg steriele injectie grade water. Schud voorzichtig de-dekglaasjes voor 2 – 3 s om het verwijderen van overtollige PLL mogelijk te maken. Herhaal deze spoeling stap 2 extra keer. Verwijder overtollig water, en breng de-dekglaasjes naar de steriele tissue papier. Apart elke dekglaasje met behulp van gebogen Tang en laat drogen.Opmerking: -Dekglaasjes die niet gemakkelijk gescheiden kunnen worden weggegooid. Alternatief, kan een kleine hoeveelheid water worden toegevoegd om scheiding te helpen. Eenmaal droog, breng de-dekglaasjes naar een 24-Well cultuur plaat.Opmerking: -Dekglaasjes moet worden gemaakt klaar ongeveer 30 min-1 uur voor aanvang van de dissectie proces. De platen kunnen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 worden opgeslagen tot vereist. 2. dissociatie van Hippocampale en corticale weefsel Voorbereiding van de Cell Culture Solutions Voor de scheiding van neurale weefsel, eerste defrost een 40 mL hoeveelheid cel cultuur buffer (samenstelling [in mM]: 116 NaCl, 5,4 KCl, 26 NaHCO3, 1,3 Nah2po4, 1 MgSO4· 7H2o, 1 CaCl2· 2H2o, 0,5 EDTA · 2Na · 2H2O en 25 D-glucose, pH = 7,4). Maatregel uit 12 mL van de cel cultuur buffer tot een 15 mL kegelvormige buis; Label als “BSA”. Meet 5 mL cel cultuur buffer naar een andere 15 mL buis; Label als “papaïne”. Incubeer beide buizen in een waterbad voor 15 min bij 37 °C. Filter-Steriliseer de resterende cel cultuur buffer, label als “buffer-steriel” en op te slaan bij 4 ° c tot vereist. Weeg 120 mg van boviene serum albumine (BSA) en voeg toe aan de buis met het label “BSA”. Weeg 7 mg papaïne en voeg toe aan de buis met het label “papaïne”. Breng beide buizen terug naar het waterbad voor 15 minuten.Opmerking: Het is nuttig om een kleine hoeveelheid buffer toe te voegen aan de weeg boot om de overdracht van de papaïne poeder te vergemakkelijken. Zodra alle poeders zijn opgelost, filter-steriliseren elke oplossing om een verse 15 mL conische buis. Voor Tube papaïne, label de gefilterde oplossing als “papaïne-steriel”. Voor buis BSA, verdeel de steriele BSA oplossing in 3 buizen, elk met 4 mL BSA oplossing. Label elke buis als “BSA-steriel” en ofwel “1”, “2” of “3”. Terug alle buizen terug naar het waterbad en blijven incuberen bij 37 ° c tot de vereiste. Voorbereiding voor weefsel dissectie Neem een enkel stuk van 35 mm filtreerpapier (Zie lijst van materialen) en steriliseer met 70% ethylalcohol; laat drogen in het deksel van een 100 mm Petri schaaltje, in een stroom kast. Lay-out van de schaar, Tang, scalpel en spatel (Zie tabel van materialen) die nodig zijn voor de dissectie van de hippocampus en cortex. Plaats 2 35 mm petrischalen en een 100 mm petrischaaltje met steriel filtreerpapier op een toegankelijke plaats in het midden van de stromings kast. Het verzamelen van transgene NexCre; Ai9 en VGAT Venus muis pups die moeten worden ontleed. Gebruik een fluorescentielamp met aangewezen opwindings en emissie filters (Zie lijst van materialen) om fluorescente pups van wilde type nestgenoten te onderscheiden. Onmiddellijk voor het ontleden van dieren, vul elke 35 mm Petri schaaltje met gekoelde, steriele cel cultuur buffer.Opmerking: Een Petri schaaltje is voor het reinigen van de gereedschappen tussen de dissecties, en de andere is voor het verzamelen van de hippocampus en cortex. Weefsel dissectie Zodra de cel cultuur buffer wordt gegoten, onthoofden een postnatale dag 0 – 2 transgene muis of rat pup met behulp van grote, scherpe schaar en gebruik een steriele 100 mm Petri schaaltje om het hoofd over te dragen in de stroom kast. Gebruik een tang, een schaar en een spatel om zorgvuldig de hersenen van een transgene pup naar steriel filtreerpapier over te brengen. Gebruik een scalpel van het type 22 om de kleine hersenen weg te ontleden en de 2 halfronden te scheiden. Gebruik een kleine spatel om de halfronden lateraal rollen. Op elk halfrond, druk zachtjes, zodat de cortex in contact komt met het filterpapier. Voorzichtig bewegen middenhersenen regio’s naar de hippocampus en cortex onthullen.Opmerking: Wees voorzichtig niet te veel druk toe te passen bij het indrukken van de halfronden of cellen kunnen worden verpletterd. Gebruik een scalpel of spatel om de hippocampus en cortex scheiden van elk halfrond. Overdracht van ontleed weefsel naar een 35 mm Petri schaaltje met gekoelde cel cultuur buffer.Opmerking: Als het ontleden van meerdere dieren, op te slaan steriele cel cultuur buffer in een 50 mL kegelvormige buis op ijs. Na elke dissectie, overdracht ontleed weefsel naar de gekoelde cel cultuur buffer. Na succesvolle dissectie van cortico-hippocampale weefsel, breng de steriele papaïne oplossing van het waterbad aan het stroom kabinet over. Gebruik een pipet van 3 mL Pasteur om de ontledene Hippocampus en cortex naar het deksel van een steriel 35 mm Petri schaaltje over te brengen. Hak in een Criss-Cross beweging, met behulp van het platte deel van een type 22 scalpel, totdat het weefsel is in kleine stukjes. Gebruik een kleine hoeveelheid papaïne oplossing om het gehakte weefsel van het deksel van de Petri schaal naar de steriele papaïne buis over te brengen. Breng de papaïne buis naar het waterbad en Incubeer het weefsel bij 37 °C voor 25 min. Tijdens papaïne incubatie, make-up complete fluorescentie media oplossing. Ontdooi een hoeveelheid B27 van 1 mL, een hoeveelheid Glutamax van 0,5 mL en een hoeveelheid pen-keelontsteking van 0,5 mL. Hoeveelheid 48,5 mL slaapstand een lage fluorescentie media naar een 50 mL conische buis. Voeg B27, Glutamax en pen-keelontsteking aan de oplossing. Schud de oplossing goed, dan filter-steriliseren en labelen als “Hibernate een complete media” (met datum en initialen). Incubeer bij 37 °C in een waterbad. Na papaïne incubatie, breng de papaïne-buis en steriele BSA-buizen naar de stroom kast. Gebruik een pipet van 1 mL Pasteur om alleen het cortico-hippocampale weefsel uit de papaïne buis te verwijderen in BSA-Tube 1.Opmerking: Zorg ervoor dat de overdracht van overtollige papaïne oplossing te minimaliseren. Dissociatie van cellen Met het oog op het breken van alle grote bosjes van weefsel, fijnstampen het weefsel meerdere malen met behulp van een 1 mL Pasteur pipet. Na deze, fijnstampen het weefsel 7 keer met behulp van een fijne tip Pasteur pipet. Laat het weefsel te staan voor 30 s, waardoor grotere stukjes weefsel aan sediment. Breng na 30 s de onderste 1 mL oplossing en het weefsel over van BSA-Tube 1 naar BSA-Tube 2. Fijnstampen het weefsel in BSA-Tube 2 meerdere malen met behulp van een fijne tip Pasteur pipet. Na trituration, overdracht opnieuw lagere 1 mL van weefsel en oplossing van BSA-buis 1, maar nu aan BSA-buis 3. Fijnstampen het weefsel in BSA-Tube 3 meerdere malen met behulp van een fijne tip Pasteur pipet. Na trituration, breng alle oplossing en weefsel van buizen 2 en 3 in BSA-buis 1 over. Fijnstampen een verdere 2-3 keer en centrifugeer bij 3.000 x g 3 min. Tijdens de centrifuge, make-up complete neurale basale een media (NBA Media). Hoeveelheid 48,5 mL van de NBA-media naar een 50 mL kegelvormige buis en Incubeer bij 37 °C in een waterbad. Label deze Tube “NBA only”. Bovendien wordt een hoeveelheid van 1 mL B27, een hoeveelheid Glutamax van 0,5 mL en een hoeveelheid pen-ontsteking van 0,5 mL bij kamertemperatuur ontdooid. Na centrifugeren, voorzichtig verwijderen van de bovendrijvende uit de pellets weefsel en opnieuw op te schorten de cellen in 2 mL van de volledige media. Gebruik een P1000 pipet om het weefsel op en neer te fijnstampen 20 keer.Opmerking: Zorg ervoor dat u de cellen niet te krachtig pipet. Als er te veel druk wordt uitgeoefend, kunnen de cellen beschadigd raken. Gebruik een pipet van 1 mL Pasteur om de schorsing van de cel te filteren door middel van een 30 µm cel zeef in een polystyreen monsterbuis.Opmerking: Als de cel schorsing niet onmiddellijk door de cel zeef, kan het nodig zijn om druk op de top van de zeef met een steriele handschoen om de stroom te starten. Deze belangrijke stap voorkomt verstopping van de cel Sorter. Voor het verzamelen van neuronen na het sorteren, voor te bereiden inzameling buizen door pipetten 300 µ L van de volledige media om het vereiste aantal polypropyleen buizen. De cel schorsing is nu klaar om te worden genomen om de cel sorter voor het sorteren. Neem de cel schorsing, extra inzameling buizen en reserveonderdelen volledige media in geval verdunning van het monster is vereist. 3. Cell sorteren van gezuiverd erge of glutamaterge neuronen Opmerking: Om de kans op bacteriële besmetting tijdens het sorteren te minimaliseren spoel het steekproef buizenstelsel van de sorter met 70% ethylalcohol minstens 5 min voorafgaand aan het sorteren af. Gedetailleerde sortering parameters variëren tussen instrumenten, fundamentele overwegingen zijn als volgt. Tijdens de eerste cel sorteren, vast te stellen niveaus van achtergrond fluorescentie van ongelabelde cellen door het sorteren en vergelijken van cellen uit een wild type dier. Voor elk type fluorescerende cel dat moet worden gesorteerd, kiest u de juiste excitatie-en emissie filters. Excite Venus en TdTomato eiwitten met behulp van 488 nm of 531 nm excitatie golflengten, respectievelijk. Detecteren uitgezonden licht door middel van 530/40 en 575/30 emissie filter sets, respectievelijk. Voeg polypropyleen inzamelings buizen toe, die 300 l van volledige media bevatten, aan de cel sorter voor de inzameling van de cel. Voor hoge zuiverheid, sorteren fel gelabeld fluorescerende cellen (Zie Figuur 1b bijvoorbeeld dot percelen van gesorteerde cellen). Na het sorteren, voor optimaal resultaat, voer een zuiverheidstest van de gesorteerde cellen uit om zuiverheidsniveaus te schatten. Merk op dat de typische Recovery rate van cellen na het sorteren is tussen de 70 tot 80%. Noteer het aantal cellen gesorteerd in elke collectie buis. Deze waarde wordt gegeven door het sorteer instrument voor cellen.Opmerking: Cel Sorteren kan worden uitgevoerd met behulp van een 70 µm nozzle (70 psi schede vloeistofdruk) of een 100 µm nozzle (20 psi schede vloeistofdruk). 4. kweken van gesorteerde neuronen Na het sorteren van cellen, de overdracht verzamelde cellen tot 2 mL ronde bodem centrifuge buizen, met behulp van een 1 mL Pasteur pipet. Centrifugeer de cellen bij 3.000 x g voor 3 min om een cel korrel te vormen.Opmerking: Om te helpen bij het identificeren van de locatie van de cel pellet, oriënteren de ronde bodem centrifuge buizen met het scharnier van het deksel naar buiten gericht, waardoor de cel pellet te vormen op de achterkant van de centrifugebuis (dat wil zeggen, aan dezelfde kant van de buis als het scharnier). Bij centrifugeren, voeg 1 mL B27, 0,5 mL Glutamax en 0,5 mL pen-keelontsteking toe aan de 48,5 mL van voorverwarmde NBA-media. Schud de oplossing goed, dan filter steriliseren en label als “NBA complete media” (met datum en initialen). Terug naar het waterbad tot de vereiste. Gebruik na centrifugeren een pipet van 1 mL Pasteur om de bovendrijvende over te brengen naar een andere centrifugebuis (Bewaar de bovendrijvende Incase de cel pellet was verstoord). Re-schorsen van de cel pellet in de vereiste hoeveelheid van de voorverwarmde volledige NBA-media om een cel dichtheid van 1.000 cellen te bereiken/µ L. re-Suspend de cellen door te pipetteren op en neer met een P200 of P1000 pipet. Ter bevestiging van de aanwezigheid van gescheiden cellen, controleer dan de cel oplossing onder een Microscoop, met behulp van een 4x of 10x objectieve lens. Alternatief, Pipetteer een kleine hoeveelheid cel oplossing op een dekglaasje en controleer onder de Microscoop. Als er grote aantallen cellen aanwezig zijn, kan de bovendrijvende van stap 4,3 worden genegeerd. Voor het plating van de cellen, Vortex op een gemiddelde snelheid voor 2 – 3 s om een gelijkmatige cel schorsing te garanderen. Na het vortexen, snel Pipetteer 10 µ L van de cel opschorting aan het centrum van elke dekglaasje. Na het pipetteren van de cellen, snel terug elke plaat naar de incubator (5% CO2/37 ° c) en incuberen voor 1 uur.Opmerking: Als het toevoegen van cellen aan veelvoudige 24-goed platen, verzekert zelfs dichtheid van de cel door cellen tussen platen te vortexen. Na 1 h, voeden de cellen met 500 µ L van voorverwarmde volledige NBA media en terug te keren naar de incubator.Opmerking: Bij het voeden van de cellen, is het belangrijk om de media pipet voorzichtig langs de zijkant van de put te vermijden cel loslating. Voor korte experimenten (< 16 dagen), is het voeden bij de bovengenoemde dichtheid niet noodzakelijk. Bij het plating van een grotere dichtheid van cellen, meer frequente voeding intervallen kan worden verlangd (Zie discussie). 5. Astrocyte verrijkte glial support cultures Opmerking: De productie van glial cultures14 en het gebruik van cel cultuur inserts is eerder beschreven12. In het kort, astrocyte verrijkte glia culturen zijn afgeleid van cortico-hippocampale weefsel (met meninges verwijderd; P2 – P5), die zijn gekweekt voor een week op een 20 µ g/mL PLL-gecoate 6-goed platen, in serum aangevuld DMEM media. Om co-cultuur gezuiverde neuronen en glial cellen, passage Confluent glial cellen om het vereiste aantal van de cel cultuur inserts (0,4 µm poriegrootte-Zie tabel van materialen). Om passage de cellen, verwijder een 6-well plaat met Confluent glial cellen uit de incubator en wassen 2 putten, 2 keer, met 2 mL van de voorverwarmde (37 ° c) fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Aspireren de PBS-oplossing en gebruik een P1000 pipet om 1 mL van voorverwarmd (37 °C) trypsine (1:250)/EDTA (0,25%/0.02%) toe te voegen oplossing voor elk goed. Terug de 6-well plaat naar de incubator en controleer elke 2 – 3 min voor de cel loslating. Zodra significante cel detachement heeft voorgedaan, Pipetteer de cellen en de cel oplossing zachtjes op en neer gebruikend een fijne uiteinde Pasteur Pipet, om verder detachement en scheiding van individuele cellen te helpen. Breng de cel oplossing over naar een 15 mL kegel buis en centrifugeer bij 3.000 x g voor 3 min. Re-Suspend de cellen met behulp van een P1000 pipet in 5 mL van de voorverwarmde (37 ° c) NBA complete media door zachtjes te pipetteren op en neer totdat de cel pellet is in oplossing. Voer een aantal cellen uit met een haemocytometer of een geautomatiseerde cel teller.Opmerking: Na 7 dagen in cultuur, ongeveer 750000-1000000 cellen kunnen worden geoogst van elk goed van een 6-well plaat. Plaat 40.000 glial cellen aan elke cel cultuur invoegen in een 500 µ L druppel (80 cellen/µ L). Na het toestaan van de cellen te houden voor 1 uur, gebruik steriele tang om glial-covered Cell cultuur inserts Transfer naar 24-goed platen met gezuiverde neuronen. Verwijder overtollige media van het oppervlak van de cel cultuur inserts (ongeveer 300 µ L).Opmerking: Zoals luchtbellen kunnen vaak opgesloten onder de cel cultuur inserts, kan het nodig zijn om voorzichtig Kantel de inserts om deze bubbels te verjagen. Als er meer glial cellen worden toegevoegd aan de cel cultuur invoegen, verdere wassen en centrifuge stappen kan nodig zijn om overtollige trypsine te verwijderen, die schadelijk kunnen zijn voor cel overleven.