Análisis del plegamiento de la proteína, el transporte y degradación en las células vivas por pulso radiactivo Chase

El plegamiento de incluso relativamente simple de las proteínas consiste en muchas diversas enzimas plegables chaperones moleculares y modificaciones covalentes¹. Una reconstitución completa de estos procesos en vitro es prácticamente imposible, dado el gran número de diferentes componentes involucrados. Es altamente deseable, por lo tanto, estudiar la proteína plegable en vivo, en células vivas. Técnicas radiactivas Pulso-persiga probar una herramienta poderosa para el estudio de la síntesis, plegable, transporte y degradación de proteínas en su ambiente natural.

El metabólico etiquetado de proteínas durante un pulso corto con ³⁵S-labeled metionina/cisteína, seguido de una persecución en la ausencia de una etiqueta radiactiva, permite el seguimiento específico de una población de proteínas recién sintetizadas en el más amplio medio celular. Luego, las proteínas blanco pueden ser aislada mediante inmunoprecipitación y analizan por SDS-PAGE u otras técnicas. Para muchas proteínas, su viaje a través de la célula se caracteriza por modificaciones visibles en gel de SDS-PAGE. Por ejemplo, el transporte de proteínas glicosiladas desde el retículo endoplásmico (ER) del complejo de Golgi es acompañado a menudo por modificaciones de glycans N-ligados o la adición de O-linked glycans^2,3. Estas modificaciones provocan grandes aumentos en la masa molecular aparente, que puede verse por los cambios de movilidad en SDS-PAGE. Maduración también puede ser marcada por las divisiones proteolíticas, tales como péptido señal escote o la eliminación de pro-péptidos, dando por resultado cambios en la masa molecular aparente que puede seguirse fácilmente en gel de SDS-PAGE⁴. Radiactividad tiene considerables ventajas sobre técnicas comparables como persecuciones de cicloheximida, donde se impide la síntesis de nuevas proteínas, como tratamientos más largos son tóxicos para las células y no excluyen a la mayoría de las proteínas mayores, estado de la Análisis, como algunas proteínas tienen vidas medias de días. La comparación de proteínas en ambos nonreducing y reducción de condiciones permite el análisis de la formación del enlace de disulfuro, un paso importante en el plegamiento de las proteínas secretoras muchos de^{4,5,6, 7}.

Aquí describimos un método general para el análisis del plegamiento de la proteína y el transporte en las células intactas, utilizando un enfoque de Pulso-persiga radiactivos. Mientras que nos hemos dirigido para proporcionar el método detallado como sea posible, el protocolo tiene un potencial casi ilimitado para la adaptabilidad y permitirá la optimización para el estudio de proteínas específicas de cada lector.

Se proporcionan dos protocolos alternativos Pulso-persiga, para células adherentes (paso 1.1 del protocolo presentado aquí) y las células de suspensión (paso 1.2 del protocolo presentado aquí). Las condiciones proporcionan aquí son suficientes para visualizar una proteína expresada con niveles de media a alta expresión. Si el lector está trabajando con proteínas mal expresadas o varias condiciones posttreatment, tales como múltiples immunoprecipitations, es necesario aumentar el tamaño del plato o número de células adecuado.

Para la persecución de pulso de suspensión, las muestras de chase tomadas en cada momento se toman de un solo tubo de células. Los pasos de lavado después de que el pulso se omiten; en cambio, más incorporación de ³⁵S es prevenida por dilución con un alto exceso de cisteína y metionina sin etiqueta.

Los protocolos presentados usan radiactivos ³⁵S etiquetado cisteina y metionina para seguir procesos de plegamiento de proteínas celulares. Todas las operaciones con reactivos radiactivos deben realizarse utilizando medidas de protección adecuadas para reducir al mínimo cualquier exposición del operador y el medio ambiente a la radiación radiactiva y realizarse en un laboratorio designado. Pulso-persiga etiquetado técnica es relativamente ineficaz en tiempos de pulso corto (< 15 min), menos del 1% de la cantidad a partir de la radiactividad se incorpora en las proteínas recién sintetizadas. Después el enriquecimiento de la proteína mediante inmunoprecipitación de blanco, la muestra para SDS-PAGE contiene menos de 0.05% de la cantidad inicial de radiactividad.

Aunque los ³⁵S metionina y cisteína etiquetado mezcla se estabiliza, se producirá cierta descomposición, produciendo compuestos radiactivos. Para proteger el investigador y el aparato, se deben tomar algunas precauciones. El investigador siempre debe obedecer a las normas de seguridad de radiación local y puede llevar carbón y una máscara, además de una bata de laboratorio y guantes (doble) de enfermería. Los frascos de stock con ³⁵S metionina y cisteína siempre deben abrirse en una campana de humos, o bajo un punto de aspiración local. Puntos de contaminación de laboratorio conocidas son centrífugas, pipetas, baños, incubadoras y agitadores. La contaminación de estas áreas se reduce mediante el uso de puntas de pipeta con filtro de carbón, tubos de microcentrífuga de sello positivo (véase Tabla de materiales), esponjas de carbón de acuario de agua baños, carbón filtro papeles pegados en los platos de Pulso-persiga, protector de carbón en el sistema de aspiración y la colocación de platos que contienen carbón granos en incubadoras y recipientes de almacenamiento.