Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз
Summary
Здесь мы описываем протокол для общего импульса Чейз метод, который позволяет кинетический анализ складывания, транспорта и деградации белков в живых клеток.
Abstract
Маркировки радиоактивных пульс Чейз является мощным инструментом для изучения конформационного созревания, транспорт до их функциональной сотовой местоположения и деградации белков-мишеней в живых клетках. С помощью коротких (пульс) radiolabeling раз (< 30 мин) и контролировались Чейз раз, можно пометить только небольшая часть общего белка бассейн и следовать его складывание. В сочетании с nonreducing/уменьшение электрофореза геля SDS-полиакриламид (SDS-PAGE) и иммунопреципитации с (конформация) антитела, складывающиеся процессы могут рассматриваться подробно. Эта система использовалась для анализа складывания белков с огромные различия в свойствах растворимые белки, единого и многоходовой трансмембранные белки, сильно N и O гликозилированного белки, и белков с и без обширных дисульфида склеивание. Пульс Чейз методы являются основой кинетических исследований в целый ряд дополнительных функций, включая co – Посттрансляционная модификации, олигомеризация и полимеризации, по существу позволяет анализ белка от рождения до смерти. Пульс Чейз исследования на сворачивание белков дополняют другие биохимические и биофизические методы для изучения белков в пробирке , обеспечивая увеличение временного разрешения и физиологической информации. Методы, как описано в этом документе приспособлены легко учиться, складывающиеся почти любой белок, который может быть выражен в системах млекопитающих и насекомых клеток.
Introduction
Складные даже сравнительно простые белки включает в себя множество различных складной ферменты, молекулярные сопровождающих и ковалентный модификации1. Полное восстановление этих процессов в vitro практически невозможно, учитывая огромное количество различных компонентов. Весьма желательно, таким образом, для изучения белков складывания в естественных условиях, в живых клетках. Радиоактивных пульс Чейз методики доказывают мощный инструмент для изучения синтеза, свертка, транспорта и деградации белков в их естественной среде.
Метаболические маркировки белков во время короткого импульса с 35S-меченых метионина/цистеина, затем Чейз в отсутствие радиоактивных метку, позволяет отслеживания населения вновь синтезируемых белков в широкой клеточного окружения. Затем целевых белков может быть изолированным через иммунопреципитации и проанализированы через SDS-PAGE или других методов. Для многих белков их путешествие через ячейку характеризуется изменениями, которые видны на геля SDS-PAGE. Например перевозки гликозилированного белков от эндоплазменный ретикулум (ER) в комплекс Гольджи часто сопровождается изменения N-связаны гликанов или добавлением гликаны, связанный с O2,3. Эти изменения вызывают значительное увеличение в очевидной молекулярной массы, которую можно увидеть изменения подвижности в SDS-PAGE. Созревания также может быть отмечен протеолитического расщепления, например сигнал пептид спайности или удаления pro пептиды, что привело к изменениям в очевидной молекулярной массы, которая может легко следовать на гель SDS-PAGE4. Радиоактивность имеет значительные преимущества перед сопоставимых методов, таких как циклогексимида погони, где предотвратить синтез новых белков, как длительного лечения токсичны для клеток и не исключает большинство старых, устойчивого состояния белков из анализ, как некоторые белки имеют периоды полураспада дней. Сравнение белков под оба nonreducing и уменьшение условий позволяет анализ формирования дисульфидными облигаций, важный шаг в сложенном многих выделительные протеины4,5,6, 7.
Здесь мы описываем общий метод для анализа сворачивание белков и транспорта в нетронутым клеток, используя подход радиоактивных пульс Чейз. Хотя мы стремились представить этот метод как как можно более подробно протокол имеет почти безграничным потенциалом для адаптации и позволит оптимизации для изучения специфических белков каждого читателя.
Предоставляются две альтернативные пульс Чейз протоколов, один для адэрентных клеток (шаг 1.1 протокола, представленные здесь) и один для подвески клеток (шаг 1.2 протокола, представленные здесь). Условия здесь являются достаточными для визуализации белок с средне высокий выражение уровня. Если читатель работает с слабо выраженной белки или различных рентгенологическое условий, таких как несколько immunoprecipitations, необходимо увеличить размер блюдо или мобильный телефон надлежащим образом.
Для подвески пульс Чейз Чейз проб, взятых в каждый момент времени все взяты из одной трубки клеток. Мыть шаги после импульса опущены; Вместо этого дальнейшее включение 35S предотвращается путем разбавления с высоким избыток немеченого метионина и цистеина.
Представлены протоколы используют радиоактивные 35S-меченых цистеина и метионина следовать клеточных процессов, сворачивание белков. Используя соответствующие защитные меры для сведения к минимуму любого воздействия оператора и окружающей среды, радиоактивного излучения и выполняться в назначенной лаборатории следует выполнять все операции с радиоактивными реагентов. Как пульс Чейз маркировки техника относительно неэффективными порой короткого импульса (< 15 мин), меньше, чем 1% от начальной суммы радиоактивности включена в вновь синтезируемых белков. После обогащения целевого белка через иммунопреципитация образец для SDS-PAGE содержит меньше чем 0,05% от суммы начального радиоактивности.
Хотя 35S метионина и цистеина, маркировки смеси стабилизируется, некоторые разложения, уступая летучих радиоактивных соединений, будет происходить. Чтобы защитить исследователь и аппарата, следует принять некоторые меры предосторожности. Исследователь всегда должен подчиняться правилам безопасности местных излучения и может носить уголь кормящих маски, кроме лаборатории пальто и перчатки (двойной). Складе флаконов с 35S метионина и цистеина всегда должен быть открыт в вытяжной шкаф или под местной стремление точки. Пятна загрязнения известных лабораторных центрифуг, пипетки, водяные бани, инкубаторы и шейкеры. С помощью пипетки советы с угольный фильтр, положительный печать microcentrifuge трубки (см. Таблицу материалы), аквариум угольные губки в воды ванны, угольный фильтр документах склеены в пульс Чейз блюда, уменьшается загрязнение этих областей Древесный уголь гвардия в системы аспирации и размещение блюда, содержащие уголь зерна в инкубаторы и хранения контейнеров.
Protocol
Representative Results
Discussion
Пульс Чейз методы имели важнейшее значение для понимания ученых белка, складывающиеся в нетронутым клеток. В то время как мы пытались обеспечить метод, который как можно больше общих, этот подход имеет потенциал для почти безграничные варианты для изучения различных процессов, которые…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы поблагодарить всех членов Braakman лаборатории, прошлое и настоящее время, за их плодотворные дискуссии и помочь в разработке методов, представленных в этой статье. Этот проект получил финансирование от Европейского Совета исследований под Европейского союза седьмой рамочной программы (FP7/2007-2013) N ° 235649 и Нидерланды организации научных исследований (NWO) под эхо программа N ° 711.012.008.
Materials
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20×25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4˚C |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
References
- Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
- Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
- Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle. Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).
- Snapp, E. L., et al. Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide. Elife. 6, 26067 (2017).
- Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).
- Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein. Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).
- Land, A., Braakman, I. Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum. Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).
- Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function. Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).
- Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro. Virology. 263 (1), 55-69 (1999).
- Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).
- Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin. Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).
- Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones. Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).
- Hoelen, H., et al. The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain. PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e. Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).
- Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport. Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).
