Analisi della piegatura della proteina, trasporto e degradazione in cellule viventi di radioattivo Pulse Chase

La piegatura delle anche relativamente semplice proteine coinvolge molti diversi enzimi pieghevoli, chaperoni molecolari e modificazioni covalenti¹. Una ricostituzione completa di questi processi in vitro è praticamente impossibile, dato il vasto numero di differenti componenti coinvolti. È altamente auspicabile, pertanto, per studiare il folding delle proteine in vivo, in cellule vive. Impulso-insegua radioattivo tecniche rivelarsi uno strumento potente per studiare la sintesi, pieghevole, trasporto e degradazione delle proteine nel loro ambiente naturale.

Il metabolica etichettatura delle proteine durante un breve impulso con ³⁵S-labeled metionina/cisteina, seguita da un inseguimento in assenza di un’etichetta radioattiva, permette il rilevamento specifico di una popolazione di proteine appena sintetizzate nel più ampio ambiente cellulare. Quindi, proteine bersaglio possono essere isolato tramite immunoprecipitazione e analizzati tramite SDS-PAGE o altre tecniche. Per molte proteine, il loro viaggio attraverso la cella è segnata da modifiche che sono visibili su gel di SDS-PAGE. Ad esempio, il trasporto di proteine glicosilate dal reticolo endoplasmatico (ER) al complesso di Golgi è spesso accompagnato da modifiche dei glycans N-collegati o l’aggiunta di glicani O-collegata^2,3. Queste modifiche causare grandi aumenti nella massa molecolare apparente, che può essere visto dai cambiamenti di mobilità in SDS-PAGE. Maturazione può anche essere contrassegnato da fenditure proteolitici, come fenditura del peptide di segnale o la rimozione di pro-peptidi, conseguente cambiamenti nella apparente massa molecolare che possono essere seguite facilmente su gel di SDS-PAGE⁴. Radioattività ha notevoli vantaggi rispetto alle tecniche comparabili come inseguimenti cicloesimmide, dove sintesi proteica romanzo è impedita, come trattamenti di lunga durata sono tossici per le cellule e non escludono la maggior parte delle proteine più vecchio, allo steady-state dalla analisi, come alcune proteine hanno emivite di giorni. Il confronto di proteine sotto entrambi non riducente e condizioni riducenti permette l’analisi della formazione di legami disolfuro, un passo importante nella piegatura di molte proteine secretorie^{4,5,6, 7}.

Qui descriviamo un metodo generale per l’analisi del protein folding e trasporto in cellule intatte, utilizzando un approccio di impulso-insegua radioattivo. Mentre abbiamo l’obiettivo di fornire il metodo come dettagliato possibile, il protocollo ha un potenziale quasi illimitato per adattabilità e permetterà di ottimizzazione studiare le proteine specifiche di ogni lettore.

Sono disponibili due protocolli alternativi pulse-chase, uno per cellule aderenti (passo 1.1 del protocollo presentato qui) e uno per cellule in sospensione (punto 1.2 del protocollo presentato qui). Le condizioni di cui qui sono sufficienti per visualizzare una proteina espressa con livelli di medio-alta espressione. Se il lettore sta lavorando con proteine mal espresse o varie condizioni dopo trattamento, quali immunoprecipitati multiple, è necessario aumentare le dimensioni del piatto o numero di cellulare in modo appropriato.

Per chase di impulso di sospensione, i campioni di chase prelevati in ogni momento sono tutti presi da un singolo tubo di cellule. Le fasi di lavaggio dopo l’impulso vengono omessi; invece, ulteriore incorporazione di ³⁵S è impedita da diluizione con un elevato eccesso di adenoida metionina e cisteina.

I protocolli presentati utilizzano radioattivo ³⁵S-labeled cisteina e metionina per seguire processi di folding delle proteine cellulari. Tutte le operazioni con i reagenti radioattivi devono essere eseguite utilizzando adeguate misure di protezione per ridurre al minimo qualsiasi esposizione dell’operatore e dell’ambiente di radiazione radioattiva ed essere eseguite in un laboratorio designato. Come la pulse-chase etichettatura tecnica è relativamente inefficiente a volte di impulso corto (< 15 min), meno di 1% dell'importo iniziale di radioattività è incorporato nelle proteine recentemente sintetizzate. Dopo l'arricchimento della proteina tramite immunoprecipitazione destinazione, il campione per SDS-PAGE contiene meno dello 0.05% della quantità iniziale di radioattività.

Anche se il ³⁵S metionina e cisteina etichettatura mix è stabilizzato, si verificherà alcune decomposizione, producendo composti radioattivi volatili. Per proteggere il ricercatore e l’apparato, dovrebbero essere prese alcune precauzioni. Il ricercatore deve sempre obbedire alle regole di sicurezza di radiazione locale e può indossare un carboncino maschera, oltre a un camice da laboratorio e guanti (doppie) di professione d’infermiera. Stock flaconcini con ³⁵S metionina e cisteina devono sempre essere aperto in una cappa, o sotto un punto di aspirazione locale. Macchie di contaminazione noto laboratorio sono centrifughe, pipette, bagni d’acqua, incubatori e agitatori. La contaminazione di queste aree è ridotto mediante l’utilizzo di puntali per pipette con un filtro al carbone, positivo-seal per microcentrifuga (Vedi Tabella materiali), Acquario carbone spugne in acqua bagni, carbone filtri di carta incollati nei piatti pulse-chase, guardia del carbone di legna nel sistema di aspirazione e il posizionamento dei piatti che contiene granelli di carbone di legna in incubatrici e contenitori di stoccaggio.