Quantifier la répartition hétérogène d’une protéine synaptique dans le cerveau de souris à l’aide d’Immunofluorescence

Communication entre les neurones se passe à des sites de contact spécialisées appelées synapses. Synapses contiennent une multitude de différentes protéines qui orchestrent la transmission synaptique. Certaines de ces protéines présentent une distribution hétérogène dans le système nerveux et ne sont pas présents dans chaque synapse¹. Un exemple d’une telle protéine est Munc13, qui est impliqué dans le processus d’amorçage de vésicules synaptiques. Il existe différentes isoformes de Munc13, qui sont hétérogène dans tout le cerveau², et la présence ou l’absence des isoformes spécifiques peut influer sur la plasticité synaptique à court terme et la vésicule synaptique dynamique^{3, 4 , 5}. par conséquent, il est d’une importance vitale pour pouvoir identifier la présence de différentes protéines synaptiques dans certaines zones du cerveau.

Les méthodes de choix pour la quantification des protéines synaptiques – jusqu’à présent – sont la spectrométrie de masse et de Western Blot, plutôt que d’immunohistochimie^6,7,8,9. Dans certains cas, plusieurs méthodes sont utilisées pour se compléter mutuellement afin d’évaluer la quantité et la localisation des protéines spécifiques (p. ex., Wilhelm et al. ¹⁰). la méthode que nous décrivons ici permet la localisation et quantification des protéines d’intérêt sans avoir besoin d’utiliser toute méthode biochimique, employant simplement les salissures par immunofluorescence. Un autre avantage ici est que la quantification peut être faite sur des zones beaucoup plus petites et, donc, plus précise, que ceux réalisés par d’autres méthodes. Cependant, il faut prendre en considération qu’une protéine de référence fiable est nécessaire pour évaluer la distribution de la protéine d’intérêt.

Une coloration fluorescente par immunohistochimie permet d’identifier systématiquement la localisation des protéines dans certaines zones du cerveau ainsi que dans différents compartiments neuronales. Pour identifier les différents compartiments, marqueurs spécifiques sont utilisés. En général, anticorps contre synapsine et synaptophysine¹¹ peuvent être utilisés pour étiqueter des vésicules synaptiques, tandis que les anticorps contre basson étiqueter la zone active d’un présynaptique borne¹². Transporteurs vésiculaires, tels que les transporteurs de glutamate vésiculaire (vGluT) ou le transporteur vésiculaire de GABA (vGAT), sont utilisés pour étiqueter les excitateurs¹³ et inhibitrice¹⁴ terminaisons présynaptiques, respectivement. Côté postsynaptique, anticorps dirigés contre la protéine Homer peuvent être utilisées pour marquer les bornes postsynaptiques et anticorps contre densité postsynaptique protéine 95 (PSD95)^15,16,17 ou gephyrin^{18 , 19 , 20} peut marquer les bornes postsynaptiques excitateurs ou inhibiteurs, respectivement. En utilisant des anticorps contre une protéine d’intérêt et de marqueurs tels que ceux décrits ci-dessus, on peut déterminer la localisation de cette protéine. De nombreuses études à ce jour l’ont fait dans une manière qualitative²¹. Toutefois, pour déterminer de manière fiable la distribution différentielle d’une protéine synaptique spécifique, il faut non seulement déterminer sa présence ou absence, mais aussi sa concentration relative. L’hétérogénéité de la taille et la densité des synapses rendent important d’établir un rapport entre le marqueur synaptique et la protéine d’intérêt. Dans le cas contraire, les régions riches en synapse tels que les couches non pyramidaux de l’hippocampe et la couche moléculaire du cervelet montrera une densité élevée de protéines synaptiques, uniquement en raison de la densité plus élevée des synapses mais pas en raison d’une forte présence de cette protéine dans chaque synapse (p. ex., Wallrafen et Dresbach¹). En revanche, les protéines dans le soma neuronal (par exemple, TGN38²²) affichera généralement forte présence dans la couche de cellules pyramidales hippocampe ou la couche de cellules hippocampiques ou cérébelleux granule en raison de la forte concentration de corps des cellules neuronales dans ces domaines. Par conséquent, cette répartition non homogène des structures, synapses dans ce cas, peut conduire à une fausse estimation de la distribution de la protéine d’intérêt elle-même. En outre, il y a une variabilité intrinsèque en intensités de coloration dans les trois échantillons de salissures immunohistochimiques. Le protocole décrit ici tienne compte de cela et évite ces préjugés, mais aussi autres avertissements résultant de méthodes immunohistochimiques.

Dans notre récente étude, nous avons utilisé cette méthode pour décrire l’expression différentielle de Mover (également appelée TPRGL²³ SVAP30²⁴) l’ensemble 16 cerveau différents domaines¹. Mover est une protéine synaptique vertébré spécifiques qui se trouvent en association à des vésicules synaptiques et influence la neurotransmetteur dégagement^25,26,27. Nous avons lié l’expression Mover à l’abondance des vésicules synaptiques, par coloration pour synaptophysine comme un repère de vésicules synaptiques. Nous avons trouvé des niveaux élevés de Mover en particulier dans les noyaux septums, le pallidum ventral et l’amygdale. Dans l’hippocampe, nous trouvons une répartition hétérogène des Mover, avec des niveaux élevés dans les couches associées calcul intra-hippocampique et faibles concentrations dans les couches d’entrée et de sortie.