Preparación y modificación genética de primates no humanos tallo hematopoyéticas y células progenitoras

Terapia génica de la célula de vástago es un medio poderoso para abordar una amplia gama de patologías humanas. La terapia génica HSPC es un enfoque especialmente atractivo, debido a i) la relativa facilidad de la recogida de estas células de pacientes, ii) la riqueza del conocimiento que está disponible en cuanto a fenotipos de superficie celular y ex vivo parámetros de cultura y, como el campo se amplía, porque iii) presenta los científicos con una caja de herramientas cada vez más de estrategias de modificación génica adaptados a varias enfermedades de interés. Estamos investigando activamente HSPC enfoques de terapia de gen desde varios ángulos, incluyendo la ciencia básica de Biología HSPC, el engraftment de HSPCs modificado gen en modelos preclínicos in vivo y la aplicación a las poblaciones de pacientes. Nosotros y otros hemos caracterizado el fenotipo de superficie celular de funcionalmente distintas HSPC subconjuntos^1,2,3, la movilización y regímenes de acondicionamiento que maximizan el rendimiento de la HSPC y engraftment minimizando toxicidad^4,5y el gene de la modificación y edición de gene estrategias que se ajustan a una amplia gama de maligno, genética y enfermedades infecciosas^{6,7,8, 9,10}. La función y el engraftment de HSPCs gene modificado pueden evaluarse en un número de modelos de animales grandes y pequeños, como ratones, perros, NHPs. En particular, modelos NHP son ventajosos porque muchos reactivos, por ejemplo, anticuerpos específicos para proteínas de superficie de célula HSPC como CD34 y CD90, pueden ser utilizados indistintamente en humanos y células NHP. Además, en contraste con los ratones, animales grandes, como NHPs permiten una mejor aproximación de la magnitud de la modificación genética necesaria para la eficacia clínica. Finalmente, NHPs son el estándar de oro para el modelado de patologías humanas tales como HIV-1 infección¹¹ y son un modelo emergente para candidato anticáncer y anti-VIH inmunoterapias^12,13.

El propósito de este protocolo es exponer métodos para purificar, modificar genéticamente y preparación de productos de infusión HSPC NHP. Aunque fuera del alcance de este protocolo, previamente hemos demostrado que estos productos engraft en anfitriones NHP autólogos, dan lugar a todos los linajes hematopoyéticos y proporcionan eficacia terapéutica en una amplia gama de modelos de enfermedad¹. También hemos caracterizado el clonality de engrafting HSPCs y construido una plataforma para el seguimiento de la cinética, tráfico y el fenotipo de HSPCs individuales y su progenie, siguiente trasplante autólogo^1,14. Los métodos presentados aquí han sido desarrollados con los siguientes objetivos: i) al aislar HSPCs altamente puros y subconjuntos HSC engrafting a largo plazo, ii) para mantener HSCs primitivo durante ex vivo de la cultura y iii) eficacia gene-modificar ya sea a granel HSPCs o a largo plazo engrafting subconjuntos HSC. Empleamos asistida magnética celular clasificación (MACS), así como de células activado por fluorescencia (FACS), para aislar a fenotípicamente/funcionalmente HSPC poblaciones distintas, consistentes con los métodos de muchos grupos^{2,15, de la clasificación 16}. El mantenimiento de HSCs primitivos en la cultura (es decir, minimizar la diferenciación de estas células en progenitores comprometidos que dan lugar a completamente diferenciados subconjuntos linfoides y mieloides) es una faceta esencial del protocolo descrito aquí. Aunque anteriormente hemos caracterizado enfoques para ampliar HSPCs manteniendo un fenotipo primitivo^17,18, aquí, se describe un protocolo que se centra en el mantenimiento de las HSCs vía un mínimo (48 h) y define ex vivo de la cultura.

La modificación eficaz de HSPCs y HSC subconjuntos es un objetivo central de este protocolo. Entre varios enfoques hemos divulgado, dos son los más investigados en ensayos clínicos: modificación genética mediada por LV y nucleasa-mediated gene edición^1,6,19. Estrategias gene-edición para utilizan uno de un número de plataformas de nucleasa para modificar específicamente un gen específico de interés, por ejemplo, C-C chemokine receptor tipo 5 (CCR5) para el tratamiento de VIH infección^7,19 o Bcl11A para el tratamiento de hemoglobinopatías⁶. Aquí, nos centramos en la modificación genética de LV-mediada, en la cual cargas transgénicas semirandomly integran en el genoma^1,8,20. Una ventaja clave de los enfoques de LV es la capacidad para entregar grandes cantidades de material genético (hasta 8 o 9 kilobases). Aunque estrategias gene-edición se están desarrollando para un transgen de interés integrar sólo en un lugar especificado por recombinación homóloga donantes (HDR), estos métodos requieren más desarrollo in vitro y en modelos animales pequeños. Por el contrario, vectores de LV se han utilizado extensivamente en NHPs y en pacientes^21,22. Lo importante, el protocolo descrito aquí, que utiliza habían cebada BM como una fuente partida de la HSPC, puede ser fácilmente y ampliamente adaptado, por ejemplo, para aislar PBSCs. Como se describió anteriormente, aprovechamos el alto grado de similitud genética entre NHPs y los seres humanos para utilizar reactivos que son aplicables a ambas especies. Por último, este enfoque ha sido adaptado para modificar otros subconjuntos hematopoyéticos, es decir, T las células^12,23,24; la llegada de los eficaces métodos de inmunoterapia de T-cell ha confiado pesadamente en la misma plataforma de LV en este protocolo. Estos métodos son apropiados para cualquier investigador interesado en la biología de la HSPC o modificación genética mediada por LV. Por ejemplo, podría utilizarse el protocolo de purificación de la HSPC presentado aquí para caracterizar nuevos subconjuntos de HSC-enriquecido, como se describió anteriormente^1,15,25. Asimismo, la transducción de LV métodos presentados aquí podrían del mismo modo ser aplicada y desarrollada por numerosos tipos celulares y preguntas experimentales, tanto en modelos in vitro e in vivo.

En Resumen, se presentan métodos para aislar y modificar genéticamente HSPCs NHP. Estos métodos pueden ser muy fácilmente adaptables para otras especies y otras fuentes de HSPCs. Este protocolo minuciosamente investigado muestra gran promesa en el modelaje de las eficaces terapias para numerosas enfermedades humanas.