Подготовка и генной модификации нечеловеческих приматов гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток

Генная терапия стволовой клетки является мощным средством для решения широкого круга человеческих патологий. HSPC генная терапия является особенно привлекательным подход, благодаря i) относительная простота сбора эти клетки от больных, ii богатство знаний, которая доступна относительно клеток поверхности фенотипы и ex vivo культуры параметры и, как и поле расширяется, потому что iii) он представляет ученых с возрастающей toolbox генной модификации стратегий с учетом различных заболеваний, представляющих интерес. Мы активно изучаем HSPC генной терапии подходы с нескольких точек зрения, включая основные науки HSPC биологии, приживления генно модифицированных HSPCs в доклинических моделях в естественных условиях, и применение соответствующих групп пациентов. Мы и другие характеризовали поверхности фенотипа клетки функционально различных HSPC подмножеств^1,2,3, мобилизации и принадлежности схем, которые максимально HSPC урожайности и приживления при минимизации токсичности^4,5и генной модификации и Джин редактирования стратегии, которые были адаптированы к широкий спектр злокачественных, генетических и инфекционных заболеваний^{6,,78, 9,10}. Функция и приживления генно модифицированных HSPCs может быть оценен в ряд малых и крупных животных моделей, включая мыши, собаки и Евросоюзе. В частности NHP модели выгодно, потому что многие реагентов, например, антител специфических для HSPC клеток поверхности белки как CD34 и CD90, могут использоваться попеременно в человека и NHP клетки. Кроме того в отличие от мышей, крупных животных, таких как Евросоюзе позволяют приближением шкалы генной модификации необходимые для клинической эффективности. Наконец Евросоюзе являются золотым стандартом для моделирования человеческих патологий, таких как ВИЧ-1 инфекции¹¹ и формирующейся модели системы для кандидата противоопухолевой и анти-ВИЧ immunotherapies^12,13.

Целью настоящего Протокола является наметить методы для очистки, генетического изменения и подготовку NHP HSPC инфузии. Хотя в сферу применения настоящего Протокола, мы ранее показали, что эти продукты привито в аутологичной NHP хостов, порождают все гемопоэтических линии и предоставлять терапевтическую эффективность в широкий спектр болезней модели¹. Мы также характеризуется clonality голокоренные HSPCs и построил платформу для отслеживания кинетики, торговлей и фенотип отдельных HSPCs и их потомства, следующие аутологичной трансплантации^1,14. Представленные здесь методы были разработаны с целью: i) чтобы изолировать высоки чисто HSPCs и долгосрочный голокоренные HSC подмножеств, ii) для поддержания примитивных СКК во время ex vivo культуры и iii) эффективно ген изменить либо массовая HSPCs или долгосрочный отлаживание HSC подмножеств. Мы используем магнитные помощь сортировки клеток (ПДК), а также активации флуоресценции клеток, сортируя (FACS), чтобы изолировать фенотипически/функционально различных HSPC населения, в соответствии с методами многих групп^{2,15, 16}. Поддержание примитивных СКК в культуре (то есть, минимизации дифференцировка этих клеток в совершено прародителей, которые порождают полностью дифференцированной лимфоидных и миелоидного подмножеств) является важным аспектом протокола, описанных здесь. Хотя мы ранее характеризовались подходы к расширению HSPCs при сохранении примитивных фенотип^17,18, здесь, мы описываем протокол, который фокусируется на поддержание СКК через минимальный (48 ч) и определены ex vivo культуры.

Эффективное модификации HSPCs и HSC подмножества является главной целью настоящего Протокола. Среди нескольких подходов, мы уже сообщали, два являются на сегодняшний день наиболее исследованных в клинических испытаниях: LV-опосредованной генной модификации и нуклеиназы опосредованной гена редактирования^1,6,19. Джин редактирования стратегии использовать один из ряда нуклеиназы платформ для специально изменения целевого гена интереса, например, C-C хемокиновых рецепторов типа 5 (CCR5) для лечения ВИЧ инфекции^7,19 или Bcl11A для лечения hemoglobinopathies⁶. Здесь мы сосредоточены на LV-опосредованной генной модификации, в котором трансгенных грузов интегрировать semirandomly в геном^1,8,20. Ключевым преимуществом LV подходов является возможность доставить большое количество генетического материала (до 8 или 9 kilobases). Хотя Джин редактирования стратегии разрабатываются Целевой трансген, представляющие интерес для интеграции только в указанном локусе гомологичных доноров рекомбинации (HDR), эти методы требуют дальнейшего развития в пробирке и в небольших животных моделях. В отличие от LV векторов широко использовались в Евросоюзе и пациентов^21,22. Важно отметить, что протокол, описанных здесь, который использует загрунтовать BM как отправной HSPC источника, может быть легко и широко адаптирована, например, изолировать PBSCs. Как описано выше, мы воспользоваться высокой степени генетического сходства между Евросоюзе и людей использовать реагенты, которые применимы для обоих видов. Наконец этот подход был адаптирован для изменения других гемопоэтических подгруппы, а именно T клетки^12,,2324; с появлением эффективных подходов Т-клеточной иммунотерапии полагались на той же платформе LV, используемые в настоящем Протоколе. Эти методы являются подходящими для любой исследователь заинтересован в биологии HSPC или LV-опосредованной генной модификации. Например, протокол очистки HSPC, представленные здесь могут использоваться для характеристики Роман HSC-обогащенный подмножеств, как описано ранее в^1,15,25. Аналогичным образом LV трансдукции, что представленные здесь методы могут также применяться и дальнейшее развитие для многих других типов клеток и экспериментальных вопросов, как в модели в vitro и in vivo.

Таким образом мы представляем методы изолировать и генетически модифицировать NHP HSPCs. Эти методы могут быть легко адаптированы для других видов и других источников HSPCs. Этот тщательно исследованные протокол показывает большие надежды в моделировании эффективной терапии для многочисленных заболеваний человека.