Preparação e modificação genética de primatas não humanos tronco hematopoiéticas e células progenitoras

Terapia gênica de células-tronco é um meio poderoso para abordar um vasto leque de patologias humanas. Terapia de gene HSPC é uma abordagem particularmente atraente, devido à i) a relativa facilidade de coletar essas células dos pacientes, ii) a riqueza de conhecimentos disponíveis sobre fenótipos de superfície celular e ex vivo parâmetros de cultura, e, como o campo se expande, Porque iii) apresenta cientistas com uma caixa de ferramentas cada vez maior de estratégias de modificação do gene adaptados às várias doenças de interesse. Estamos investigando ativamente HSPC abordagens de terapia de gene de vários ângulos, incluindo a ciência básica da HSPC biologia, a enxertia de HSPCs gene-modificado em modelos in vivo pré-clínicos e a aplicação de populações de pacientes relevantes. Nós e os outros têm caracterizado o fenótipo de superfície celular de funcionalmente distintos HSPC subconjuntos^1,2,3, a mobilização e regimes de condicionamento que maximizar o rendimento HSPC e enxertia, minimizando toxicidade de^4,5e o gene modificação e edição de gene estratégias que têm sido adaptadas para uma ampla gama de maligno, genética e doenças infecciosas^{6,7,8, 9,10}. A função e a enxertia de HSPCs gene modificado podem ser avaliados em um número de modelos de pequeno e grande-animal, incluindo ratos, cães e NHPs. Em particular, modelos de PNC são vantajosos porque muitos reagentes, por exemplo, os anticorpos específicos para as proteínas superfície celular HSPC como CD34 e CD90, podem ser usados permutavelmente em humanos e células do PNC. Além disso, em contraste com os ratos, animais de grandes porte como NHPs permitem uma maior aproximação da escala da modificação genética necessária para a eficácia clínica. Finalmente, NHPs são o padrão ouro para a modelagem de patologias humanas tais como a infecção de HIV-1¹¹ e um sistema de modelo emergente para candidato anticâncer e anti-HIV imunoterapias^12,13.

O propósito do presente protocolo é delinear os métodos de purificação, modificação genética, e a preparação de produtos de infusão NHP HSPC. Embora fora do âmbito do presente protocolo, anteriormente mostramos que esses produtos engraft em hospedeiros de PNC autólogos, dão origem a todas as linhagens hematopoiéticas e fornecem eficácia terapêutica em uma ampla gama de modelos de doença¹. Temos também caracterizada a clonality de HSPCs engrafting e construiu uma plataforma para rastrear a cinética, o tráfico e o fenótipo dos HSPCs individuais e seus descendentes, seguir transplante autólogo^1,14. Os métodos aqui apresentados foram desenvolvidos com os seguintes objetivos: i) para isolar HSPCs altamente puros e subconjuntos HSC engrafting a longo prazo, ii) para manter o primitivos linfócitos durante ex vivo de cultura e iii) eficientemente gene-modificar qualquer granel HSPCs ou a longo prazo engrafting HSC subconjuntos. Nós empregamos magnética assistida por célula-classificação (MACS), bem como fluorescência-ativado da pilha (FACS), para isolar fenotipicamente/funcionalmente HSPC populações distintas, consistentes com os métodos de muitos grupos^{2,15, de classificação 16}. A manutenção da primitivas linfócitos em cultura (ou seja, minimizando a diferenciação dessas células em progenitores comprometidos que dão origem a totalmente diferenciadas subconjuntos mieloides e linfoides) é um aspecto essencial do protocolo descrito aqui. Embora nós anteriormente caracterizaram abordagens para expandir HSPCs mantendo um fenótipo primitivo^17,18, aqui, descrevemos um protocolo que centra-se na manutenção de linfócitos através de uma mínima (48 h) e definido ex vivo cultura.

A modificação eficiente de HSPCs e HSC subconjuntos é um objetivo central do presente protocolo. Entre várias abordagens temos relatado, dois são de longe os mais investigados em ensaios clínicos: modificação genética de LV-mediada e mediada por nuclease gene edição^1,6,19. Gene-edição estratégias usam um de um número de plataformas de nuclease para modificar especificamente um gene alvo de interesse, por exemplo, o receptor do chemokine C-C tipo 5 (CCR5) para o tratamento da infecção de HIV^7,19 ou Bcl11A para o tratamento de Hemoglobinopatias⁶. Aqui, focalizamos a modificação genética de LV-mediado, no qual cargas transgênicas semirandomly integrarem o genoma^1,8,20. A principal vantagem da LV abordagens é a capacidade de entregar grandes quantidades de material genético (até 8 ou 9 kilobases). Embora o gene-edição estratégias estão sendo desenvolvidas para direcionar um transgene de interesse para integrar somente em um locus especificado por recombinação homóloga doador (HDR), esses métodos exigem mais desenvolvimento in vitro e em modelos animais pequenos. Em contraste, vetores de LV têm sido amplamente utilizados em NHPs e em pacientes^21,22. Importante, o protocolo descrito aqui, que usa aprontado BM como uma fonte HSPC a partida, pode ser facilmente e amplamente adaptado, por exemplo, para isolar o PBSCs. Conforme descrito acima, podemos aproveitar o alto grau de similaridade genética entre NHPs e os seres humanos usar reagentes que são aplicáveis a ambas as espécies. Finalmente, esta abordagem tem sido adaptada para modificar outros subconjuntos hematopoiéticos, nomeadamente T células^12,23,24; o advento das abordagens de imunoterapia eficazes células T tem dependia fortemente a mesma plataforma de LV utilizada neste protocolo. Esses métodos são adequados para qualquer pesquisador interessado em biologia HSPC ou modificação genética mediada por LV. Por exemplo, o protocolo de purificação HSPC apresentado aqui pode ser usado para caracterizar o romance subconjuntos HSC-enriquecido, conforme descrito anteriormente,^1,15,25. Da mesma forma, a transdução de LV métodos apresentados aqui da mesma forma poderiam ser aplicada e desenvolvida para vários outros tipos de células e perguntas experimentais, tanto em modelos in vitro e in vivo.

Em resumo, apresentamos métodos para isolar e modificar geneticamente NHP HSPCs. Esses métodos podem ser facilmente adaptados para outras espécies e outras fontes de HSPCs. Este protocolo exaustivamente investigado mostra uma grande promessa na modelagem de terapias eficazes para várias doenças humanas.