Préparation et Modification de gène de Primate non-humaine souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices

Thérapie génique cellules souches est un moyen puissant pour traiter un large éventail de pathologies humaines. Thérapie génique HSPC est une approche particulièrement attractive, en raison de i) la facilité relative de recueillir ces cellules provenant de patients, ii) la richesse de la connaissance qui n’est disponible concernant les surface phénotypes cellulaires et ex vivo paramètres de culture et, comme le domaine s’agrandit, car iii) il présente des scientifiques avec une boîte à outils croissant de stratégies de modification génique adaptés à diverses maladies d’intérêt. Nous étudions activement HSPC gene therapy approches sous plusieurs angles, y compris les connaissances scientifiques fondamentales de biologie HSPC, la greffe de HSPCs modifiées dans les modèles précliniques in vivo et l’application à des populations de patients concernées. Nous et autres avons caractérisé le phénotype de surface cellulaire de fonctionnellement distinctes HSPC sous-ensembles^1,2,3, la mobilisation et les régimes de conditionnement qui maximisent le rendement HSPC et greffe tout en minimisant la toxicité^4,5et le gène modification et édition de gène des stratégies qui ont été adaptés à un large éventail de tumeurs malignes, génétique et maladies infectieuses^{6,7,8, 9,10}. La fonction et la prise de greffe de HSPCs modifiées peuvent être évalués dans un certain nombre de modèles de petits et grands-animaux, dont des souris, des chiens et PSN. En particulier, les modèles de PSN sont avantageux car nombreux réactifs, par exemple, les anticorps spécifiques aux protéines de surface de cellules HSPC comme CD34 et CD90, peuvent être utilisés indifféremment dans les cellules humaines et PSN. En outre, contrairement aux souris, grands animaux tels les PSN permettent une approximation plus étroite de l’ampleur de la modification des gènes nécessaires à l’efficacité clinique. Enfin, PSN est l’étalon-or pour la modélisation de pathologies humaines telles que HIV-1 infection¹¹ et un nouveau système modèle pour candidat anticancéreux et anti-VIH immunothérapies^12,13.

Le but du présent protocole est de définir des méthodes pour purifier, modifier génétiquement et préparation de produits de perfusion NHP HSPC. Bien que hors de la portée du présent protocole, nous avons déjà montré que ces produits greffer chez les hôtes de PSN autologues, donnent lieu à toutes les lignées hématopoïétiques et offrent une efficacité thérapeutique dans un large éventail de modèles de la maladie¹. Nous avons également caractérisé la clonalité d’après HSPCs et construit une plate-forme pour suivre la cinétique, le trafic et le phénotype des HSPCs individuelles et de leur progéniture, suivant la transplantation autologue^1,14. Les méthodes présentées ici ont été mis au point avec les objectifs suivants : i) d’isoler HSPCs extrêmement purs et à long terme après sous-ensembles HSC, ii) de maintenir autorenouveler primitif au cours ex vivo la culture et iii) d’efficacement gène-modifier soit en vrac HSPCs ou à long terme faire une exception des sous-ensembles HSC. Nous employons magnétique assistée par cellule tri (MACS), ainsi que de la cellule activée par fluorescence triant (FACS), afin d’isoler phénotypiquement/fonctionnellement HSPC populations distinctes, compatibles avec les méthodes de nombreux groupes^{2,15, 16}. L’entretien des CSH primitive culture (c’est-à-dire, minimisant la différenciation de ces cellules en progéniteurs engagés qui donnent lieu à pleinement différenciées des sous-ensembles lymphoïdes et myéloïdes) est un aspect essentiel du protocole décrit ici. Bien que précédemment, nous avons caractérisé les approches pour développer HSPCs tout en conservant un phénotype primitif^17,18, ici, les auteurs décrivent un protocole qui met l’accent sur le maintien des CSH via un minime (48 h) et défini ex vivo culture.

La modification efficace des HSPCs et HSC sous-ensembles est des principaux objectifs du présent protocole. Parmi plusieurs approches, nous l’avons signalé, deux sont de loin les plus étudiés dans les essais cliniques : modification de gènes LV et gènes nucléase édition^1,6,19. Stratégies de modification génétique parmi un certain nombre de plates-formes de nucléase utilisent spécifiquement modifier un gène ciblé d’intérêt, par exemple, le récepteur de chimiokine C-C type 5 (CCR5) pour le traitement de HIV infection^7,19 ou Bcl11A pour le traitement des hémoglobinopathies⁶. Ici, nous nous concentrons sur la modification des gènes LV, dont des cargaisons transgéniques intègrent semirandomly dans le génome de^8,1,20. Un avantage majeur des approches LV est la capacité à livrer de grandes quantités de matériel génétique (jusqu’à 8 ou 9 kilobases). Bien que les stratégies de modification de gènes sont élaborés pour cibler un transgène d’intérêt d’intégrer seulement à un locus spécifié par recombinaison homologue donneur (HDR), ces méthodes doivent être développement in vitro et sur des modèles animaux petits. En revanche, vecteurs de LV ont été utilisés intensivement dans les PSN et les patients^21,22. Ce qui est important, le protocole décrit ici, qui utilise amorcée BM comme source HSPC départ, peut être facilement et largement adapté, par exemple, pour isoler le CSSP. Comme décrit ci-dessus, nous profitons du degré élevé de similarité génétique entre les PSN et les humains d’utiliser des réactifs qui sont applicables à ces deux espèces. Enfin, cette approche a été adaptée pour modifier d’autres sous-ensembles hématopoïétiques, à savoir T cellules^12,23,24; l’avènement d’efficaces approches d’immunothérapie de lymphocytes T s’est appuyé fortement sur la même plateforme de LV utilisée dans le présent protocole. Ces méthodes conviennent à tout chercheur intéressé en biologie HSPC ou modification de gènes LV. Par exemple, le protocole de purification HSPC présenté ici pourrait servir à caractériser les nouveaux sous-ensembles HSC enrichi, comme décrit plus haut^1,15,25. De même, la transduction LV méthodes présentées ici pourraient de même être appliquée et développée pour de nombreux autres types de cellules et les questions expérimentales, aussi bien dans des modèles in vitro et in vivo.

En résumé, nous présentons des méthodes pour isoler et modifier génétiquement le PSN HSPCs. Ces méthodes peuvent être facilement adaptées pour les autres espèces et d’autres sources de HSPCs. Ce protocole soigneusement contrôlé est très prometteur dans la modélisation des thérapies efficaces pour nombreuses maladies humaines.