Live Cell Analysis of Shear Stress on <em>Pseudomonas aeruginosa</em> Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Arin L. Sutlief; Helena Valquier-Flynn; Christina Wilson; Marco Perez; Hunter Kleinschmidt; Brett J. Schofield; Elizabeth Delmain; Andrea E. Holmes; Christopher D. Wentworth

doi:10.3791/58926

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioengineering

Canlı hücre analizi, yamultma stres bir otomatik yüksek üretilen iş mikrosıvısal sistemi kullanarak Pseudomonas aeruginosa

Published: January 16, 2019

doi:

10.3791/58926

Arin L. Sutlief*¹, Helena Valquier-Flynn¹, Christina Wilson¹, Marco Perez¹, Hunter Kleinschmidt², Brett J. Schofield², Elizabeth Delmain³, Andrea E. Holmes¹, Christopher D. Wentworth*⁴

¹Department of Chemistry,Doane University, ²Department of Biology,Doane University, ³Department of Pathology and Microbiology,University of Nebraska Medical Center, ⁴Department of Physics and Engineering,Doane University

Summary

Burada, Pseudomonas aeruginosa biyofilmler araç da dahil olmak üzere yeşil flüoresan proteinler ifade üzerinde kesme stres etkileri analizi için floresan mikroskop ile birleştiğinde bir akışı sağlayarak daha yüksek mikrosıvısal biyoreaktör kullanımını açıklar biyofilm kapsamı, büyüme oranı ve morfolojik özellikleri belirlenmesi, ayarla.

Abstract

Floresans mikroskobu ile birleştiğinde bir akışı sağlayarak daha yüksek mikrosıvısal vitro biyoreaktör bakteriyel biyofilm büyüme ve morfoloji, Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) dahil olmak üzere çalışmaya kullanılmıştır. Burada, büyüme kinetik ve yüzey pürüzlülüğü ve dokusal entropi P. aeruginosa baskı gelişmiş bir yeşil flüoresan protein (PA01-EGFP ifade eden PA01 gibi morfolojik özellikleri çalışmaya sistem nasıl kullanılacağını anlatacağım ). Detaylı bir protokol büyümeye ve PA01-EGFP kültürler tohum nasıl anlatacağım, nasıl ayarlamak için mikroskop ve autorun ve büyüme oranı ve morfolojik özellikleri tarafından denetlenir kesme kuvvetleri çeşitli kullanarak belirlemek için görüntü analizi yapmak mikrosıvısal aygıt. Bu makalenin sonunda diğer suşların bakteri, mantar veya yosun biyofilmler mikrosıvısal platformu kullanarak doğru uygulanabilen PA01-EGFP biyofilmler çalışma geliştirmek için bir teknik ayrıntılı bir açıklamasını sağlar.

Introduction

Burada, floresan oluşumu kesme stres etkisini ölçmek için bir yöntem gösterecek bir otomatik akışı sağlayarak daha yüksek mikrosıvısal sistemi kullanarak Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) PA01 biyofilmler.

Biyofilmler bakteri, bir destek için eklenir ve genellikle bir sıvı ve katı yüzey¹arasında arayüz, bulunan hücre dışı bir Polimer madde tarafından düzenlenen gibi mikroorganizmaların topluluklar vardır. ²^,³iyileştirilmesi su kalitesi su hatlarının ve inatçı biyoremidasyon bileşikleri gibi bu biyofilm toplulukların çevreye, yararlı olabilir. Ancak, biyofilmler de son derece istenmeyen sonuçlar ile insan sağlığı için zararlı olabilir. Örneğin, tıbbi cihazlar, implantlar, kalça ve diz gibi nerede biyofilm birikimi bir mücadele vardı ve ciddi sağlık komplikasyonlar⁴^,⁵nedenleri yüzey bir türüdür. Biyofilmler doğal su sistemleri, nehirler ve göller, gibi girin ve enfeksiyonlar⁶^,⁷^,⁸‘ kaynaklanan içme suyundaki bakteri kirlenme önde gelen su boruları sızmak. Deniz ortamlarda oluşan biyofilmler gemiler ve diğer insan yapımı yüzeylerde uygun ve artan sürtünme yakıt tüketimi⁹^,¹⁰artırmak için yol açar gibi büyük bir ekonomik ve çevresel sorun mevcut. Antimikrobiyal astarlar, Tribülitin gibi bu sorunları önlemek için geliştirilmiştir ancak deniz yaşamı¹¹‘ e zehirlidir.

P. aeruginosa ile yüksek gelişen yeteneklilik içinde a değişiklik-in çevre ve nutrimental koşulları¹²gram-negatif bir bakteridir. P. aeruginosa ortak topluluk ve hastane edinsel enfeksiyonlar nedeni ve yakından olmak yaralanmalar, ciddi yanıklar ve immün ana bilgisayarlar, gibi gibi kistik fibrozis (CF)⁵^,¹²^{ile ilişkili bulundu,} ¹³, AIDS ve kanser hastaları⁵^,¹³. P. aeruginosa biyofilmler oluşumu en ciddi CF, kronik akciğer enfeksiyonları bu hastalık⁵ölüm önde gelen nedenidir nerede için bağlı olmuştur.

P. aeruginosa, PA01, başvuru suşu bu raporda kullanılan ve genetik olarak geliştirilmiş bir yeşil flüoresan protein (PA-EGFP) hızlı şekilde değiştirilir. EGFP floresan mikroskopi¹⁴^,¹⁵^,¹⁶kullanarak situ biyofilm analiz için izin veren bir mutant formu GFP ile büyük floresans özelliklerini temsil eder. Hücre büyümesi ve işlev¹⁷ile önemli ölçüde GFP müdahale değil çünkü bu türde bir floresan çözümlemesini biyofilmler çalışma için avantajlıdır. Örneğin, GFP ile öğesini Escherichia coli hücreleri herhangi bir toksik etkisi ile karşılaştırıldığında denetim bakteri¹⁷acı olmadan iyi ve sürekli olarak büyüdü. Diğer raporlar bu iddia¹⁸^,¹⁹^,²⁰kanıtlamak. Ayrıca, floresan muhabir EGFP gibi hızlı ve basit kullanmaktır, henüz ölü hücreleri hızlı bir şekilde²¹bulabilsem sona çünkü sadece canlı hücreleri ölçülecektir.

Biyofilmler farklı akış oranları olanlar dahil olmak üzere çeşitli çevresel koşullar altında büyüyebilir. Örneğin, filmler yüksek shear stres gibi yüksek su akışı koşulları için büyük bir mikrobiyal çeşitlilik²²nereye nehirler, büyüyebilir. Aksine, ayakta su havuzları veya sözlü biyofilmler deneyim bir çok daha düşük kesme kuvvetleri²³. Akış oranına ek olarak, orada biyofilm yapışma, yüzey pürüzlülüğü ve hydrophobicity, medya kompozisyon, dahil olmak üzere etkileyen diğer faktörler ve hatta bakteriyel hücre yüzey¹^,⁴^,⁷^, ²⁴. koşulları da neden olabilir değişim kayma yapısı veya morfolojisi bir biyofilm. Bu makaslama hareketli sıvı tarafından sarf stres gibi çevre koşulları içerir veya degradeler besin kullanılabilirlik ve tür gibi biyolojik faktörler spesifik proteinlerin hücre dışı içinde mevcut sistem ve hücreleri hareket mevcut Polimer madde²⁵^,²⁶^,²⁷. Bazı koşullarda, biyofilm çim gibi olacak (pürüzsüz ve düz), süre diğer koşullarda biyofilm kaba, kabarık ya da mantar gibi²⁸. Biyofilm çimlere ve mantar yapıları arasındaki nitel farkı açıkça mikroskobik Albümdeki görülebilir iken, film yapısı ve filmin içinde Biyolojik süreçler arasındaki ilişkiyi anlamak sistematik ve nicel gerektirir morfolojisi açıklayan yöntemleri. Morfolojik özellikleri çalışma için araştırmacılar tarafından önerilen içerir gözeneklilik, Fraktal boyut, diffusional uzunluğu, terkedilemeyen, microcolony cilt, pürüzlülük katsayısı ve dokusal entropi²⁹^,^{30 microcolony alan}.

Biyoreaktörler biyofilmler çalışmada gerçek hayat koşulları³¹taklit etmek için kullanılır. Damla Akış reaktörler (DFR) nerede besin medya yavaş yavaş bir yüzeye bir biyofilm ile yüksek hücre yoğunluğu³²oluşturmak için zaman içinde bağlama hücreler boyunca akışı düşük-makaslama ortamı temsil eder. CDC reaktörler ortam içinde sürekli olarak dönen bir karıştırma çubuk kontrolünü tarafından yüksek shear stres sıvı ortam oluşturmak Biyoreaktörler tank³³dolu vardır. Bu tür Biyoreaktörler kurmak basit, ama nispeten düşük örnek boyutu, medya, medya damla akar damla Akış reaktörler için 125 µL/dakika arasında değişen üretilen biyolojik atık büyük miktarda yüksek tüketim nedeniyle kapsam içinde sınırlıdır daha–dan 1 mL/dk’ya için CDC reaktörler ve Züccaciye Mağazaları ve atık medya³⁴otoklav büyük miktarda gerek. Biyofilmler eşit bir damla akış reaktör yüzey üzerinde P. aeruginosa bakteri nin şirketler büyük bu nedenle izleyen medya düşük kesme nedenleri, biyofilm büyüme çok düzgün değil ve düzensiz örnekleri olamaz çünkü büyümek değil kolayca floresans mikroskobu³⁵^,³⁶ ile analiz.

Bazı ortak biyoreaktör sınırlamalar nerede sadece medya mililitre gereklidir ve reaksiyon plakaları ısıyla³⁷sonra küçük ve kolayca tek kullanımlık bir orta-den geçerek mikrosıvısal biyoreaktör kullanarak üstesinden vardır. Ayrıca, kuyu sayısına bağlı olarak, birçok çoğaltmalar koş, yeterli miktarda anlamlı istatistiksel analizi yapmak için veri sağlayan bir reaktörde gerçekleştirilebilir. Şekil 1‘ de, sıcaklık da dahil olmak üzere denetlenen koşullar için izin ve akış hızı³⁸^,³⁹^,⁴⁰, farklı mikrosıvısal mikroskobu sisteminin bileşenleri gösterilir. Biyoreaktör düşük ortamlarda veya Biyomedikal alanında karşılaşılan daha gerçekçi senaryolar taklit yüksek kesme koşulları uygulanan PA01 altında EGFP etiketinde floresans görselleştirmek için floresans mikroskobu ile birleştirilmiştir.

Resim 1 : Mikrosıvısal sisteminin bireysel bileşenleri. Bireysel bileşenleri soldan sağa doğru listelenir: 1. CCD kamera, 2. yüksek çözünürlük ters mikroskopla otomatik sahne, otomatik floresans modülü ve otofokus modül, 3. plaka evre, 4: görüntüleme sistemi arabirimi, 5: manuel mikroskop sahne Kontrol, 6: Buhar kapanı, 7: görüntüleme sistemi denetleyicisi (dahil olmak üzere sıcaklık denetleyicisi), 8: Donanım kontrolörleri, 9: floresan denetleyicisi, 10: kesintisiz güç kaynağı, 11: harici sabit sürücü görüntü saklamak için 12: PC iş istasyonu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bir alıntıyı mikrosıvısal plaka Şekil 2‘ de gösterilmiştir. En sık kullanılan plakalar 48 kuyu oluşur. Bir deneme gerektirir bir giriş ve bir çıkış wells, toplam 2 Wells. Böylece bakteri suşları gibi çeşitli deneysel koşullarda gerçekleştirilen 24 eşzamanlı deneyler için antimikrobiyal tedaviler ve medya Kanal Kanal çeşitli ve yamultma akışı altı kanal, her sütun için kontrol edilir. Deneysel sıcaklık da plaka boyunca bir sıcaklık ayarıyla denetlenir. Mikrosıvısal kanalları her kanal yeterli geri dönüş basıncı ve kontrollü kayma sağlamak için yılan gibi bir bölge vardır.

Resim 2: mikrosıvısal kanalları ve görüş pencere görselleştirme. İki giriş ve çıkış wells ile onları bağlayan mikrosıvısal kanalları ile kırmızı ve yeşil boya vurgulanmıştır. Boya bir yılan gibi bölge yeterli geri dönüş basıncı ve kontrollü kayma sırasında sıvı akış oluşturan her kanaldaki görünür yapar. Her kanalının (içinde kırmızı daire) ile istenilen dalga boylarında yansıması. Parlak alan (üst) ve floresan (alt) gösterilmiştir tek kanalı ile 20 X amacı istimal PA01-EGFP biyofilm görüntülerini mikroskobu. Ölçek çubuğu 80 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bir adım adım kılavuz farklı kesme ortamları kullanarak roman biyofilm deney için floresans mikroskobu ile birleştiğinde mikrosıvısal Biyoreaktörler kullanıcılarının olanak tanımak için sağlanmıştır. Bu yöntem diğer mikroorganizmalar bakteriler, mantarlar ve tıbbi ve çevresel uygulamaları⁴¹^,⁴²^,⁴³olan yosun gibi yanı sıra içeren deneyler genişlemesi için izin verir. Detaylı yaklaşım PA01-EGFP kültür, 48-şey plaka aşılamak ve mikrosıvısal cihaz ve yazılım ayarlamak, Floresan Mikroskobu hazırlayın ve biyofilm kapsamı, büyüme oranı, edinmek için yazılım analiz göstermek açıklar ve Yüzey pürüzlülük gibi morfolojik özellikleri.

Protocol

1. medyası hazırlama En az medya (MM) %0,25 ile glikoz hazırlayın. Mm 1 L % 0.25 glikoz ile yapmak için su son hacmi 1 L. (dH2O) 200 mL steril M9 tuz çözeltisi, 2 mL steril 1 M MgSO4, steril 1 M CaCl2100 µL ve 12,5 mL steril (w/v) glikoz ekleyin Gerekli ortam steril teknikleri kullanarak bir steril şişe transfer. Miktarı kullanılan kanal sayısına bağlı olarak gerekli hazırlayın. Genellikle, her kanal için astar, tohum ve 1300 µL 24 h deneme için için 300 µL 200 µL gerektirir. Bir inkübatöre veya su banyosu deneysel sıcaklık ayarla şişe yerleştirin. Medya içinde Mikro şekillendirme kabarcıklar önlemek için kullanmadan önce deneme sıcaklığında olmalıdır. 2. PA01-EGFP bir gecede ve deneysel kültürünün hazırlanması. Deneysel medya 15 mL steril bir tabancan şişesi yerleştirin ve bir ya da iki koloniler PA01-EGFP ile çizgili bir agar plaka ile aşılamak. Kültür için bir kuluçka makinesi/shaker tablo 37 ° C ve 180-220 rpm, 12-16 h genişletin. Gecede kültür OD600 ölçmek. OD600 0,80 büyük olduğunda, gecede kültür için son OD kullanım taze MM. yeri bir inkübatöre veya su banyosu deneysel kültüründe mikrosıvısal kanalları tohum için ihtiyaç kadar 37 ° C’de 0,8 oranında seyreltin. OD600 tekrar tohum önce hemen bu önemli ölçüde hedef OD600, 0,8 Bu durumda değişmediğini emin olmak için denetleyin. 3. ekipman başlangıç Şekil 1′ deki kurulum için benzer kullanıcı kılavuzuna göre sistem istasyonu ayarlayın. Yazılım enstrümanın bağlantısındaki bir hatanın oluşmaması için aşağıdaki sırada enstrüman açın:PC iş istasyonuFloresans modülü. Floresans çekim (mavi ışıkla Obtüratör butonuna) açık olduğundan emin olunDonanım denetleyicileriGörüntüleme sistemi denetleyicisi ( Tablo malzemelerigörmek)CCD kameraGörüntüleme İstasyonu (mikroskop)Not: Ateşli tabağı sıcaklığını istenilen deneysel sıcaklık için ayarlanmalıdır. Denetim uygulamayı başlatmak ve plaka yan tarafındaki etikette yer alan plaka numarası girin.Not: denetim uygulama başladıktan sonra orada-ecek var olmak iki ayrı uygulama windows, mikroskop/görüntüleme yazılımı denetleyen yazılım diğeri pompa ve iyi-plaka arabirimi denetimleri denetim modülü için. Bu nerede “Çok boyutlu edinme” menü üstte açıktır ve kontrol modülü için bir autorun üstünde belgili tanımlık dip ayarlanır Şekil S1, gösterilir. 4. astar ve mikrosıvısal plaka tohumlama Not: Astar, tohumlama, bakteriyel eki ve büyüme Şekil 3′ te gösterilmiştir. 48-şey mikrosıvısal plaka alt plaka cam yüzey dokunmak emin paketinden çıkarın. Cam slayt alt plaka bir objektif doku, tüysüz ücretsiz bez veya düşük-tüysüz mendil ile iyi temizle. Mikrosıvısal kanalları hazırlamak için 37 ° c MM 200 µL çıkış, kabarcıklar önlemek için dikkatli olmak pipet. Plaka plaka sahne alanı yerleştirin ve etanol, plaka sahneye sızdırmazlık önce kurumasını sağlayan arabirimiyle silin. Manuel mod kontrol modülü üzerinde sıvı LB 37 ° C ve Max kayma 5,00 din/cm2′ de ayarla. Giriş çıkış akış, etkinleştirmek için çıkış wells kanalları priming’ı tıklatın. Priming 5 dk sonra tohum için hazırlamak için akışı duraklatın. Dikkatle plaka sahne alanı’ndan kaldırın ve çıktı ama herhangi bir medya değil mikrosıvısal kanallara giden iç daire izale artık medyadan pipet. İlk 300 MM µL de iyi çıktı de çıkış içine bakteri kültürü pipetting 300 µL tarafından takip giriş içine pipet deneysel kanalları temel için. Plaka plaka üzerinde yerleştirmeden önce arabirim silmek emin plaka sahne içine koyun. Mikroskop sahne plaka sahneye koyduktan sonra yem canlı kamera kullanarak tek bir kanal kontrol modülü üzerinde odaklanmak. Görsel olarak tarafından canlı yayın izleme sırasında akış 1,00-2.00 din/cm2 yılan gibi kanalları değil, ancak yaklaşık 2-4 s hücreleri deneysel kanal girmek izin vermek için devam edin. Hücre eki için izin vermek 1 h için sıcaklık kontrollü sahnede plaka bırakın. 1 h kuluçka sırasında belgili tanımlık autorun (adım 5) kontrol modülü ve montaj yazılım ayarlanabilir.Not: en iyi duruma getirilmiş kadar genel bir zaman dilimi kullanılan canlı yayın tarafından yakından izlenmeli bu yüzden tohum için gereken süreyi medya ve organizma, ile değişir. Plaka tohum tam tohum için hangi kanalları belirli sütunlara uygulanan akışının daha fazla zaman gerektirecektir değişebilir. Ek süre sonra yavaşça plaka sahne alanı’ndan kaldırın ve ilk kanal rahatsız edici kaçınarak çıkış bakterilerden pipette. Yeni bir pipet ucu ile giriş kuyulardan medyayı çıkarın. Şekil 3 : Astar, tohum ve PA01-EGFP ek olarak mikrosıvısal kanalları deneysel bakış. Astar, tohum ve eki anlattı. Astar ilk adım çıktısına tanıttı taze medya gerektirir. Tohumlama gerektirdiği giriş medya ve bakteriyel kültür hacimleri eşit ve wells, sırasıyla çıktı. Kültür, serpantin kanalları tıkanmasını önlemek için deneysel kanal (kırmızı çizgi) görüntüleme segment geçmek değil. Kuluçka dönemi bittikten sonra taze medya izleme odası ve prize sürekli olarak girişten akar. Bu eki ve biyofilm bakteri oluşumunu başlatır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 5. belgili tanımlık bilgisayar yazılımı ayarlama Yazılım, “mikroskop resim alma denetlemek için,Birden çok boyutlu edinme” açın. “Ana” menüsünün altında “Timelapse”, “Birden çok sahne pozisyonlar” ve “Birden çok dalga boylarında” (Şekil S1A) seçin. Ayarları kaydetme kurulumunu dosya varsa artışı temel adı seçeneğinin işaretli olduğundan emin yapma basit Temel adı, oluşturun. Tüm dosyalar kaydedilir klasörü seçmek için Dizin Seç’i tıklatın. Deneme temel ayrıntıları Açıklamaiçerir. Timelapse sekmesi altında 24 h deneysel zaman süresi ayarlayın. Görüntüleri ne kadar sıklıkla kontrol etmek için elde, her 5 dk boyunca deneme görüntüleri elde bu yüzden Zaman aralığını ayarlayın. Zaman puan sayısı ile parametreleri ayarlama otomatik olarak ayarlar. Sahne pozisyonları doğru yerleştirme ve odak için izin parlak alan mikroskop içerik canlı kamera kullanarak ayarlayın. 10 X amacı ile başlangıç, plaka üzerinde oyulmuş kanal numaraları altında veya üstünde bulunan kanal merkezinde odaklanın. En iyi görüntüleme alanı ve odak düzlemi içinde kanal bulma 20 X amaç geçin. Pozisyon listeye eklemek veya hazır ayar Kanal konumu yeni ayarlarla değiştirmek. Dalga boylarında menüsünün altında dalga boylarında sayısını 3’e ayarlayın. 1 (W1) dalga boyu için FITC % 100 CAM 10 ms çekim hızı ile seçin. Yani dalga boyu 2 (W2), seçmek için aydınlık alan % 50 CAM % 50 VIS 3 Bayan Tüm kapalı filtre ayarlamak için dalga boyu 3 (W3), en az pozlama süresi ile ışık edinme kez arasında geçen kanal üzerinde kalır. Kontrol modülü ayarlarken, koşmak belgili tanımlık elle yapılan durdurdu emin olmak için denetleyin. İletişim kuralı Kur sekmesinin altındaki Düzenle Autorun menüsünde Yeni bir iletişim kuralı için 24 saat süre zaman, istenen kesme hızında ileriye doğru yönde akan ayarlayın. Kesme hızı kesme oranı ile biyofilm büyüme etkisini incelemek için zengindir. Ekle ve Farklı kaydet iletişim kuralı tıklatın. Sıra Kur sekmesi altında bulunan tüm kanallar için varsayılan sıvı olarak LB@37degrees seçerek yeni bir sıra oluşturmak. Adım yineleme 1, Kanal 1-12, altında tüm kanallar istenen kesme hızı ve Etkinleştir protokolü seçin. 13-24, kanallar için ikinci istenen kesme hızı ve etkinleştirmek protokolüyle tüm kanalları seçin. Uygula ve Farklı kaydet sırası seçin. Autorun autorun için kullanılacak kaydedilmiş sırası menü. 6. biyofilm büyüme deneme kurulumu zaman aşımına uğradı En fazla 1.300 µL steril mm giriş de mikrosıvısal plaka pipette. Plaka sahne geri tabağa yerleştirin ve etanol etanol plaka sızdırmazlık önce kurumasını sağlayan, arabirimiyle silin. Plaka yerleştirerek mikroskop sahneye sahne ve protokollerini emin olun ve sequence(s) doğru şekilde ayarlanır. Mikroskop imge toplama başlatmak için Al ‘ ı tıklatarak hızlı bir şekilde takip autorun başlatmak için Başlat ‘ ı seçin. Odak ve görüntü acquirements arasında tüm sahne pozisyonlar yerleşimini ayarlayın. Duraklat seçin ve canlı görüntü modu parlak alan dalga boyu kullanılarak, her aşamada pozisyonları görüntülemek için Gitmek seçin. Yeni ayarlar geçerli ayarlaseçerek ayarlayın. Bir sonraki zamanlanmış satın alma sırasında önce Sürdür ‘ ü tıklatın. 7. gözden geçirin ve görüntü sıralarını zamanlanmış biyofilm büyüme deneyden sonra analiz Her kanal 24 saat takip incelemek için autorun, yazılım, açın Gözden geçirmek çok boyutlu veri Çözümleme araçları’ nın altındaki. Tıkırtı üstünde seçin temel eğe | Dizini seçin görüntü sıralarını deney ilgi ile klasöre gidin. Veri kümesi oluşturduğunuz klasör listesinde, veri ilgi temel adını seçin. Faiz veri seçildikten sonra bu verileri gözden geçirmek için görünümü ‘ nü tıklatın. Dalga dalga boyu pencere (Şekil S2) altında bu verileri gözden geçirmek için seçin. Bir daha gözden geçirme (görüntüleri her 5 dk 24 h saat çerçevenin üzerine elde edilen varsayarak) görüntü sırası Sahne konum’un altında kanal numarası seçerek ve 289 kez için verileri çözümlemek için video kontrolleri kullanarak her kanal için puan. Kullanışlı büyüme veri dikkat edin.Not: her kanalda, hava kabarcıklarının ve biyofilm büyüme verileri etkilemeden kanal içinde rahatsız etmeyecek takunya gelişimi için dikkat et. Bunlar daha sonra bu şartlar önce çalışma, verileri oluşursa ancak, yararlı bulunabilir. Gözden geçirme ve çözümleme için istenen veri seçme sonra her kanal için görüntülerin yığınlar oluşturun. Dosya altında açık özel menü | Yığını oluşturmak | Adları sayılı. Yığını oluşturmak penceresinde, İlk görüntü Seç butonunu seçin, ardından dosya klasöründe yığını için ilk resmi seçin; Son görüntü Seç düğmesini seçin ve sonra son görüntü yığınında karşılık gelen dosyayı seçin. Kronolojik olarak kanal tüm görüntüleri ile yığın açmak için Tamam ‘ ı tıklatın. Yığınlar, Dosya menüsündeki Farklı kaydet TIFF dosyaları olarak kaydedilebilir.Not: yığınları ile başparmak görüntüleri oluşturun. Bu dosyalar çok yararlı değildir ve sabit diskinizde yer kazanmak için silinebilir. Ayrıca, görüntü dosyaları aşağıdaki gibi kaydedilir:TEMEL NAME_WAVELENGTH_sCHANNEL #_tIMAGE #.Örneğin, 07062018_W1FITC 100_s12_t112 Kanal 12, süresi noktası 112, görüntü ilk dalga boyu-FITC % 100 kamera veri taban adı “07062018” ile olur. Son olarak, sıra bir TIFF yığını olarak kaydetmek için Dosya açılan menüsünden Farklı Kaydet’i seçin. Yığınlar da overlaid ve film olarak kaydedilir. Bu adım 9 ele olduğunu. % Yüzey kapsama miktarının önce görüntü mesafeler kalibre edin. Çözümleme araçları’ nın altında Kalibre mesafelerüzerinde’yi tıklatın. Uygun kalibrasyon ölçüm seçin ve tüm görüntüleri aç Uygula’ yı tıklatın. Yığın sırası ilk görüntü üzerinde olmakla birlikte, eşik butonuna tıklayın. Otomatik eşik ışık nesneler için eşik için eşik parlak alanındaki floresan sinyal (FITC dalga boyları) ve Karanlık nesneler için otomatik eşik için kullanın. Görüntü kapsama temsil eden kapsama için eşik ayarlayın. Floresan eşikleri için herhangi bir arka plan sinyal ve hücreleri sinyal ölçüm sağlamak için yapar bunlar sigara floresan içeren kanallarında sinyal dışlamak için minimum eşik değeri tespit seti kurmak olmayan floresan hücreleri ile bir kanalı kullanmak floresans alan abartma değil. Dolayısıyla en az bir, kullanmak için iyi bir fikir değil daha, kanal (lar), floresan sigara denetimlerinde bu koş koş farklı olabilir. Tüm hücreleri tarafından turuncu eşik imza kapsamına girmez, parlak alan eşikler, kayan araç çubuğu veya tüm hücreleri ( Çözümleme araçları’ nın altında bulunur) Eşik görüntü kullanılarak en fazla eşik değeri ayarlamak Ama kapalı herhangi bir arka plan söz konusu değildir.Not: Bu eşik değerler ideal bir yığın içinde tüm görüntüler için ve tüm kanallar için kullanılacak, bir görüntü/kanal için seçili eşik değerleri bu nedenle Kullanıcı eşik aralığı ayarlamanız gerekebilir diğer görüntüleri veya kanal için uygun olmayabilir düzenli olarak. Bu nedenle, her zaman en fazla kaydetmek için iyi bir fikirdir ve kullanılan minimum eşik değerleri veri daha sonra gözden geçirilmesi gerek gerekir. Çözümleme araçları’ nın altında kapsama ölçmek için Bölge istatistikleri göster’itıklatın. Kullanım eşik , Tüm resim seçili denetlendiğinden emin olun ve Veri eldealtında istediğiniz ölçüleri/ayarları seçilir emin olun (eşik alan, ortalama, standart sapma, min, max ve % eşik alan). Açık oturum aç’ı tıklatın ve Tamam’ ı tıklatmadan önce DDE dosya seçili olduğundan emin olun. Microsoft Excel’i seçin ve Tamam’ ı tıklatın. Elektronik tabloda bu açık, otomatik olarak görüntü analiz ediliyor ölçümleri kaydetmek için Günlük verilerini ‘ ı tıklatın. Bu elektronik tablo açık bırakarak, aynı sayfadaki tüm görüntü analiz verileri tek bir yığın için toplamak için kullanın. Yığın içinde dördüncü resim ve eşik için en iyi ayarları gidin. Günlük verilerini üzerinde Bölge istatistikleri göster ekran’ı tıklatın ve değerleri elektronik tabloda günlüğe kaydedilir. Bu her 15dk görüntüleri analiz için işlemi yineleyin. 8. diğer analizi de dahil olmak üzere Morfoloji ve yüzey kapsama ölçü kullanarak Python komut dosyaları biyofilm morfoloji Suite Anaconda, https://www.anaconda.com/download kullanılabilir gibi bir standart bilimsel Python dağılımı kullanarak standart bilimsel modüller içerir Python 3.6 bir dağıtımını yükleyin. Biyofilm morfoloji Suite GitHub bir tarayıcıda https://github.com/cdwentworth/Biofilm-Morphology-Suite.git için gezinme tarafından elde sonra klon ya da download (yeşil düğmeye) seçin ve Download Zipseçin. Unzip belgili tanımlık eğe ve kod klasörleri çalışma dizinine taşıyın. Yüzde thresholded kapsama görüntü yığını “kapsam” klasörüne kopyalayarak ölçmek. Bu klasöre gidin ve sonra komutu ile komut dosyasını çalıştırmak için bir terminal penceresi kullanınPython bfCoverage.py tiffStackName.tifkomut satırı burada tiffStackName.tif görüntüleri TIFF yığını içeren dosya adıdır arabiriminden. Zaman bir fonksiyonu adı ile oluşturulacak gibi her zaman bir noktada kapsamı ölçümleri içeren bir metin dosyası adı tiffStackName.txt ve kapsamının bir arsa ile bir grafik dosyası oluşturulur tiffStackName.png. Diğer morfolojik özelliklerini ölçmek için 8.3. adımda belirtilen aynı yordamı kullanın: biyofilm birikimi, pürüzlülük katsayısı ve dokusal entropi. Birikimi ölçüm için bfAcc.py komut dosyası, pürüzlülük katsayısı ölçüm için roughCoef.py komut dosyası ve TEvsTime.py komut dosyası dokusal entropi ölçüm için kullanın. 9. diğer yazılım uygulamaları – bindirmeleri ve film yapım Birden çok dalga boylarında kullandıysanız, bu dalga boylarında da dahil olmak üzere bindirme yığınlar oluşturun. Tüm yığınları ilgi açın ve mesafe adım 7,6 olarak kalibre. Çözümleme araçları’ nın altında Overlay görüntüleriseçin. Kaynakları faiz yığınlar ayarlayın. FITC yığını, gökkuşağı yuvarlağına tıklatın ve yeşil renk filtresi bu dalga boyu vurgulamak için eklemek için seçin. Bal FITC yığın Albümdeki bariz bindirmeyi ayarlamak için kullanın. Tüm ayarlamalar yaptıktan sonra Tüm uçaklar her iki yığınlar için seçin ve Uygula’ yı tıklatın. 7.5. adımda anlatılan yığınları veya 9.2. adımda anlatıldığı bir film olarak aynı şekilde bindirmeleri kaydedin. Yığınları veya bindirmeleri MM standart ve yığın, altında bir timelapse film olarak kaydetmek için Yapmak filmüzerinde tıklatın. Kaynak yığını veya istenilen kaplama seçin. Kaydet ‘ i tıklatın ve 70-80 arası ayarla bir kalite ile bir Microsoft Video 1 olarak kaydedin.

Representative Results

Şekil 4 bir yüzde thresholded alan zaman içinde 24 h 0,2, 0.5 ve 1.0 din/cm2kesme akışının çalıştırmak gösterilmiştir. Biyofilm kapsama veya yüzde eşik yüzey alanı (C [%]) için tüm üç kesme ayarları farklı. Biyofilm kapsama nerede eşik alan 2-%5 100 artış 1.0 din/cm2 kesme en hızlı büyüme % 200 dk sonra ve durağan faz 400 dk sonra ulaştı. 0.5 din/cm2, biyofilm kapsamı ertelendi ve 400 dk % 100 kapsama 800 dakika sonra ulaşan artmaya başladı. En düşük fiyat makas 0.2 din/cm2 nerede yüzde kapsama 500 dk az artmaya başladı ama hiç olarak % 65 eşik alanı ulaştı biyofilm kapsamı, en yavaş artış sergilenmez. Bu sonuçlar kesme biyofilm yüzey kapsamında doğrudan bir etkisi vardı belirtti. Daha yüksek kesme gerçeğini biyofilm daha hızlı prolifere daha fazla besin bakterilerle medya sağlanan nedeniyle muhtemelen biyofilm büyüme için daha iyi bir durum gibi görünüyordu. Şekil 4: 0,2, 0.5 ve 1.0 din/cm2 üzerinde 24 h saat dönemi’ni kullanarak zamanla yüzde eşik alanı, toplam biyofilm birikimi, pürüzlülük katsayısı ve dokusal entropi. a) yüzde eşik alan (C [%]). Veri her kesme koşul bir kanal üzerinden elde edildi. b) biyofilm birikimi (göreli ölçümü) 0,2, 0.5 ve 1.0 din/cm2 üzerinde 24 h saat dönemi’ni kullanarak zaman bir fonksiyonu toplam. En küçük kareler uyan üstel bir model siyah çizgilerdir. Veri her kesme koşul bir kanal üzerinden elde edildi. c) PA01-EGFP pürüzlülük katsayısı 0,2, 0.5 ve 1.0 din/cm kesme stres değerleri kullanarak üzerinde 24 h veri izlenen2 her kesme koşul bir kanal üzerinden elde edildi. d) PA01-EGFP dokusal entropi 0,2, 0.5 ve 1.0 din/cm2. kesme stres değerleri kullanarak Her kesme koşul bir kanal üzerinden elde edilen veriler (Valquier-Flynn, H., Sutlief, al, Wentworth, C.D., 2018). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4 b Şekil 4biriçinde gösterilen bulguları ile tutarlıdır. Biyofilm birikimi (N[rel]) görüntüdeki bir noktada GFP sinyal canlı hücre yoğunluğu o konumdaki orantılıdır varsayımına göre ölçüldü. Toplam göreli ölçüm biyofilm birikimi 0,2, 0.5 ve 1.0 din/cm2 üzerinde 24 h zaman dilimi kullanarak zaman bir fonksiyonu olarak artmış ve büyüme oranı en yüksek kesme stresten en düşük kesme stres için reddetti gösterir. Üstel büyüme içinden bir kantitatif büyüme oranı hesaplanabilir veren açık bir dönem vardır. Şekil 4 c pürüzlülük katsayısı (Rbir) 0,2, 0.5 ve 1.0 din/cm2kesme akışının gösterir. Yüzey pürüzlülüğü, pürüzlülük katsayısı tarafından sayısal film kalınlığı profilde varyansını ölçer. Resmi tanımı ortalama kalınlık Tben ben-th kalınlığı ölçümü, Tbir nerede olduğunu ve N kalınlık ölçüm30sayısıdır. Bu araştırmada açıklanan yordamı canlı hücreler ile ilişkili kalınlık ölçer. Birden büyük bir pürüzlülük katsayısı üzerinden ortalama kalınlığı önemli farklılıklar ortaya çıkarır ise düz bir düzenleme hücrelerin pürüzlülük katsayısı sıfır ortaya çıkarır. Benzer şekilde büyüme oranı ve yüzde eşik kapsama film kesme etkisi, biyofilmler zaman içinde farklı Topografyaları sergiledi. Genel olarak, Rbir bütün yüzeyleri pürüzsüz oldu gösteren tüm kesme koşulları için zamanla azalmıştır. Ancak, 0.2 din/cm en düşük kesme ile karşılaştırıldığında, daha hızlı bir makaslama akışı daha yumuşak ve daha da yüzey ve en yüksek kesme, katkıda gösteren zaman içinde daha düzgün bir yüzey daha yüksek kesme ayarları 0.5 ve 1.0 din/cm2 sonuçlandı 1.0 din/cm2 0,2 Rbirulaşan. Pürüzsüzlük, düzenli olarak veya bir yüzey kalitesizlik da dokusal entropi (TE) ifade edilebilir. TE görüntü analizinde randomness iki boyutlu bir resim derecesini ölçmek için kullanılan bir özelliktir. Onun hesaplama gri düzey ortak oluşumu matris üzerinde Haralick ve arktarafından tanımlanan temel., hangi olup bir yerde piksel değerlerini piksel değerlerini başka bir konuma44ile correlated adlı görünüyor. Korelasyon yüksek derecede düşük entropi yol açacaktır. Şekil 4 d TE 0,2, 0.5 ve 1.0 din/cm2kesme akışının yönü gösteriyor. TE kesme koşulların tümü ama 1.0 din/cm daha düşük kesme stresleri 900 dk öncesindeki maksimum TE (1.0) ulaştı en yüksek kesme stres için zaman içinde artmıştır. 0.2 din/cm2 en düşük kesme maksimum 1000 dk sonra ulaşan en düşük TE (0,8) vardı. Ancak, 0.5 din/cm2 ara kesme stres onun en büyük TE (1.2) çok yüksek veya düşük kesme stres koşulları daha sonra ulaştı. Pürüzlülük katsayısı ve TE farklı özellikler ölçmek. Düz bir film düşük pürüzlülük katsayısı ve düşük entropi gerekir iken, bir film kalınlığı önemli varyasyon ile yüksek pürüzlülük katsayısı olurdu ama düşük entropi değişimi yerine rasgele sinüsoidal ise hala olabilir. Süre TE trendleri doğrudan biyofilm oluşumu zaman içinde uygulanan stres yamultmak için ilgili değil bu durumda, Rbir artan kesme stres ve zamanla azalmıştır. Şekil S1 : Görüntü yakalama, denetim yazılımı Windows’un. Yazılım pencere ile çok boyutlu edinme yemek listesi (üst). Kontrol modülü bir AutoRun (alt) için ayarlayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil S2 Görüntü yakalama veri izlemeye yarayan yazılım. Uygulama penceresi faiz Analizi Araçlar menüsünden İnceleme çok boyutlu veri aracını kullanarak veri kümesi seçtikten sonra. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Mikrosıvısal sistemi ve görüntü analizi prosedürü burada genellikle gelen confocal bulunan tam üç boyutlu bilgi gerektirmeyen morfolojik özellikleri belirlemek için mikrosıvısal biyofilm deneyler yürütülmesi üzerinde odaklanır ele mikroskop çalışmaları. Bunlar microcolony terkedilemeyen kapsama (yüzde kapsama), yüzey pürüzlülüğü pürüzlülük katsayısı ve dokusal entropi tarafından ölçülen dahil. Toplam göreli biyofilm hücre birikimi tahmin etmek için bir yöntem de aşama günlüğünde hangi büyüme oranları üzerinden hesaplanan olamaz sunulur.

Bu yöntemde vurgulanmış olmalıdır birkaç küçük ama önemli adım vardır. Arabirimin alkolle silerek deneme deneme ama aynı zamanda iyi de bir deneyde gidiş diğer bakteri kontaminasyonu önlemek yardımcı olur. Astar ve tohum da çok önemli astar hangi kanalları medya kanalları herhangi bir rahatsızlık olmadan akışı sağlayan belirlemek kullanıcının verdiğinden veya tıkanma vardır. Kanalları da olmamalıdır hiçbir hava kabarcıkları ile başarılı bir deneme şansını artırmak için macun veya tıkanma sonra (yani onlar-meli var olmak sürekli medya tam) rahatsız. Tohumlama adım bakteri türüne göre farklı olabilir ve bu yüzden cep eki için optimize edilmelidir. Örneğin, hücreleri eklemek için görünmüyor yüzey değişiklikler Ekim tarihi öncesinde mikrosıvısal plaka üzerinde gerçekleşmesi olabilir veya daha uzun incubations zaman gerekli olabilir. Mikroskop doğru bir şekilde, odakta görüntüyü elde etmek için kurulmuş ve kaliteli görüntüler elde edilir sağlamak için deney boyunca düzenli aralıklarla izlenmelidir emin olmak önemlidir. Odak noktası kapalıysa, mikroskop olabilir ve deneme devam ederken ayarlanmalıdır. Görüntü toplama süre boyunca, son dalga boyu Tüm kapalı filtreleri ve görüntü Devralmalar arasında oluşan bekleme süresi sırasında tek bir kanal için aydınlatma maruz önlemek için ayarlanması gerekir. Ayrıca, montaj yazılımının kılavuzuna yordamı açıkça tarif değil çünkü % yüzey kapsama belirler görüntü analizi içinde ev dizayn edilmiştir. Ayrıca, görüntü analizi üzerinde genişletin ve yüzey pürüzlülüğü, vbgibi diğer özelliklerini belirlemek için., açık kaynak kodu Python tabanlı⁴⁵ içinde ev ve paylaşılan üzerindeki gitHub repository geliştirilmiştir. Ayrıca ne kadar veri saklanan ve bir harici sabit disk veya online veri paylaşımı CyVerse⁴⁶gibi gerekli değildir yerel sabit diske yönetilen sınırlamalar vardır.

CDC reaktör ve damla akış reaktör³⁴, gibi geleneksel Biyoreaktörler çok medya gerektiren, daha az sayıda örnek boyutları sağlamak ve sterilizasyon ekipman yüksek miktarda talep ediyorum. Buna ek olarak, bu daha yüksek üretilen iş platformu avantajları denetim kesme, debi, yeteneği dahil ve içinde vitro yakından deneyler varsayım vivo içinde koşullar benzer. Dezavantaj-in sistem birden fazla aksesuarları içerir ve titiz bir kurulum gerektiren yazılım olayları doğru sırayla gerçekleştirilmesi gerekir. Ayrıca, ekipman için sağlanan kılavuza deneyler ve yazılımı komutları her adımında tam olarak açıklamaz ve sonuç olarak, pek çok hata tıkanma kanalları, büyüme veya eki eksikliği de dahil olmak üzere deneyler sırasında meydana, ya da eksikliği yüksek kaliteli mikroskobu görüntüler veya filmler. Enstrüman kendisi ve mikrosıvısal tabak gibi sarf malzemeleri da plaka başına 200 $ bir fiyat etiketi ile göreceli olarak pahalı ve yeniden kullanılabilir değildir. Böylece, teknik güçlü sonuçlar oldukça rahat, kullanımı için gereken teknik uzmanlık nispeten yüksektir ve alanında uzman tarafından tekrarlanan eğitim gerektirir. Bu rapor biyofilmler özellikleri çalışma için bir kılavuz bu Biyoreaktörler, yeni kullanıcılarına sağlayarak bu sorunu çözümlemeye çalışır.

Hücresel analiz yapmak mümkün mikrosıvısal sistemi büyük ilgi için çeşitli bilimsel yöntemleri, gibi Mikrobiyoloji, immünoloji, Hematoloji, Onkoloji ve kök hücre araştırma kazanmıştır. Daha ayrıntılı olarak, teknoloji birçok yayın mikrobiyal sözlü yapışma⁴⁸etkilerini belirleme, dahil olmak üzere tıbbi uygulamalar³⁷^,⁴⁷için son derece alakalı konuları açıklama sonuçlandı biosurfactants tarihinde Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus⁴⁹^,⁵⁰, E. coli⁵¹, Streptococcus bağlılık⁵²ve tedavi patojen etkileşimlerde ev sahipliği Kistik fibrozis⁵³. Bu mikrosıvısal sistem çok yönlü olduğu gerçeği göz önüne alındığında, daha fazla sistem dünya çapında dağıtılacak öngörülmektedir.

Bazı belirli iletişim kuralı adımlar dikkatle düşünülmelidir. Medya % 50 kabarcıklar ve tıkanma önlemeye yardımcı olmak için dH₂O ile seyreltilmiş ancak bu durumda gerekli değildi. OD₆₀₀ tohum için kullanılan özel değeri kullanılan koşulları belirli kümesi için en iyi olanı görmek için bir büyüme deneme deneme ishal kullanarak belirlenmelidir. Sızdırmazlık önce kuyu kabarcıkları mikrosıvısal kanalları kabarcıkları yol açabilir ve ya attı ya her şeyi bir pipet ucu ile berbat ettin tarafından kaldırılması gerekir. Bakteri küçük yılan gibi kanal dışarı tutmak önemlidir. Akış sistemi uygulanan basınç nedeniyle sadece bu yüzden giriş ve çıkış medya eşit miktarda tohumlama işlemi sırasında yanında having, sıvı cilt baskısı nedeniyle akış kontrol edilecektir. Kalibrasyon mesafeler yüklenmesi sırasında şirket temsilcisi tarafından düzenlenmiş olmalıdır. Bu ayarlar her kamera için özeldir.

Bir resim için en iyi temsil eden eşik bulma oluşur birkaç sorun vardır. En fazla eşik değerlerinin belirlenmesi yerinde arka plan ortalama piksel yoğunluğu her iki kanal veya enkaz plaka üzerinde merkezi değil bir sahne konumunu seçerek neden tutarlı değilse zor olabilir. MM standartaltında işlem‘ i tıklatın ve sonra düzeltme bu tutarsızlıklar için arka plan ve gölgelendirme düzeltme aracını seçin. Ancak, bu araç genellikle yalnızca Kullanıcı referans görüntü olarak kullanabileceklerini görüntüleri tohum önce kanal yaparsa yararlı olur. Ya da, Eğer arka plan/başvuru gölgelendirme görüntüleri kullanılamaz, Kullanıcı kendi yargı da dahil olmak üzere tüm görüntü için arka plan olmadan en hücre alan kaplayan bir eşik değeri için kullanmanız gerekir. Alternatif olarak, tutarsızlık tıklama Dikdörtgen, Elips bölgeninveya bir bölge seçin ve Tüm yerine Etkin bölge seçmek için İzleme bölgesi bölgeleri hariç ölçmek için temsilcisi alanları seçin Görüntü Bölge istatistikleri göster penceresinde (altında Analiz araçları). Eğer bir temsilcisi bölge kullanılmaktadır eşik parlak alan görüntü için aynı bölgede karşılık gelen FITC görüntü ölçüm için kullanılmalıdır. Bu yüzden aynı bölgede bulundu temsilcisi bu bölge ile ilişkili belirli mekansal istatistik (sol, üst, Genişlik, Yükseklik, alan, çevre) kaydı yararlıdır ve karşılık gelen FITC görüntü ölçülür.

Bilgisayar yavaşlatmak neden olur sabit sürücüdeki verilere birikimini önlemek için veri depolama için bir harici sabit disk satın alınabilir. Veri depolama ve kolaylaştırıcı veri paylaşımı için başka bir seçenek CyVerse Biyoinformatik platformudur. Bir hesap için http://www.cyverse.org/ giderek CyVerse sistemde oluşturun. Bir kez logged içinde keşif çevre denize indirmek o zaman “CyVerse günlük” seçin. “Veri” seçin ve gidin klasörü sensin. Görüntü yığını yerel bilgisayar üzerinde ise “Upload” sonra “Basit Upload–dan okul sırası” seçin. Görüntü yığını dosyayı bulmak ve yüklemek için seçin. Eğer onlar-si olmak bir CyVerse rapor ve izin verilir dosya veya klasör ortak çalışanlarla paylaşılabilir. Halka verisi klasörünün paylaşım bu meta verileri olmak mülhak her dosyayı kullanmak için CyVerse standartları onaylanmış gerektirir. Bu Bu eser kapsamında olmadığı için bu yordamı burada ele alınacak değil.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser hibe tarafından Ulusal Enstitüsü’nden genel tıbbi bilim (NIGMS için) (5P20GM103427), bir bileşen, ulusal kurumları sağlık (NIH) mümkün yapıldı

Materials

Ammonium Chloride, ACS	VWR	BDH9208-500G	Part of the minimal media composition
BioFlux 1000 48 Well Low Shear Plate	Fluxion Biosciences	910-0047
BioFlux 1000Z Microfluidic Imaging System	Fluxion Biosciences	BF 1000Z
Calcium Chloride Dihydride, ACD Grade	VWR	97061-904	Part of the minimal media composition
Dextrose, Anhydrous, ACS	VWR	BDH9230-500G	Part of the minimal media composition
Magnesium Sulfate ACS Grade	VWR	EM-MX0070-1	Part of the minimal media composition
Potassium Phosphate Monobasic, ACS Grade	VWR	BDH9268-500G	Part of the minimal media composition
Pseudomonas Aeurginosa GFP	ATCC	15692GFP	Pseudomonas aeurinosa bacterial strain PA01 with GFP modification used for this study.
Sodium Chloride, ACS	VWR	BDH9286-500G	Part of the minimal media composition
Sodium Phosphate, Monobasic, Anhydrous, Reagent Grade	VWR	97061-942	Part of the minimal media composition

References

Donlan, R. M., et al. Model System for Growing and Quantifying Streptococcus pneumoniae Biofilms In Situ and in Real Time. Applied and Environmental Microbiology. 70 (8), 4980-4988 (2004).
Lührig, K., et al. Bacterial Community Analysis of Drinking Water Biofilms in Southern Sweden. Microbes and Environments. 30 (1), 99-107 (2015).
Singh, R., Paul, D., Jain, R. Biofilms: implications in bioremediation. Trends in Microbiology. 14 (9), 389-397 (2006).
Veerachamy, S., et al. Bacterial adherence and biofilm formation on medical implants: A review. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 228 (10), 1083-1099 (2014).
Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
Percival, S. L., Knapp, J. S., Edyvean, R., Wales, D. S. Biofilm Development On Stainless Steel In Mains Water. Water Research. 32 (1), 243-253 (1998).
Percival, S. L., Knapp, J. S., Wales, D. S., Edyvean, R. G. J. The effect of turbulent flow and surface roughness on biofilm formation in drinking water. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 22 (3), 152-159 (1999).
Ling, F., Whitaker, R., LeChevallier, M. W., Liu, W. -. T. Drinking water microbiome assembly induced by water stagnation. The ISME Journal. , 1 (2018).
Moss, B. Water pollution by agriculture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1491), 659-666 (2008).
Schultz, M. P., Bendick, J. A., Holm, E. R., Hertel, W. M. Economic impact of biofouling on a naval surface ship. Biofouling. 27 (1), 87-98 (2011).
Tornero, V., Hanke, G. Chemical contaminants entering the marine environment from sea-based sources: A review with a focus on European seas. Marine Pollution Bulletin. 112 (1-2), 17-38 (2016).
LaBauve, A. E., Wargo, M. J. Growth and Laboratory Maintenance of Pseudomonas aeruginosa. Current Protocols in Microbiology. 25 (1), 1-8 (2012).
He, J., et al. The broad host range pathogen Pseudomonas aeruginosa strain PA14 carries two pathogenicity islands harboring plant and animal virulence genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (8), 2530-2535 (2004).
Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R. An Enhanced Green Fluorescent Protein Allows Sensitive Detection of Gene Transfer in Mammalian Cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 227 (3), 707-711 (1996).
Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 73 (5), 2782-2790 (1997).
Chalfie, M., Tu, Y., Euskirche, G., Ward, W. W., Prashert, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
Heim, R., Prasher, D., Tsien, R. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 12501-12504 (1994).
Bakke, R., Kommedal, R., Kalvenes, S. Quantification of biofilm accumulation by an optical approach. Journal of Microbiological Methods. 44 (1), 13-26 (2001).
Heydorn, A., et al. Statistical analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm development: impact of mutations in genes involved in twitching motility, cell-to-cell signaling, and stationary-phase sigma factor expression. Applied and Environmental Microbiology. 68 (4), 2008-2017 (2002).
Wilson, E., et al. Using Fluorescence Intensity of Enhanced Green Fluorescent Protein to Quantify Pseudomonas aeruginosa. Chemosensors. 6 (21), (2018).
Fang, H., Chen, Y., Huang, L., He, G. Analysis of biofilm bacterial communities under different shear stresses using size-fractionated sediment. Scientific Reports. 7 (1), 1299 (2017).
Saunders, K. A., Greenman, J. The formation of mixed culture biofilms of oral species along a gradient of shear stress. Journal of Applied Microbiology. 89 (4), 564-572 (2001).
Valquier-Flynn, H., Wilson, C. L., Holmes, A. E., Wentworth, C. D. Growth Rate of Pseudomonas aeruginosa Biofilms on Slippery Butyl Methacrylate-Co-Ethylene Dimethacrylate (BMA-EDMA), Glass and Polycarbonate Surfaces. Journal of Biotechnology & Biomaterials. 7 (4), (2017).
Trulear, M. G., Characklis, W. G. Dynamics of biofilm processes. Journal (Water Pollution Control Federation). 54 (9), 1288-1301 (1982).
Machineni, L., Rajapantul, A., Nandamuri, V., Pawar, P. D. Influence of Nutrient Availability and Quorum Sensing on the Formation of Metabolically Inactive Microcolonies Within Structurally Heterogeneous Bacterial Biofilms: An Individual-Based 3D Cellular Automata Model. Bulletin of Mathematical Biology. 79 (3), 594-618 (2017).
Jiao, Y., et al. Identification of Biofilm Matrix-Associated Proteins from an Acid Mine Drainage Microbial Community. Applied and Environmental Microbiology. 77 (15), 5230-5237 (2011).
Flemming, H. C., Wingender, J. The Biofilm Matrix. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 632-633 (2010).
Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Quantifying biofilm structure using image analysis. Journal of Microbiological Methods. 39 (2), 109-119 (2000).
Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).
Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4 (3), 783-788 (2009).
Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology. 151, 757-762 (2005).
Swartz, K., Stephenson, R., Hernandez, M., Jambang, N., Boles, B. R. The use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus biofilm analysis. Journal of Visual Experiments. (46), e2470 (2010).
Werner, E., et al. Stratified Growth in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).
Wilson, C., et al. The Quantitative Assessment of Pseudomonas aeruginosa (PA)14 Biofilm Surface Coverage on Slippery Liquid Infused Polymer Surfaces (SLIPS). International Journal of Nanotechnology in Medicine & Engineering. 3 (3), 35-42 (2018).
Samarian, D. S., Jakubovics, N. S., Luo, T. L., Rickard, A. H. Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (94), 52467 (2014).
Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
Kim, J., Park, H. -. D., Chung, S. Microfluidic Approaches to Bacterial Biofilm Formation. Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).
Mosier, A. P., Cady, N. C. Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems. Science Progress. 94 (4), 431-450 (2011).
Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annual Review of Microbiology. 69, 71-92 (2015).
Chandra, J., Kuhn, D. M., Mukherjee, P. K., Hoyer, L. L., McCormick, T., Ghannoum, M. A. Biofilm Formation by the Fungal Pathogen Candida albicans: Development, Architecture, and Drug Resistance. Journal of Bacteriology. 183 (18), 5385-5394 (2001).
Vasconcelos, M. A., et al. Effect of Algae and Plant Lectins on Planktonic Growth and Biofilm Formation in Clinically Relevant Bacteria and Yeasts. BioMed Research International. 2014, 9 (2014).
Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. Textural Features for Image Classification. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 3 (6), 610-621 (1973).
. Biofilm Morphology Suite Available from: https://github.com/cdwentworth/Biofilm-Morphology-Suite.git (2018)
. Cyverse Available from: https://user.cyverse.org/services/mine (2018)
Benoit, M. R., Conant, C. G., Ionescu-Zanetti, C., Schwartz, M., Matin, A. New Device for High-Throughput Viability Screening of Flow Biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 76 (13), 4136-4142 (2010).
Ding, A. M., Palmer, R. J., Cisar, J. O., Kolenbrander, P. E. Shear-Enhanced Oral Microbial Adhesion. Applied and Environmental Microbiology. 76 (4), 1294-1297 (2010).
Diaz De Rienzo, M. A., Stevenson, P. S., Marchant, R., Banat, I. M. Effect of biosurfactants on Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus biofilms in a BioFlux channel. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (13), 5773-5779 (2016).
Moormeier, D. E., Bayles, K. W. Staphylococcus aureus Biofilm: A Complex Developmental Organism. Molecular Microbiology. 104 (3), 365-376 (2017).
Tremblay, Y. D. N., Vogeleer, P., Jacques, M., Harel, J. High-Throughput Microfluidic Method To Study Biofilm Formation and Host-Pathogen Interactions in Pathogenic Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 81 (8), 2827-2840 (2015).
Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Streptococcus Adherence and Colonization. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 73 (3), 407-450 (2009).
Díez-Aguilar, M., Morosini, M. I., Köksal, E., Oliver, A., Ekkelenkamp, M., Cantón, R. Use of Calgary and Microfluidic BioFlux Systems To Test the Activity of Fosfomycin and Tobramycin Alone and in Combination against Cystic Fibrosis Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (1), 01650-01717 (2018).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Sutlief, A. L., Valquier-Flynn, H., Wilson, C., Perez, M., Kleinschmidt, H., Schofield, B. J., Delmain, E., Holmes, A. E., Wentworth, C. D. Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System. J. Vis. Exp. (143), e58926, doi:10.3791/58926 (2019).

Automatically Generated