Live Cell Analysis of Shear Stress on <em>Pseudomonas aeruginosa</em> Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Arin L. Sutlief; Helena Valquier-Flynn; Christina Wilson; Marco Perez; Hunter Kleinschmidt; Brett J. Schofield; Elizabeth Delmain; Andrea E. Holmes; Christopher D. Wentworth

doi:10.3791/58926

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Bioengineering

Ao vivo celular análise de tensão de cisalhamento na Pseudomonas aeruginosa , usando um sistema automatizado de Microfluidic superior-taxa de transferência

Published: January 16, 2019

doi:

10.3791/58926

Arin L. Sutlief*¹, Helena Valquier-Flynn¹, Christina Wilson¹, Marco Perez¹, Hunter Kleinschmidt², Brett J. Schofield², Elizabeth Delmain³, Andrea E. Holmes¹, Christopher D. Wentworth*⁴

¹Department of Chemistry,Doane University, ²Department of Biology,Doane University, ³Department of Pathology and Microbiology,University of Nebraska Medical Center, ⁴Department of Physics and Engineering,Doane University

Summary

Aqui, descrevemos a utilização de um biorreator de maior rendimento microfluidic juntamente com um microscópio fluorescente para a análise dos efeitos da tensão de cisalhamento em biofilmes de Pseudomonas aeruginosa expressando proteínas fluorescentes verdes, incluindo o instrumento configurar, a determinação de propriedades morfológicas, taxa de crescimento e cobertura do biofilme.

Abstract

Um maior rendimento microfluidic em vitro biorreator juntamente com microscopia de fluorescência tem sido usado para estudar o crescimento do biofilme bacteriano e morfologia, incluindo Pseudomonas aeruginosa (p. aeruginosa). Aqui, iremos descrever como o sistema pode ser usado para estudar a cinética de crescimento e as propriedades morfológicas tais como a rugosidade da superfície e textura entropia da estirpe de p. aeruginosa que expressa uma proteína verde fluorescente melhorada (PA01-EGFP PA01 ). Um protocolo detalhado irá descrever como crescer e propagar as culturas PA01-EGFP, como definir-se o microscópio e o autorun e realizar a análise de imagem para determinar a taxa de crescimento e propriedades morfológicas, usando uma variedade de forças de cisalhamento que são controlados pela dispositivo microfluidic. Este artigo irá fornecer uma descrição detalhada de uma técnica para melhorar o estudo de biofilmes PA01-EGFP, que eventualmente podem ser aplicadas para outras cepas de bactérias, fungos ou algas biofilmes usando a plataforma microfluidic.

Introduction

Aqui, vamos demonstrar um método para medir o efeito da tensão de cisalhamento sobre a formação de fluorescente biofilmes de Pseudomonas aeruginosa (p. aeruginosa) PA01 usando um sistema automatizado microfluidic de maior rendimento.

Biofilmes são comunidades de micro-organismos, como bactérias, organizados por uma substância polimérica extracelular que estão ligados a um suporte e são tipicamente encontrados na interface entre um líquido e um sólido de superfície¹. Estas comunidades de biofilme podem ser benéficas para o ambiente, tais como a melhoria da qualidade das água em linhas de abastecimento de água e na biorremediação de recalcitrante compostos²^,³. No entanto, biofilmes também podem ser altamente prejudiciais à saúde humana, com consequências indesejáveis. Por exemplo, dispositivos médicos, tais como implantes de quadril e joelho, são um tipo de superfície onde o acúmulo de biofilme tem sido um desafio e provoca graves complicações médicas⁴^,⁵. Biofilmes podem também introduzir sistemas de água naturais, como rios e lagos e se infiltrar em tubulações de abastecimento de água, levando a contaminação de bactérias na água potável, resultando em infecções⁶^,⁷^,⁸. Biofilmes formados em ambientes marinhos aderirem aos navios e outros substratos artificiais e apresentam um grande problema ambiental e econômico como o aumento do atrito leva para aumentar o consumo de combustível⁹^,¹⁰. Revestimentos de antimicrobianos, tais como o tributilestanho, foram desenvolvidos para evitar esses problemas, mas são tóxicos para a vida marinha¹¹.

P. aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa com elevadas capacidades prósperas em uma variedade de condições ambientais e nutrimental¹². P. aeruginosa é uma causa comum de infecções e hospital-adquirida na Comunidade e encontrado ser estreitamente associado a lesões, como queimaduras graves e hospedeiros imunocomprometidos, tais como na fibrose cística (CF)⁵^,¹²^, ¹³, AIDS e câncer pacientes⁵^,¹³. A formação de biofilmes de p. aeruginosa foi conectada mais seriamente a CF, onde infecções pulmonares crônicas são a principal causa de morte por esta doença⁵.

Uma tensão de referência de p. aeruginosa, PA01, é usada neste relatório e é geneticamente modificada para expressar uma proteína verde fluorescente melhorada (PA-EGFP). EGFP representa uma forma mutante do GFP com propriedades de fluorescência maiores que permite em situ biofilme análise usando microscopia de fluorescência¹⁴^,¹⁵^,¹⁶. Este tipo de análise da fluorescência é vantajoso para o estudo de biofilmes porque GFP não interfere significativamente com o crescimento da célula e função¹⁷. Por exemplo, células de Escherichia coli que foram marcadas com GFP cresceram bem e continuamente sem ter sofrido qualquer efeitos tóxicos em comparação com o controle de bactérias¹⁷. Outros relatórios fundamentaram esta alegação¹⁸^,¹⁹^,²⁰. Além disso, o uso de um repórter fluorescente como EGFP é rápida e simples, ainda células vivas somente serão medidas porque células mortas rapidamente deixam de fluorescência²¹.

Biofilmes podem crescer sob diferentes condições ambientais, incluindo aqueles com taxas de fluxo diferentes. Por exemplo, filmes podem crescer em alta tensão de cisalhamento, como em rios, onde as condições de fluxo de água de alta levam a uma maior diversidade microbiana²². Contrària, água parada em lagoas ou biofilme oral experiência um tanto mais baixo cisalhamento força²³. Além de taxa de fluxo, existem outros fatores que influenciam a aderência de biofilme, incluindo a rugosidade da superfície e hidrofobicidade, composição de mídia, e até mesmo o bacteriano célula superfície¹^,⁴^,⁷^, ²⁴. condições também podem causar a variação na estrutura espacial ou morfologia de um biofilme. Isso inclui as condições ambientais, tais como tensão de cisalhamento exercida por um fluido em movimento ou gradientes na disponibilidade de nutrientes e fatores biológicos, tais como as espécies presentes no sistema, motilidade das células e as proteínas específicas presentes no extracelular substância polimérica²⁵^,²⁶^,²⁷. Sob algumas condições, o biofilme será gramado-como (liso e plano), enquanto em outras condições o biofilme vai ser áspero, macio, ou mesmo como cogumelo²⁸. Enquanto a diferença qualitativa entre o biofilme gramados e estruturas cogumelos pode ser claramente observada em imagens microscópicas, compreender a relação entre a estrutura do filme e processos biológicos dentro do filme requer sistemática e quantitativa métodos de descrever a morfologia. Propriedades morfológicas sugeridas para estudo por pesquisadores incluem a porosidade, a dimensão fractal, comprimento de difusão microcolônias área no substrato, volume de microcolônias, coeficiente de rugosidade e entropia textural²⁹^,³⁰.

Biorreatores são usados no estudo de biofilmes de imitar a vida real condições³¹. Reactores de fluxo de gotejamento (DFR) representam um ambiente de baixo-tesoura onde nutrientes na mídia fluam lentamente entre as células que são atinentes a uma superfície ao longo do tempo para formar um biofilme com uma célula de alta densidade³². Reactores de CDC são biorreatores que criam um ambiente fluido de alta tensão de cisalhamento pelo controle de uma haste de agita que gira continuamente dentro da mídia encheu o tanque³³. Estes tipos de biorreatores são simples de configurar, mas eles são limitados no escopo por causa do tamanho de amostra relativamente baixo, o alto consumo de mídia, grandes quantidades de resíduos biológicos perigosos produzidos a partir de fluxos de mídia gotejamento variando de 125 µ l/minuto para reactores de fluxo de gotejamento a mais de 1 mL/min para reatores de CDC e a necessidade de grandes quantidades de autoclave de vidro e resíduos de mídia³⁴. Biofilmes não crescem uniformemente em toda a superfície em um reator de fluxo de gotejamento porque à direita ao longo os maiores conglomerados de p. aeruginosa bactérias, portanto, faz com que o baixo cisalhamento dos meios de comunicação, o crescimento do biofilme não é muito liso e as amostras irregulares não podem ser facilmente analisado com microscopia de fluorescência³⁵^,³⁶ .

Algumas limitações de biorreator comuns são superadas por meio de um biorreator microfluidic médio-taxa de transferência, onde apenas mililitros de mídia são necessários, e as placas de reação são pequenos e facilmente descartáveis após autoclavagem³⁷. Além disso, dependendo do número de poços, muitas repetições podem ser executadas em apenas um reator executar, que fornece a quantidade suficiente de dados para realizar análise estatística significativa. Na Figura 1, são mostrados os diferentes componentes do sistema de microscopia microfluidic que permitem condições controladas, incluindo temperatura e fluem taxa³⁸^,³⁹^,⁴⁰. O biorreator é acoplado com microscopia de fluorescência para visualizar a fluorescência da marca EGFP no PA01 sob baixa aplicado através de condições de alto cisalhamento que imitarão cenários mais realistas que são encontrados no ambiente ou na área biomédica.

Figura 1 : Os componentes individuais do sistema Microfluidic. Os componentes individuais são listados da esquerda para a direita: 1. câmera CCD, 2. alta resolução de microscópio invertido com palco automatizado, módulo de fluorescência automatizada e módulo de focagem automática, 3. placa de palco, 4: Imaging system Interface, 5: Manual do microscópio de fase Controle, 6: Armadilha de Vapor, 7: Imaging system Controller (controlador de temperatura incluindo), 8: 9 controladores de Hardware: controlador de fluorescência, 10: Uninterruptible Power Supply, 11: rígido externo para armazenamento de imagens, 12: PC Workstation. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Um trecho da placa microfluídicos é mostrado na Figura 2. As placas mais comumente usadas é composto por 48 poços. Um experimento requer uma entrada e uma saída poços, um total de 2 poços. Isto permite 24 experimentos simultâneos que podem ser executados com diferentes condições experimentais, tais como cepas bacterianas, tratamentos antimicrobianos e mídia variou de canal para canal e controlado o fluxo de cisalhamento para cada coluna de seis canais. A temperatura experimental também é controlada com um ajuste de temperatura em toda a placa. Os canais microfluídicos mostram que cada canal tem uma região serpentina para fornecer suficiente pressão traseira e cisalhamento controlado.

Figura 2: Visualização da janela de visualização e canais microfluídicos. Destacam-se dois poços de entrada e saída, com os canais microfluídicos conectá-los com corantes vermelhos e verdes. O corante torna visível uma região serpentina em cada canal que cria pressão suficiente e cisalhamento controlado durante o fluxo de fluido. Cada canal de visualização (dentro do círculo vermelho) pode ser fotografada com comprimentos de onda desejados. São mostrados campo claro (topo) e fluorescente (inferior) imagens de microscopia de um único canal com um biofilme PA01-EGFP usando um objectivo X 20. Barra de escala = 80 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Um guia passo a passo é fornecido para permitir que usuários de biorreactores microfluidic acoplados com microscopia de fluorescência para realizar experimentos de biofilme romance usando tesoura diferentes ambientes. Este método permitirá a expansão de experiências envolvendo outros microorganismos além de bactérias, tais como fungos e algas, que têm aplicações médicas e ambientais⁴¹^,⁴²^,⁴³. A abordagem detalhada descreve como cultura PA01-EGFP, inocular uma placa de 48 e configurar o dispositivo microfluidic e software, configurar o microscópio fluorescente e demonstrar a análise do software para obter a cobertura do biofilme, taxa de crescimento, e Propriedades morfológicas tais como rugosidade da superfície.

Protocol

1. preparação de mídia Prepare a mídia mínima (MM), com 0,25% glicose. Para fazer 1 L de MM com 0,25% de glicose, adicionar 200 mL de M9 solução salina estéril, 2 mL de estéril 1m MgSO4, 100 µ l de estéril 1 M CaCl2e 12,5 mL de glicose estéril de 20% (p/v) com água (dH2O) em um volume final de 1 L. Transferi mídia necessária para um frasco estéril usando técnicas estéreis. Prepare a quantidade necessária dependendo do número de canais sendo usado. Normalmente, cada canal requer 200 µ l para aprontar, 300 µ l para semeadura e 1300 µ l para o experimento de 24 h. Coloque o frasco num banho de água ou incubadora definido na temperatura experimental. A mídia deve atingir a temperatura do experimento antes do uso para evitar bolhas formando os microcanais. 2. elaboração de uma cultura durante a noite e Experimental de PA01-EGFP. Coloque 15 mL de mídia experimental em um frasco estéril braço lateral e inocular com uma ou duas colônias de uma placa de ágar listado com PA01-EGFP. Expanda a cultura para 12-16 h sobre uma mesa incubadora/agitador a 37 ° C e 180-220 rpm. Medir o OD600 da cultura durante a noite. Quando o OD600 for maior que 0,80, dilua a cultura da noite para o OD final de 0,8 usando fresco MM. Coloque o cultivo experimental em uma incubadora ou banho-maria a 37 ° C, até que seja necessário para a propagação dos canais microfluídicos. Verifique o OD600 novamente imediatamente antes da semeadura para assegurar que ele não mudou significativamente do alvo OD600, 0,8 neste caso. 3. equipamento inicialização Configure a estação de sistema de acordo com o guia do usuário, semelhante à configuração na Figura 1. Para evitar um erro na conexão do instrumento para o software, ligue o instrumento na seguinte ordem:Estação de trabalho PCMódulo de fluorescência. Verifique se que o botão do obturador da fluorescência está na (luz azul pelo botão do obturador)Controladores de hardwareSistema controlador de imagem (consulte a Tabela de materiais)Câmera CCDEstação de geração de imagens (microscópio)Nota: A temperatura da placa aquecida deve ser ajustada para a temperatura desejada e experimental. Iniciar o aplicativo de controle e digite o número da placa localizado na etiqueta do lado da placa.Nota: Depois que inicia o aplicativo de controle haverá duas janelas de aplicativo separadas, uma para o software que controla o software de imagem de microscópio/e outra para o módulo de controle que controla a bomba e a-placa de interface. Isso é mostrado na Figura S1, onde o menu “Multi Dimensional aquisição” é aberto na parte superior e o módulo de controle é definido para um autorun no fundo. 4. preparação e propagação da placa Microfluidic Nota: A escorva, semeadura, fixação bacteriana e crescimento são ilustrados na Figura 3. Remova a placa de 48-bem microfluidic da embalagem certificando-se de não tocar a superfície de vidro na parte inferior da placa. Limpe a lâmina de vidro na parte inferior da placa bem com um tecido de lente, um pano livre de fiapos ou uma limpeza de baixo-lint. Para prime os canais microfluídicos, pipete 200 µ l de 37 ° C MM para a saída, tomando cuidado para evitar bolhas. Colocar a placa para a fase de placa e limpar a interface com o etanol, que permite secar, antes de lacrá-lo para o palco da placa. No Modo Manual do módulo de controle, defina fluido como LB a 37 ° C e Max cisalhamento em 5,00 Dina/cm2. Clique em poços para ativar o fluxo da saída à entrada, de saída escorva os canais. Após a 5 min de escorva, pause o fluxo para se preparar para a semeadura. Cuidadosamente retire a placa do palco e pipetar residual de mídia de saída, mas não remover qualquer um dos meios de comunicação do círculo interior que leva para os canais microfluídicos. Para propagar os canais experimentais, primeiro Pipete 300 µ l de MM na entrada bem seguida de pipetagem µ l 300 de cultura bacteriana na saída bem na saída de bem. Coloque a placa de volta para a fase de placa, certificando-se de limpar a interface antes de o colocar no prato. Sobre o módulo de controle, foco em um único canal utilizando a câmera ao vivo alimentar depois de colocar o palco de placa para o palco do microscópio. Enquanto visualmente monitoramento ao vivo, retome o fluxo em 1.00-2.00 Dina/cm2 para aproximadamente 2-4 s permitir que as células entrar no canal experimental, mas não em canais de serpentina. Deixe o prato no palco temperatura controlada por 1h permitir a fixação da célula. Durante a incubação de 1h, o módulo de controle e montagem de software pode ser configurado para o autorun (passo 5).Nota: A quantidade de tempo necessário para a propagação pode variar com a mídia e o organismo, então deve ser acompanhada de perto ao vivo até otimizado e usado como um período de tempo geral. Semeadura em toda a placa pode variar que exigiria mais tempo de fluxo aplicado a determinadas colunas de canais para a propagação completa. Após o período de fixação, retire a placa do palco e pipetar as bactérias da saída do primeiro, evitando perturbar o canal. Com uma ponta de pipeta nova, remova a mídia dos poços de entrada. Figura 3 : Visão experimental de escorva, propagação e fixação do PA01-EGFP nos canais microfluídicos. A escorva, semeadura e acessório é descrito. O primeiro passo de escorva requer mídia fresca introduzida para a saída. A semeadura implica iguais volumes de cultura mídia e bacteriana na entrada e saída poços, respectivamente. A cultura não deve passar para o segmento de visualização do canal experimental (linha vermelha) para evitar o entupimento dos canais de serpentinos. Após o período de incubação é longo, fresca mídia continuamente flui da entrada, para a câmara de visualização e na tomada. Isto inicia o acessório e o crescimento do biofilme bacteriano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 5. Configurando o Software No software, abra “Múltiplas aquisição Dimensional” para controlar a aquisição de imagem do microscópio. Sob o menu “principal”, selecione “Timelapse”, “Múltiplas posições de estágio” e “Múltiplos comprimentos de onda” (Figura S1A). Configurando as configurações de salvar , crie um simples Nome de Base, certificando-se que o nome base do incremento se arquivo existe é verificado. Clique em Selecionar o diretório para selecionar a pasta em que todos os arquivos serão salvos. Inclua detalhes essenciais do experimento na Descrição. Sob a guia de Timelapse , ajuste a duração do tempo experimental para 24 h. Para controlar quantas vezes imagens são adquiridas, definir o Intervalo de tempo para que imagens são adquiridas a cada 5 minutos durante todo o experimento. O Número de pontos de tempo ajusta-se automaticamente com os parâmetros definidos. Definir posições de estágio usando a câmera ao vivo alimentar no microscópio de campo claro, permitindo foco e posicionamento correto. Começando com o objetivo de X 10, concentre-se no centro do canal, localizado acima ou abaixo os números de canal gravados na placa. Alterne para o objectivo X 20, encontrar a área de visualização ideal e plano focal dentro do canal. Adicionar a posição para a lista ou substituir a posição do canal pré-programado com as novas configurações. Sob o menu de comprimentos de onda , defina o número de comprimentos de onda de 3. Para o comprimento de onda 1 (W1), selecione o FITC 100% CAM com um tempo de exposição de 10 ms. Para comprimento de onda 2 (W2), seleccione Brightfield CAM 50% 50% VIS com um tempo de exposição mínimo de 3 ms. para comprimento de onda 3 (W3), definido como o filtro Fechado todos tão sem luz permanece no último canal entre tempos de aquisição. Ao configurar o módulo de controle, verifique se que o manual executar foi interrompido. No menu Editar Autorun sob a guia de Configuração do protocolo , defina um novo protocolo para 24 h de tempo de duração, fluindo em direção direta na taxa de cisalhamento desejado. Taxa de cisalhamento é variada para estudar o efeito do crescimento do biofilme com taxa de cisalhamento. Clique em Adicionar e Salvar como o protocolo. Na guia Configuração de sequência , crie uma nova sequência selecionando LB@37degrees como o líquido padrão para todos os canais. Em Iteração da etapa 1, para os canais 1-12, selecione o protocolo com a taxa de cisalhamento desejado e Ativar todos os canais. Para canais 13-24, selecione o protocolo com a segunda taxa de cisalhamento desejado e Ativar todos os canais. Selecione aplicar e Salvar como a sequência. No menu de execução automática , selecione a sequência salva a ser usado para o autorun. 6. cronometrado biofilme crescimento montagem da experiência Pipete um máximo de 1.300 µ l de MM estéril para a entrada bem da placa microfluidic. Coloque a placa de volta para o palco de placa e limpar a interface com o etanol, permitindo que o etanol secar completamente, antes de selar a placa. Colocação da placa de palco para o palco do microscópio e tenha certeza de que o protocolo e sequence(s) estão corretamente configuradas. Selecione Iniciar para iniciar o autorun rapidamente seguido clicando em adquirir para iniciar a coleção de imagens de microscópio. Ajuste o foco e o posicionamento de todas as posições de estágio entre aquisições de imagem. Selecione pausa e, usando o modo de imagem ao vivo no comprimento de onda de campo claro, selecione Ir para exibir cada posições de estágio. Defina novas configurações selecionando definido como atual. Clique em retomar antes da próxima aquisição programada. 7. rever e analisar sequências de imagem após a experiência de crescimento do biofilme cronometrado Para revisar cada canal após a 24 h, autorun, no software, abra Rever dados multidimensionais, localizado em Ferramentas de análise. Clique em Selecionar arquivo de Base de | Selecione o diretório para navegar até a pasta com sequências de imagem para o experimento de interesse. Na lista de conjuntos de dados na pasta que aparece, selecione o nome de base de dados de interesse. Uma vez que os dados de interesse são selecionados, clique em View para analisar esses dados. Selecione um comprimento de onda de rever esses dados sob a janela de comprimento de onda (Figura S2). Revisão da sequência de imagens para cada canal, selecionando o número do canal sob a Posição de palco e usando o controles de vídeo para analisar os dados para o tempo 289 pontos (supondo que imagens são obtidas a cada 5 minutos sobre um frame de tempo de 24 h). Tome nota dos dados de crescimento utilizável.Nota: Em cada canal, preste atenção para o desenvolvimento de bolhas de ar e tamancos que irão perturbar o crescimento do biofilme dentro do canal, que afetam os dados. No entanto, se estas ocorrem mais tarde nos dados de execução, antes nestas circunstâncias pode ser encontrada útil. Depois de analisar e selecionar os dados desejados para análise, crie pilhas de imagens para cada canal. No menu arquivo , selecione aberto especial | Construir a pilha | Numeradas de nomes. Na janela de Pilha de Build , selecione o botão Selecionar a primeira imagem , em seguida, selecione a imagem primeira para a pilha na pasta de arquivo; Selecione o botão Selecionar última imagem e selecione o arquivo correspondente à última imagem na pilha. Clique em Okey para abrir a pilha com todas as imagens do canal em ordem cronológica. Pilhas podem ser salvos no menu arquivo , Salvar como como arquivos tiff.Nota: Não crie pilhas com as imagens do polegar. Esses arquivos não são muito úteis e podem ser excluídos para economizar espaço no disco rígido. Além disso, arquivos de imagem são salvos como a seguir:BASE NAME_WAVELENGTH_sCHANNEL #_tIMAGE #.Por exemplo, 100_s12_t112 de 07062018_W1FITC é para o canal 12, ponto tempo 112, imagem nos primeiros dados de câmera 100% do comprimento de onda-FITC com o nome de base “07062018”. Finalmente, selecione Salvar como no menu arquivo suspenso para salvar a sequência como uma pilha de tiff. Pilhas também podem ser sobrepostas e salvo como um filme. Esta mensagem é dirigida na etapa 9. Antes de quantificar a % de cobertura de superfície, calibre as distâncias de imagem. Em Ferramentas de análise, clique em Calibrar distâncias. Selecione a medida de calibração adequados e clique em aplicar a todas as imagens abertas. Enquanto a pilha está na primeira imagem da sequência, clique no botão limite . Use Auto limiar para objetos de luz ao limiar para sinal fluorescente (comprimento de onda FITC) e Limiar automático para objetos escuros para limiar em campo claro. Ajuste o limiar para a cobertura que representa a cobertura da imagem. Para os limiares de fluorescentes, utilizar um canal com células não-fluorescente para estabelecer qualquer sinal de fundo e definir o valor de limiar mínimo para excluir o sinal detectado em canais contendo estas não-fluorescente células para garantir a medição de sinal faz Não subestime a área de fluorescência. Isso pode ser diferente de execução para execução então é uma boa ideia para usar pelo menos um, se não mais, canal (s) de controles não-fluorescente. Para os limiares de campo claro, se todas as células não são cobertas pela assinatura limiar laranja, ajustar o valor de limiar máximo através da deslizamento da barra de ferramentas ou usando a Imagem do limiar (encontrado sob as Ferramentas de análise) para que todas as células são cobertos, mas qualquer fundo é excluído.Nota: Enquanto estes limiares idealmente poderia ser usados para todas as imagens dentro de uma pilha e para todos os canais, valores de limiar selecionados para uma imagem/canal podem não ser apropriados para outros canais, ou imagens, portanto, que o usuário pode precisar de ajustar o intervalo do limiar periodicamente. Por esta razão, é uma boa ideia para gravar sempre o máximo e valores de limiar mínimo usados em caso de necessidade de dados para ser analisado mais tarde. Para quantificar a cobertura, em Ferramentas de análise, clique em Mostrar as estatísticas da região. Certifique-se que o Limite de utilização estiver marcada, a Imagem inteira é selecionada e em Dados obtidos, certifique-se que as medições/configurações desejadas são selecionadas (área de limiar, média, desvio padrão, min, max e limiar % área). Clique em Abrir registo e arquivo DDE está marcada antes de clicar em Okey. Selecione o Microsoft Excel e clique Okey. Na planilha que irá abrir, clique em Log de dados para gravar automaticamente as medições da imagem sendo analisado. Deixando esta planilha aberta, use a mesma folha para coletar todos os dados de análise de imagem para uma única pilha. Na pilha, vá para a quarta imagem e limiar para as configurações ideais. Clique em Dados de Log na tela Mostrar estatísticas de região e os valores são registrados para a planilha. Repita isto para análise de imagens de cada 15 min. 8. outros scripts de análise incluindo morfologia e superfície cobertura medida usando Python de morfologia o biofilme Instale uma distribuição de Python 3.6 que inclui módulos científicos padrão usando uma distribuição de Python padrão científica como Anaconda, disponível em https://www.anaconda.com/download. Obter o biofilme morfologia Suite do GitHub em um navegador, navegando para https://github.com/cdwentworth/Biofilm-Morphology-Suite.git, em seguida, selecione o Clone ou download (botão verde) e Download Zip. Descompacte o arquivo e mova as pastas de código para um diretório de trabalho. Medir a cobertura de thresholded por cento, copiando a pilha de imagem para a pasta de “cobertura”. Use uma janela de terminal para navegar até essa pasta e execute o script com o comandoPython bfCoverage.py tiffStackName.tifpartir da interface de linha de comando, onde tiffStackName.tif é o nome do arquivo que contém a pilha de imagens tiff. Um arquivo de texto que contém as medições de cobertura em cada ponto de tempo será criado com o nome tiffStackName.txt e um arquivo gráfico com uma trama de cobertura como uma função do tempo será criada com o nome tiffStackName.png. Use o mesmo procedimento especificado no passo 8.3 para medir as outras características morfológicas: biofilme acumulação, coeficiente de rugosidade e entropia textural. Use o script bfAcc.py para a medição de acumulação, o script roughCoef.py para a medição do coeficiente de rugosidade e o script TEvsTime.py para a medição de entropia textural. 9. outras aplicações de Software – fazer sobreposições e filmes Se múltiplos comprimentos de onda são utilizados, crie pilhas de sobreposição, incluindo estes comprimentos de onda. Abra todas as pilhas de interesse e calibrar a distância como feito na etapa 7,6. Em Ferramentas de análise, selecione Sobreposição de imagens. Defina as fontes como pilhas de interesse. Na pilha de FITC, clique sobre o círculo de arco-íris e selecione filtro de cor verde para ser adicionado a fim de destacar neste comprimento de onda. Use bal para ajustar a sobreposição para que a pilha FITC é aparente nas imagens. Depois de terem sido feitos todos os ajustes, selecione Todos os aviões para as duas pilhas e clique em aplicar. Salve as sobreposições da mesma forma como descritas na etapa 7.5 de pilhas ou como um filme descrito na etapa 9.2. Para salvar a pilhas ou sobreposições como um filme de timelapse, sob Padrão MM e pilha, clique em Fazer o filme. Selecione a fonte como pilha ou sobreposição que é desejada. Clique em salvar e salvar como um Microsoft Video 1 , com uma qualidade definida entre 70-80.

Representative Results

Figura 4 um demonstra a área de thresholded por cento ao longo do tempo de um 24 h executar em fluxos de cisalhamento de 0,2 e 0,5 1,0 Dina/cm2. O biofilme cobertura ou por cento limiar área de superfície (C [%]) foi diferente para todas as configurações de cisalhamento três. A cobertura de biofilme foi mais rápida no cisalhamento de 1,0 Dina/cm2 , onde a área de limite aumentou de 2-5% a 100% depois de 200 min de crescimento e atingiu uma fase estacionária depois de 400 min. Em 0,5 Dina/cm2, a cobertura de biofilme atrasou-se e começou a aumentar em 400 min atingir cobertura de 100% após 800 min. O mais baixo cisalhamento em 0,2 Dina/cm2 claramente demonstraram o aumento mais lento na cobertura de biofilme, onde por cento cobertura começou a aumentar em 500 min mas nunca alcançado além da área de limite de 65%. Estes resultados indicaram cisalhamento teve uma influência directa na cobertura de superfície do biofilme. O cisalhamento maior pareciam ser uma condição mais ideal para o crescimento do biofilme, possivelmente devido ao fato de que a mídia fornecida as bactérias com mais nutrientes para que o biofilme pode proliferar mais rapidamente. Figura 4: área de limite percentual, acúmulo de biofilme total, coeficiente de rugosidade e textural entropia… ) uma porcentagem limite área (C [%]) ao longo do tempo usando 0,2 0,5 e 1,0 Dina/cm2 sobre a 24h, período de tempo. Obteve-se dados de um canal para cada condição de cisalhamento. b) total acúmulo de biofilme (medida relativa) em função do tempo usando 0,2 0,5 e 1,0 Dina/cm2 sobre a 24h, período de tempo. As linhas pretas são mínimos quadrados se ajusta a um modelo exponencial. Obteve-se dados de um canal para cada condição de cisalhamento. c) coeficiente de rugosidade de PA01-EGFP usando valores de tensão de cisalhamento de 0,2 e 0,5 1,0 Dina/cm2 monitorado mais 24 h. dados obteve-se de um canal para cada condição de cisalhamento. d) textural entropia de PA01-EGFP usando valores de tensão de cisalhamento de 0,2 e 0,5 1,0 Dina/cm2. Obteve-se dados de um canal para cada condição de cisalhamento (Valquier-Flynn, H., Sutlief, A.L., Wentworth, C.D., 2018). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4 b é consistente com os resultados mostrados na Figura 4um. O acúmulo de biofilme (N[rel]) foi medido com base no pressuposto de que o sinal GFP em um ponto em uma imagem é proporcional à densidade de célula viva naquela posição. Ele demonstra que o acúmulo de biofilme de medição relativa total aumentou em função do tempo usando 0,2 0,5 e 1,0 Dina/cm2 sobre a 24h, período de tempo, e recusou-se a taxa de crescimento de mais alta tensão de cisalhamento a mais baixa tensão de cisalhamento. Há um período de tempo claro, dando o crescimento exponencial do qual pode ser calculada a uma taxa de crescimento quantitativo. Figura 4 c demonstra o coeficiente de rugosidade (Rum) em fluxos de cisalhamento de 0,2 e 0,5 1,0 Dina/cm2. Rugosidade da superfície, quantificada pelo coeficiente de rugosidade, mede a variação no perfil de espessura do filme. A definição formal é onde T, é a eu-th medição de espessura, Tum é a espessura média, e N é o número de medição de espessura30. O procedimento descrito no presente inquérito mede a espessura associada com células vivas. Um simples arranjo de células renderá um coeficiente de rugosidade de zero enquanto significativas variações de espessura da média renderá um coeficiente de rugosidade maior do que um. Similar à influência de cisalhamento sobre a taxa de crescimento e a cobertura de limiar por cento do filme, os biofilmes exibiram topografias diferentes ao longo do tempo. Em geral, Rum diminuiu ao longo do tempo para todas as condições de cisalhamento indicando que todas as superfícies tornou-se mais suaves. No entanto, em comparação com o mais baixo cisalhamento de 0,2 Dina/cm, as configurações mais altas de cisalhamento de 0,5 e 1,0 Dina/cm2 resultaram em uma superfície mais Lisa ao longo do tempo, indicando que um fluxo mais rápido de cisalhamento contribuiu para a superfície mais suave e mais uniforme e o mais alto cisalhamento do 1,0 Dina/cm2 atingindo abaixo 0.2 Rum. A suavidade, regularidade ou grosseria de uma superfície também pode ser expressa em entropia textural (TE). TE é uma propriedade usada na análise de imagem para medir o grau de aleatoriedade em uma imagem bidimensional. Seu cálculo baseia-se na matriz de co-ocorrência nível cinza, definido por Haralick et al., que analisa se os valores de pixel em um local estão correlacionados com valores de pixel em um outro local44. Um alto grau de correlação levará para baixa entropia. Figura 4 d retrata o TE em fluxos de cisalhamento de 0,2 e 0,5 1,0 Dina/cm2. SMT aumentou ao longo do tempo para todas as condições de cisalhamento, mas a mais alta tensão de cisalhamento em 1,0 Dina/cm, alcançada o máximo TE mais cedo do que as tensões de cisalhamento inferiores a 900 min (1.0). O mais baixo cisalhamento de 0,2 Dina/cm2 tinham o menor TE (0,8) atingindo seu máximo depois de 1.000 min. No entanto, a tensão de cisalhamento intermediário de 0,5 Dina/cm2 alcançou seu máximo TE (1.2) muito mais tarde do que as condições de alta ou baixa tensão de cisalhamento. O coeficiente de rugosidade e TE medem características diferentes. Enquanto uma película plana teria um coeficiente de rugosidade baixa e baixa entropia, um filme com uma variação significativa na espessura teria um coeficiente de rugosidade alta, mas pode ainda ser baixa entropia se a variação for sinusoidal, ao invés de aleatórios. Neste caso, Rum diminuiu com o aumento de tensão de cisalhamento e tempo enquanto as tendências de TE não podem ser diretamente relacionadas com shear stress aplicado a formação de biofilme ao longo do tempo. Figura S1 : Captura das janelas de software de controle de imagem. Janela de software com menu Multi Dimensional aquisição aberto (em cima). Módulo de controle definido para um AutoRun (parte inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura S2 Captura do software para analisar dados de imagem. Janela do aplicativo depois de selecionar o conjunto de dados de interesse usando a ferramenta de Análise Multi Dimensional dados no menu de Ferramentas de análise . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O procedimento de análise de sistema e imagem microfluidic discutido aqui centra-se sobre a execução de experimentos de biofilme microfluidic para determinar Propriedades morfológicas que não requerem a informação tridimensional completa encontrada tipicamente de confocal estudos de microscópio. Estes incluíram microcolônias cobertura do substrato (cobertura por cento), medida pelo coeficiente de rugosidade e textural entropia aspereza de superfície. Um método para estimar o acúmulo de biofilme relativo total celular também é apresentado de que taxas de crescimento no log de fase pode ser calculada.

Existem várias etapas de pequenas, mas significativas que devem ser destacadas neste método. Limpando a interface com o álcool ajuda a evitar a contaminação de outras bactérias em indo de experimento para experimento, mas também de bem de bem em um experimento. Escorva e semeadura também são muito importantes porque escorva permite ao usuário determinar quais canais estão permitindo que a mídia a fluir através dos canais sem qualquer perturbação ou entupimento. Canais também não devem ser perturbado (ou seja , eles devem ser constantemente cheios de mídia) depois de escorva para aumentar as chances de uma experiência bem sucedida com nenhuma bolha de ar ou entupimentos. A etapa de propagação pode ser variada de acordo com o tipo de bactéria e assim deve ser otimizada para o acessório de celular. Por exemplo, se as células parecem não anexar, modificações de superfície podem ter que ocorrem na placa microfluidic antes da semeadura ou tempos mais longos de incubations podem ser necessários. Também é fundamental para certificar-se que o microscópio está configurado corretamente para obter uma imagem em foco e deve ser monitorizado periodicamente durante todo o experimento para assegurar que são obtidas imagens de qualidade. Se o foco estiver desligado, o microscópio pode e deve ser ajustado como o experimento continua. Durante o tempo de aquisição de imagem, o último comprimento de onda deve ser definido como Todo fechado para evitar a exposição dos filtros e iluminação para somente um canal durante o tempo de espera que ocorre entre as aquisições de imagem. Além disso, a análise de imagem que determina a % de cobertura de superfície foi projetada em casa porque o manual do software de montagem não explicitamente descrever o procedimento. Além disso, a fim de expandir-se na análise da imagem e determinar outras características tais como a rugosidade da superfície, etc., aberto fonte código baseado em Python⁴⁵ foi desenvolvida em casa e compartilhado no repositório gitHub. Também existem limitações na quantidade de dados pode ser armazenado e gerenciado no disco rígido local, assim que um disco rígido externo ou compartilhamento de dados on-line é necessário como CyVerse⁴⁶.

Biorreatores convencionais, tais como o reator do CDC e o gotejamento fluxo reator³⁴, exigem muita mídia, fornecem tamanhos de amostra menos e exigem uma quantidade elevada de esterilização dos equipamentos. Em contraste, as vantagens desta plataforma de produtividade mais elevados incluem a capacidade de controle da tesoura, taxas de fluxo, e a suposição que a vitro em experiências de perto se assemelham na vivo condições. Desvantagens do sistema incluem os vários acessórios e software que requerem um meticuloso de instalação que deve ser executada na ordem correta dos eventos. Além disso, o manual que é fornecido para o equipamento não explica totalmente cada etapa de experimentos e os comandos do software, e consequentemente, muitos erros ocorrem durante os experimentos, incluindo o entupimento dos canais, falta de crescimento ou acessório, imagens de microscopia de alta qualidade de falta ou do cinema. O próprio instrumento e consumíveis, tais como as placas microfluídicos, também são relativamente caros, com um preço de mais de US $200 por placa e não são reutilizáveis. Assim, enquanto a técnica empresta resultados poderosos, os conhecimentos técnicos necessários para a sua utilização é relativamente elevado e requer treinamento repetido por peritos no campo. Este relatório procura resolver esse problema, fornecendo um guia para novos usuários destes biorreatores para estudar características de biofilmes.

O sistema microfluídicos, que é capaz de realizar análise celular, ganhou a atenção considerável para diversas modalidades científicas, tais como em microbiologia, imunologia, Hematologia, Oncologia e investigação em células estaminais. Mais especificamente, a tecnologia resultou em muitas publicações, descrevendo os tópicos que são altamente relevantes para aplicações médicas³⁷^,⁴⁷, incluindo a adesão microbiana de oral⁴⁸, determinar os efeitos de biossurfactantes em Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus⁴⁹^,⁵⁰, hospedam interações patógeno em Escherichia coli⁵¹, Streptococcus aderência⁵²e tratamento de fibrose cística⁵³. Dado o fato de que este sistema de microfluidic é muito versátil, prevê-se que mais e mais sistemas serão distribuídos em todo o mundo.

Algumas etapas do protocolo específico deverão ser cuidadosamente consideradas. Mídia pode ser diluída a 50% com dH₂O para ajudar a evitar bolhas e entupimento, mas neste caso não foi necessária. O valor específico de OD₆₀₀ usada para a propagação deve ser determinado usando testes experimentais de um experimento de crescimento para ver o que funciona melhor para o conjunto específico de condições usadas. Bolhas em poços antes da selagem podem originar bolhas nos canais microfluídicos e devem ser removidas por estalado ou sugado para fora com uma ponta da pipeta. É importante manter as bactérias fora os pequenos canais serpentinas. Por ter volumes iguais dos meios de comunicação de entrada e de saída durante o processo de preparação, fluxo devido à pressão do líquido volume será controlado por fluxo é apenas devido a força de pressão do sistema. As distâncias de calibração devem ser configuradas durante a instalação do representante da empresa. Essas configurações são específicas para cada câmera.

Existem vários desafios que ocorrem quando encontrar o limiar mais representativo para uma imagem. Definindo valores limite máximo pode ser difícil se a intensidade do pixel média em todas as regiões do plano de fundo não é consistente causados selecionando uma posição que não é no centro do canal ou de detritos na placa. Sob o Padrão MM, clique em processoe selecione Background e correção sombreamento a ferramenta correção para essas inconsistências. No entanto, esta ferramenta geralmente é somente útil se o usuário tiver tomado imagens dos canais antes da semeadura que eles podem usar imagens de referência. Ou, se o plano de fundo/sombreamento referência imagens não estão disponíveis, o usuário precisará usar seu julgamento para definir um valor limite que cobre a célula área mais sem incluir plano de fundo para a imagem inteira. Como alternativa, selecione áreas representativas para medir que excluem as regiões de inconsistência por clique Região retangular, Região de elipseou Região de rastreamento para selecionar uma região e selecione Região ativa ao invés de todo Imagem na janela Visualizar estatísticas de região (em Ferramentas de análise). Se uma região representativa é utilizada para a imagem de campo brilhante de limiarização, mesma região deve ser usada para medição da imagem correspondente FITC. É útil gravar as espaciais estatísticas específicas (esquerda, topo, largura, altura, área, perímetro) associadas com essa região representativa assim será encontrada na mesma região e medido na imagem correspondente FITC.

Para evitar um acúmulo de dados no disco rígido que fará com que o computador abrandar, um disco rígido externo pode ser comprado para o armazenamento de dados. Uma outra opção para armazenamento de dados e facilitar o compartilhamento de dados é a plataforma de bioinformática do CyVerse. Crie uma conta no sistema de CyVerse, indo para http://www.cyverse.org/. Uma vez conectado, inicie o ambiente de descoberta, em seguida, selecione “Log em CyVerse”. Selecione “dados” e navegue até és a pasta. Se a pilha de imagem está no computador local, em seguida, selecione “fazer Upload“, em seguida, “Upload simples de Desktop“. Localize o arquivo de pilha de imagem e selecione para upload. O arquivo ou uma pasta pode ser compartilhada com os colaboradores se tiverem uma conta CyVerse e recebem permissão. Compartilhamento da pasta de dados para o público em geral exige que os metadados adicionados para cada arquivo usando CyVerse aprovado Standard. Este procedimento não será discutido aqui porque isso não está dentro do escopo deste trabalho.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi viabilizado por subsídios do Instituto Nacional para geral médica ciência (NIGMS) (5P20GM103427), um componente do National Institutes of Health (NIH)

Materials

Ammonium Chloride, ACS	VWR	BDH9208-500G	Part of the minimal media composition
BioFlux 1000 48 Well Low Shear Plate	Fluxion Biosciences	910-0047
BioFlux 1000Z Microfluidic Imaging System	Fluxion Biosciences	BF 1000Z
Calcium Chloride Dihydride, ACD Grade	VWR	97061-904	Part of the minimal media composition
Dextrose, Anhydrous, ACS	VWR	BDH9230-500G	Part of the minimal media composition
Magnesium Sulfate ACS Grade	VWR	EM-MX0070-1	Part of the minimal media composition
Potassium Phosphate Monobasic, ACS Grade	VWR	BDH9268-500G	Part of the minimal media composition
Pseudomonas Aeurginosa GFP	ATCC	15692GFP	Pseudomonas aeurinosa bacterial strain PA01 with GFP modification used for this study.
Sodium Chloride, ACS	VWR	BDH9286-500G	Part of the minimal media composition
Sodium Phosphate, Monobasic, Anhydrous, Reagent Grade	VWR	97061-942	Part of the minimal media composition

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Sutlief, A. L., Valquier-Flynn, H., Wilson, C., Perez, M., Kleinschmidt, H., Schofield, B. J., Delmain, E., Holmes, A. E., Wentworth, C. D. Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System. J. Vis. Exp. (143), e58926, doi:10.3791/58926 (2019).

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