يعيش "خلية التحليل من إجهاد القص" على الزائفة الزّنجاريّة باستخدام نظام موائع جزيئية العالي الإنتاجية الآلي
Summary
هنا، يمكننا وصف استخدام موائع جزيئية أعلى إنتاجية مفاعل حيوي مقترنة مجهر فلوري لتحليل آثار إجهاد القص على الأغشية الحيوية الزائفة الزّنجاريّة معربا عن البروتينات الفلورية الخضراء، بما في ذلك الصك قم بإعداد، تحديد التغطية بيوفيلم ومعدل النمو والخصائص المورفولوجية.
Abstract
وقد استخدمت موائع جزيئية أعلى إنتاجية في المختبر مفاعل حيوي مقترنة بالأسفار الفحص المجهري لدراسة النمو البكتيري بيوفيلم ومورفولوجيا، بما فيها الزائفة الزّنجاريّة (P. الزّنجاريّة). وهنا، نحن سوف تصف كيف يمكن استخدام هذا النظام لدراسة حركية النمو والخصائص المورفولوجية مثل خشونة السطح والتكوينية اعتلاج سلالة P. الزّنجاريّة PA01 أن تعرب عن تعزيز بروتين فلورية خضراء (PA01-اجفب ). بروتوكول مفصل سوف تصف كيفية النمو والبذور الثقافات PA01-اجفب، وكيفية تعيين مجهر والتشغيل التلقائي، وإجراء تحليل الصورة لتحديد معدل النمو والخصائص المورفولوجية باستخدام مجموعة متنوعة من قوي القص التي يسيطر عليها جهاز موائع جزيئية. هذه المادة سوف توفر وصفاً مفصلاً لتقنية لتحسين دراسة الأغشية الحيوية PA01-اجفب التي يمكن تطبيقها في نهاية المطاف نحو أخرى سلالات من البكتيريا أو الفطريات أو الطحالب من الأغشية الحيوية باستخدام منصة موائع جزيئية.
Introduction
هنا، وسوف ندلل على طريقة لقياس تأثير إجهاد القص على تشكيل الفلورسنت الأغشية الحيوية PA01 الزائفة الزّنجاريّة (P. الزّنجاريّة) استخدام نظام الآلي موائع جزيئية أعلى من الناتج.
الأغشية الحيوية هي مجتمعات من الكائنات المجهرية، مثل البكتيريا، تنظمها مادة البوليمر خارج الخلية التي يتم إرفاقها دعم، وتوجد عادة في مجال التفاعل بين سائل و سطحية صلبة1. يمكن أن تكون هذه المجتمعات بيوفيلم مفيدة للبيئة، مثل تحسين نوعية المياه في خطوط الإمداد بالمياه والمعالجة البيولوجية لوعورة المركبات2،3. لكن، يمكن أيضا أن الأغشية الحيوية جداً ضارة بصحة الإنسان بعواقب غير مرغوب فيها. على سبيل المثال، الأجهزة الطبية، مثل يزرع في الورك والركبة، هي نوع واحد من السطح حيث تراكم بيوفيلم تحديا ويتسبب في مضاعفات طبية خطيرة4،5. الأغشية الحيوية يمكن أيضا إدخال نظم المياه الطبيعية، مثل الأنهار والبحيرات، واختراق أنابيب الإمداد بالمياه مما يؤدي إلى تلوث البكتيريا في مياه الشرب أدى إلى إصابة6،،من78. تلتزم السفن وأخرى من صنع الإنسان ركائز الأغشية الحيوية التي شكلت في البيئات البحرية وتقديم مشكلة اقتصادية وبيئية كبيرة زيادة الاحتكاك يؤدي إلى زيادة استهلاك الوقود9،10. الطلاءات المضادة للميكروبات، مثل ثلاثي بوتيل القصدير، وقد وضعت لمنع هذه المشاكل ولكن سامة للحياة البحرية11.
P. الزّنجاريّة بكتيريا سلبية الغرام مع قدرات عالية مزدهرة في مجموعة متنوعة من الظروف البيئية ونوتريمينتال12. P. الزّنجاريّة هو سبب الشائع للعدوى المكتسبة من المجتمع، ومستشفى، ووجدت أن تكون وثيقة المرتبطة بالإصابات، مثل الحروق الشديدة، ويستضيف المناعة، كما هو الحال في التليف الكيسي (CF)5،12، 13، والإيدز، ومرضى السرطان5،13. تم ربط تشكيل P. الزّنجاريّة الأغشية الحيوية الأكثر جدية لقوات التحالف، حيث التهابات الرئة المزمن هي السبب الرئيسي لوفاة هذا المرض5.
سلالة مرجعية من P. الزّنجاريّة، PA01، ويستخدم في هذا التقرير وهو محوره وراثيا للتعبير عن تعزيز بروتين فلورية خضراء (السلطة الفلسطينية-اجفب). اجفب يمثل شكلاً متحولة للتجارة والنقل مع خصائص fluorescence أكبر مما يسمح بتحليل بيوفيلم في الموقع استخدام fluorescence مجهرية14،،من1516. هذا النوع من التحليل الأسفار مفيد لدراسة الأغشية الحيوية للتجارة والنقل لا تتداخل إلى حد كبير مع نمو الخلايا ووظيفة17. على سبيل المثال، نمت خلايا الإشريكيّة القولونية التي تم تمييزها بالتجارة والنقل جيد ومستمر دون عانى أي تأثيرات سامة بالمقارنة ب البكتريا التحكم17. تقارير أخرى تثبت هذا الادعاء18،،من1920. وعلاوة على ذلك، استخدام مراسل الفلورسنت مثل اجفب سريعة وبسيطة، ومع ذلك سيتم قياس الخلايا الحية فقط نظراً لتوقف الخلايا الميتة بسرعة فلوريس21.
الأغشية الحيوية يمكن أن تنمو تحت ظروف بيئية مختلفة بما في ذلك تلك التي لديها معدلات تدفق مختلفة. على سبيل المثال، يمكن أن تنمو الأفلام في إجهاد القص عالية، كما هو الحال في الأنهار، حيث تؤدي ظروف تدفق المياه العالية إلى تنوع الميكروبي أكبر22. على النقيض من ذلك، تجربة المياه الراكدة في البرك أو الأغشية الحيوية عن طريق الفم كثير أقل قص قوة23. بالإضافة إلى معدل التدفق، وهناك عوامل أخرى تؤثر على التصاق بيوفيلم، بما في ذلك خشونة السطح وهيدروفوبيسيتي، تركيب وسائل الإعلام، وحتى البكتريا الخلية السطحية1،،من47، 24-شروط يمكن أيضا أن يسبب الاختلاف في الهيكل المكاني أو مورفولوجية بيوفيلم. وهذا يشمل الظروف البيئية مثل إجهاد القص تمارسها سائل تتحرك أو التدرجات في توافر المغذيات والعوامل البيولوجية مثل الأنواع الموجودة في النظام وحركية من الخلايا والبروتينات المحددة الموجودة في الخلية مادة البوليمر25،،من2627. في ظل بعض الظروف، سيكون بيوفيلم الشبيهة بالحديقة (السلس وشقة)، في حين في ظل ظروف أخرى بيوفيلم سوف تكون خشنة، رقيق، أو حتى مثل فطر28. بينما الفرق النوعي بين المروج بيوفيلم والهياكل فطر يمكن رؤيتها بوضوح في الصور المجهرية، فهم العلاقة بين بنية الفيلم والعمليات البيولوجية داخل الفيلم يتطلب منهجية والكمية أساليب وصف مورفولوجية. تتضمن الخصائص المورفولوجية اقترحه الباحثون لدراسة المسامية، البعد كسورية، وطول ديفوسيونال، منطقة ميكروكولوني التحتية وحجم ميكروكولوني، ومعامل الخشونة، والتكوينية الانتروبيا29،30 .
وتستخدم المفاعلات الحيوية في دراسة الأغشية الحيوية لتحاكي ظروف الحياة الحقيقية31. بالتنقيط تدفق المفاعلات (الترميد) تمثل بيئة القص المنخفض حيث تدفق المواد المغذية في وسائل الإعلام ببطء عبر الخلايا التي يتم إرفاق إلى سطح على مر الزمن لتشكيل بيوفيلم مع خلية عالية كثافة32. مفاعلات مركز السيطرة على الأمراض بالمفاعلات الحيوية التي تخلق بيئة السوائل عالية القص إجهاد عن السيطرة على قضيب إثارة يدور باستمرار داخل وسائط الإعلام ملء خزان33. هذه الأنواع من المفاعلات الحيوية بسيطة لإعداد، ولكن محدودة في نطاقها بسبب حجم العينة منخفضا نسبيا، الاستهلاك المرتفع لوسائط الإعلام، وكميات كبيرة من النفايات اوتوكلاف المنتجة من وسائل الإعلام بالتنقيط التدفقات تتراوح بين 125 ميليلتر الدقيقة للمفاعلات تدفق بالتنقيط إلى أكثر من 1 مل/دقيقة لمفاعلات مركز السيطرة على الأمراض، والحاجة إلى اﻷوتوكﻻف كميات كبيرة من الأواني الزجاجية والنفايات الوسائط34. الأغشية الحيوية لا تنمو بشكل متساو عبر السطح في مفاعل تدفق بالتنقيط لأنه يسبب القص المنخفض لوسائل الإعلام زائدة على طول تكتلات أكبر من P. الزّنجاريّة البكتيريا ولذلك، نمو بيوفيلم ليس سلس جداً ولا يمكن أن تكون العينات غير متكافئ حلل بسهولة مع الأسفار مجهرية35،36 .
يتم التغلب على بعض القيود الشائعة في مفاعل حيوي باستخدام مفاعل حيوي موائع جزيئية الإنتاجية المتوسطة، حيث مطلوبة فقط ملليلتر من وسائل الإعلام، ولوحات رد فعل صغيرة ويسهل التخلص منها بعد التعقيم37. وعلاوة على ذلك، تبعاً لعدد الآبار، تكرار العديد من يمكن أن يؤديها في مفاعل واحد فقط تشغيل، مما يوفر كمية كافية من البيانات لإجراء التحليل الإحصائي ذات مغزى. ويرد في الشكل 1، المكونات المختلفة لنظام الفحص المجهري موائع جزيئية تسمح لظروف خاضعة للرقابة، بما في ذلك درجة الحرارة وتدفق معدل38،،من3940،. مفاعل حيوي يقترن بالأسفار الفحص المجهري لتصور الأسفار علامة اجفب في PA01 تحت تطبيق منخفضة من خلال شروط القص العالية التي سوف تحاكي سيناريوهات أكثر واقعية التي تتم مواجهتها في البيئة أو في مجال الطب الحيوي.
الشكل 1 : المكونات الفردية لنظام موائع جزيئية. يتم سرد المكونات الفردية من اليسار إلى اليمين: 1. كاميرا CCD، 2. “المجهر المقلوب القرار عالية” مع المرحلة الآلي والآلي وحدة الأسفار، وضبط تلقائي للصورة النمطية، 3. “لوحة المرحلة” 4: نظام واجهة، 5 التصوير: “دليل المجهر المرحلة” التحكم، 6: مصيدة بخار، 7: نظام تحكم (بما في ذلك درجة الحرارة)، 8 التصوير: “وحدات تحكم الأجهزة”، 9: Fluorescence تحكم، 10: “إمداد الطاقة غير المتقطعة”، 11: محرك قرص “ثابت خارجي” “تخزين الصور”، 12: كمبيوتر محطة عمل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
ويرد في الشكل 2مقتطفات من لوحة موائع جزيئية. لوحات الأكثر شيوعاً تتكون من 48 بئرا. تجربة واحدة يتطلب مدخل واحد والآبار منفذ واحد، ومجموعة من الآبار 2. وهذا يسمح ل 24 تجارب المتزامنة التي يمكن تنفيذها مع مختلف الظروف التجريبية، مثل السلالات البكتيرية، العلاجات المضادة للميكروبات، ووسائل الإعلام تختلف من قناة إلى قناة، والتحكم في تدفق القص لكل عمود من ست قنوات. تسيطر درجة الحرارة التجريبية أيضا مع إعداد واحد من درجة الحرارة في جميع أنحاء اللوحة. قنوات موائع جزيئية تبين أن كل قناة منطقة السربنتين توفير الضغط الخلفي كافية والقص التي تسيطر عليها.
الشكل 2: التصور قنوات موائع جزيئية ونافذة عرض. يتم تمييز بئرين مدخل ومخرج مع القنوات موائع جزيئية ربطها مع الأصباغ الحمراء والخضراء. الصبغ يجعل تظهر منطقة السربنتين في كل قناة مما يخلق ضغطاً كافياً على الظهر والقص الخاضعة للرقابة أثناء تدفق السائل. يمكن تصويرها كل قناة العرض (داخل الدائرة الحمراء) مع أطوال موجية المرجوة. يظهر هي ميدان مشرق (أعلى) ونيون (أسفل) صور مجهرية من قناة واحدة مع بيوفيلم PA01-اجفب استخدام هدفا X 20. شريط المقياس = 80 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
ويرد دليل خطوة بخطوة للسماح للمستخدمين من موائع جزيئية المفاعلات الحيوية التي تقترن بالأسفار الفحص المجهري لإجراء تجارب بيوفيلم رواية استخدام بيئات مختلفة القص. سيسمح هذا الأسلوب لتوسيع نطاق التجارب التي تشمل الكائنات الحية الدقيقة الأخرى إلى جانب البكتيريا، مثل الفطريات، والطحالب، والتي تحتوي على التطبيقات الطبية والبيئية41،،من4243. نهج مفصل يصف كيف لثقافة PA01-اجفب وتطعيم لوحة 48-جيدا وقم بإعداد الجهاز موائع جزيئية والبرمجيات وإعداد مجهر فلوري ويثبت تحليل البرامج للحصول على تغطية بيوفيلم، معدل النمو، و الخصائص المورفولوجية مثل خشونة السطح.
Protocol
Representative Results
Discussion
مناقشة إجراءات تحليل النظام وصورة موائع جزيئية هنا يركز على تنفيذ تجارب بيوفيلم موائع جزيئية لتحديد الخصائص المورفولوجية التي لا تتطلب المعلومات كاملة ثلاثية الأبعاد التي توجد عادة من [كنفوكل] دراسات المجهر. وشملت هذه ميكروكولوني التحتية التغطية (نسبة التغطية)، يقاس بمعامل خشونة، والتكوينية الانتروبيا خشونة السطح. تقدم طريقة لتقدير تراكم الخلية بيوفيلم النسبية الإجمالية أيضا يمكن أن تحسب من معدلات النمو الذي سجل في المرحلة.
وهناك عدة خطوات صغيرة ولكنها هامة ينبغي إبرازها في هذا الأسلوب. مسح الواجهة مع الكحول يساعد على تجنب تلوث بكتيريا الأخرى في الانتقال من التجربة للتجربة ولكن أيضا من بئر في تجربة واحدة. فتيلة والبذر أيضا جداً مهم لأنه يسمح للمستخدم بتحديد القنوات التي يتم السماح لوسائل الإعلام لتدفق من خلال القنوات دون أي اضطرابات من فتيلة أو انسداد. كما ينبغي أن تكون قنوات لا يقلقها (أي أنها ينبغي الدوام الكامل لوسائل الإعلام) بعد فتيلة لزيادة فرص تجربة ناجحة مع لا فقاعات الهواء أو انسداد. يمكن أن تختلف وفقا لنوع البكتيريا خطوة البذر وهكذا ينبغي أن يكون الأمثل لمرفق خلية. على سبيل المثال، إذا الخلايا لا يبدو أن نعلق، التعديلات السطحية وقد تحدث على لوحة موائع جزيئية قبل البذر أو أوقات أطول في إينكوباتيونس قد تكون مطلوبة. من المهم أيضا أن نتأكد من أن المجهر تم إعداده بشكل صحيح للحصول على صورة في التركيز، وينبغي أن ترصد بشكل دوري في جميع أنحاء هذه التجربة لضمان الحصول على صور عالية الجودة. إذا كان التركيز، المجهر يمكن وينبغي تعديلها حسب ما زالت التجربة. خلال فترة اقتناء الصورة، يجب تعيين الطول الموجي الماضي إلى إغلاق جميع تجنبا لتعرض المرشحات والإضاءة لقناة واحدة فقط خلال فترة الانتظار التي تحدث بين امتلاك الصورة. أيضا، تحليل الصور التي تحدد تغطية سطح % صمم في البيت لأنه دليل البرامج المونتاج لم تصف صراحة الإجراء. وعلاوة على ذلك، بغية توسيع نطاق تحليل الصور وتحديد الخصائص الأخرى مثل خشونة السطح، إلخ.، وفتح مصدر التعليمات البرمجية على أساس بيثون45 وضعت في منزل والمشتركة في المستودع gitHub. وهناك أيضا قيود على كمية البيانات التي يمكن تخزين وإدارتها على محرك الأقراص الثابت المحلي، حيث هناك حاجة إلى محرك القرص الثابت الخارجي أو تبادل البيانات على شبكة الإنترنت مثل سيفيرسي46.
المفاعلات الحيوية التقليدية، مثل المفاعل مركز السيطرة على الأمراض، و مفاعل بالتنقيط تدفق34، تتطلب الكثير من وسائل الإعلام، وتوفير عدد أقل من حجم العينة، والطلب على كمية عالية من التعقيم للمعدات. وفي المقابل، مزايا هذا المنهاج إنتاجية أعلى وتشمل القدرة على مراقبة القص، معدلات التدفق، ويشابه الافتراض بأن التجارب في المختبر عن كثب الأوضاع في فيفو . عيوب النظام تتضمن الملحقات متعددة، والبرمجيات التي تتطلب الإعداد الدقيق أنه يجب أن يتم بالترتيب الصحيح للأحداث. وعلاوة على ذلك، الدليل التي يتم توفيرها للمعدات لا يفسر تماما كل خطوة من هذه التجارب، وأوامر البرمجيات، ونتيجة لذلك، تحدث أخطاء كثيرة خلال هذه التجارب، بما في ذلك انسداد القنوات، نقص النمو أو الحجز، أو عدم جودة عالية مجهرية الصور أو الأفلام. الصك نفسه، والمواد الاستهلاكية، مثل لوحات موائع جزيئية، وهي أيضا مكلفة نسبيا مع سعرها أكثر من 200 دولار للوحة الواحدة وليست قابلة لإعادة الاستخدام. وهكذا، بينما الأسلوب الذي يعطي نتائج قوية، الخبرة الفنية اللازمة لاستخدامها مرتفع نسبيا ويتطلب التدريب المتكررة من جانب الخبراء في هذا المجال. ويحاول هذا التقرير حل هذه المشكلة عن طريق توفير دليل للمستخدمين الجدد لهذه المفاعلات الحيوية لدراسة خصائص الأغشية الحيوية.
اكتسب نظام موائع جزيئية، وقادرة على القيام بالتحليل الخلوي، قدرا كبيرا من الاهتمام لمختلف الطرائق العلمية، كما هو الحال في علم الأحياء الدقيقة وعلم المناعة، وأمراض الدم، الأورام وبحوث الخلايا الجذعية. وبشكل أكثر تحديداً، أدى العديد من منشورات تصف المواضيع التي وثيقة الصلة بالتطبيقات الطبية37،47، بما في ذلك الجراثيم الالتصاق الشفوي48، تحديد الآثار المترتبة على التكنولوجيا استضافة بيوسورفاكتانتس الزائفة الزّنجاريّة و المكوّرات العنقودية الذهبية49،50، التفاعلات بين العوامل الممرضة في كولاي51، العقدية التقيد52، والعلاج من التليف الكيسي53. ونظرا لحقيقة أن هذا النظام موائع جزيئية شديد التنوع، فمن المتوقع أنه سيتم توزيع أنظمة أكثر وأكثر في جميع أنحاء العالم.
ينبغي النظر بعناية في بعض الخطوات المحددة في البروتوكول. وسائل الإعلام يمكن أن تضعف إلى 50% مع dH2س للمساعدة في منع الفقاعات وانسداد ولكن لم يكن مطلوباً في هذه الحالة. يجب تحديد قيمة محددة OD600 المستخدمة لبذر استخدام يدير المحاكمة من تجربة النمو لمعرفة ما يعمل بشكل أفضل لمجموعة معينة من الظروف المستخدمة. يمكن أن يؤدي إلى فقاعات في قنوات موائع جزيئية فقاعات في الآبار قبل الختم وينبغي إزالة أي برزت أو امتص بها مع تلميح ماصة. من المهم أن تبقى البكتيريا خارج القنوات السربنتين الصغيرة. بوجود كميات متساوية من وسائل الإعلام في الإدخال والإخراج أثناء عملية البذر، فسيتم التحكم تدفق بسبب الضغط من حجم السائل وبالتالي تدفق فقط بسبب ضغوط النظام المطبق. وينبغي إعداد المسافات المعايرة أثناء التثبيت ممثل الشركة. هذه الإعدادات محددة لكل كاميرا.
وهناك العديد من التحديات التي تحدث عند العثور على عتبة الأكثر تمثيلاً لصورة. تعيين قيم الحد الأقصى يمكن أن يكون صعباً إذا كانت كثافة بكسل المتوسط عبر المناطق الخلفية غير متناسقة تسببها أما تحديد موقف مرحلة التي ليست في المركز للقناة أو من الحطام على اللوحة. إطار قياسي MM، انقر فوق العملية، ومن ثم حدد أداة أساسية وتصحيح التظليل لتصحيح حالات عدم التناسق هذه. ومع ذلك، هذه الأداة عموما فقط مفيداً إذا كان المستخدم قد اتخذت صوراً القنوات قبل البذر التي يمكن استخدامها كمرجع الصور. أو، إذا كان مرجع تظليل الخلفية/الصور غير متوفرة، وسوف يحتاج المستخدم إلى استخدام حكمهم لتعيين قيمة عتبة التي تغطي معظم منطقة الخلية دون بما في ذلك الخلفية للصورة بأكملها. وبدلاً من ذلك، حدد المناطق تمثيلاً لقياس أن استبعاد مناطق عدم تناسق من فوق منطقة مستطيلةأو منطقة القطع الناقصأو المنطقة تتبع تحديد منطقة وحدد المنطقة النشطة بدلاً من كامل صورة في إطار إظهار إحصائيات المنطقة (تحت أدوات التحليل). إذا كان يستخدم منطقة ممثل للعتبة صورة مشرقة الميدانية، ينبغي أن تستخدم نفس المنطقة لقياس الصورة فيتك المقابلة. أنه من المفيد أن تسجل الإحصاءات المكانية محددة (غادر، أعلى، العرض، الارتفاع، و منطقة، و محيط) المرتبطة بتلك المنطقة الممثل حيث سيتم العثور على نفس المنطقة و قياس الصورة فيتك المقابلة.
لمنع تراكم البيانات على محرك الأقراص الثابت الذي سوف يؤدي إلى إبطاء الكمبيوتر، يمكن شراء قرص صلب خارجي لتخزين البيانات. وثمة خيار آخر لتخزين البيانات، وتيسير تبادل البيانات هو منصة المعلوماتية الحيوية سيفيرسي. إنشاء حساب على نظام سيفيرسي بالذهاب إلى http://www.cyverse.org/. بمجرد تسجيل الدخول، شن “البيئة الاكتشاف” ثم حدد “سجل في سيفيرسي”. حدد “البيانات“، ثم انتقل إلى كنت المجلد. إذا كان المكدس الصورة على الكمبيوتر المحلي ثم حدد “تحميل“، ثم “تحميل بسيطة من سطح المكتب“. العثور على الملف المكدس الصورة وحدد للتحميل. الملف أو مجلد يمكن تقاسمها مع المتعاونين إذا كان لديك حساب في سيفيرسي، ويتم منح الإذن. تتطلب مشاركة المجلد البيانات للجمهور العام تضاف هذه البيانات الوصفية لكل ملف باستخدام سيفيرسي الموافقة على المعايير. هذا الإجراء لن تناقش هنا لأن هذا ليس في نطاق هذا العمل.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل قد أمكن من المنح المقدمة من المعهد الوطني للعامة الطبية العلوم (نيجمس) (5P20GM103427)، مكون من المعاهد الوطنية للصحة (NIH)
Materials
| Ammonium Chloride, ACS | VWR | BDH9208-500G | Part of the minimal media composition |
| BioFlux 1000 48 Well Low Shear Plate | Fluxion Biosciences | 910-0047 | |
| BioFlux 1000Z Microfluidic Imaging System | Fluxion Biosciences | BF 1000Z | |
| Calcium Chloride Dihydride, ACD Grade | VWR | 97061-904 | Part of the minimal media composition |
| Dextrose, Anhydrous, ACS | VWR | BDH9230-500G | Part of the minimal media composition |
| Magnesium Sulfate ACS Grade | VWR | EM-MX0070-1 | Part of the minimal media composition |
| Potassium Phosphate Monobasic, ACS Grade | VWR | BDH9268-500G | Part of the minimal media composition |
| Pseudomonas Aeurginosa GFP | ATCC | 15692GFP | Pseudomonas aeurinosa bacterial strain PA01 with GFP modification used for this study. |
| Sodium Chloride, ACS | VWR | BDH9286-500G | Part of the minimal media composition |
| Sodium Phosphate, Monobasic, Anhydrous, Reagent Grade | VWR | 97061-942 | Part of the minimal media composition |
References
- Donlan, R. M., et al. Model System for Growing and Quantifying Streptococcus pneumoniae Biofilms In Situ and in Real Time. Applied and Environmental Microbiology. 70 (8), 4980-4988 (2004).
- Lührig, K., et al. Bacterial Community Analysis of Drinking Water Biofilms in Southern Sweden. Microbes and Environments. 30 (1), 99-107 (2015).
- Singh, R., Paul, D., Jain, R. Biofilms: implications in bioremediation. Trends in Microbiology. 14 (9), 389-397 (2006).
- Veerachamy, S., et al. Bacterial adherence and biofilm formation on medical implants: A review. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 228 (10), 1083-1099 (2014).
- Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
- Percival, S. L., Knapp, J. S., Edyvean, R., Wales, D. S. Biofilm Development On Stainless Steel In Mains Water. Water Research. 32 (1), 243-253 (1998).
- Percival, S. L., Knapp, J. S., Wales, D. S., Edyvean, R. G. J. The effect of turbulent flow and surface roughness on biofilm formation in drinking water. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 22 (3), 152-159 (1999).
- Ling, F., Whitaker, R., LeChevallier, M. W., Liu, W. -. T. Drinking water microbiome assembly induced by water stagnation. The ISME Journal. , 1 (2018).
- Moss, B. Water pollution by agriculture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1491), 659-666 (2008).
- Schultz, M. P., Bendick, J. A., Holm, E. R., Hertel, W. M. Economic impact of biofouling on a naval surface ship. Biofouling. 27 (1), 87-98 (2011).
- Tornero, V., Hanke, G. Chemical contaminants entering the marine environment from sea-based sources: A review with a focus on European seas. Marine Pollution Bulletin. 112 (1-2), 17-38 (2016).
- LaBauve, A. E., Wargo, M. J. Growth and Laboratory Maintenance of Pseudomonas aeruginosa. Current Protocols in Microbiology. 25 (1), 1-8 (2012).
- He, J., et al. The broad host range pathogen Pseudomonas aeruginosa strain PA14 carries two pathogenicity islands harboring plant and animal virulence genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (8), 2530-2535 (2004).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R. An Enhanced Green Fluorescent Protein Allows Sensitive Detection of Gene Transfer in Mammalian Cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 227 (3), 707-711 (1996).
- Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 73 (5), 2782-2790 (1997).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirche, G., Ward, W. W., Prashert, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Heim, R., Prasher, D., Tsien, R. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 12501-12504 (1994).
- Bakke, R., Kommedal, R., Kalvenes, S. Quantification of biofilm accumulation by an optical approach. Journal of Microbiological Methods. 44 (1), 13-26 (2001).
- Heydorn, A., et al. Statistical analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm development: impact of mutations in genes involved in twitching motility, cell-to-cell signaling, and stationary-phase sigma factor expression. Applied and Environmental Microbiology. 68 (4), 2008-2017 (2002).
- Wilson, E., et al. Using Fluorescence Intensity of Enhanced Green Fluorescent Protein to Quantify Pseudomonas aeruginosa. Chemosensors. 6 (21), (2018).
- Fang, H., Chen, Y., Huang, L., He, G. Analysis of biofilm bacterial communities under different shear stresses using size-fractionated sediment. Scientific Reports. 7 (1), 1299 (2017).
- Saunders, K. A., Greenman, J. The formation of mixed culture biofilms of oral species along a gradient of shear stress. Journal of Applied Microbiology. 89 (4), 564-572 (2001).
- Valquier-Flynn, H., Wilson, C. L., Holmes, A. E., Wentworth, C. D. Growth Rate of Pseudomonas aeruginosa Biofilms on Slippery Butyl Methacrylate-Co-Ethylene Dimethacrylate (BMA-EDMA), Glass and Polycarbonate Surfaces. Journal of Biotechnology & Biomaterials. 7 (4), (2017).
- Trulear, M. G., Characklis, W. G. Dynamics of biofilm processes. Journal (Water Pollution Control Federation). 54 (9), 1288-1301 (1982).
- Machineni, L., Rajapantul, A., Nandamuri, V., Pawar, P. D. Influence of Nutrient Availability and Quorum Sensing on the Formation of Metabolically Inactive Microcolonies Within Structurally Heterogeneous Bacterial Biofilms: An Individual-Based 3D Cellular Automata Model. Bulletin of Mathematical Biology. 79 (3), 594-618 (2017).
- Jiao, Y., et al. Identification of Biofilm Matrix-Associated Proteins from an Acid Mine Drainage Microbial Community. Applied and Environmental Microbiology. 77 (15), 5230-5237 (2011).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The Biofilm Matrix. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 632-633 (2010).
- Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Quantifying biofilm structure using image analysis. Journal of Microbiological Methods. 39 (2), 109-119 (2000).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4 (3), 783-788 (2009).
- Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology. 151, 757-762 (2005).
- Swartz, K., Stephenson, R., Hernandez, M., Jambang, N., Boles, B. R. The use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus biofilm analysis. Journal of Visual Experiments. (46), e2470 (2010).
- Werner, E., et al. Stratified Growth in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).
- Wilson, C., et al. The Quantitative Assessment of Pseudomonas aeruginosa (PA)14 Biofilm Surface Coverage on Slippery Liquid Infused Polymer Surfaces (SLIPS). International Journal of Nanotechnology in Medicine & Engineering. 3 (3), 35-42 (2018).
- Samarian, D. S., Jakubovics, N. S., Luo, T. L., Rickard, A. H. Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (94), 52467 (2014).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
- Kim, J., Park, H. -. D., Chung, S. Microfluidic Approaches to Bacterial Biofilm Formation. Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).
- Mosier, A. P., Cady, N. C. Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems. Science Progress. 94 (4), 431-450 (2011).
- Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annual Review of Microbiology. 69, 71-92 (2015).
- Chandra, J., Kuhn, D. M., Mukherjee, P. K., Hoyer, L. L., McCormick, T., Ghannoum, M. A. Biofilm Formation by the Fungal Pathogen Candida albicans: Development, Architecture, and Drug Resistance. Journal of Bacteriology. 183 (18), 5385-5394 (2001).
- Vasconcelos, M. A., et al. Effect of Algae and Plant Lectins on Planktonic Growth and Biofilm Formation in Clinically Relevant Bacteria and Yeasts. BioMed Research International. 2014, 9 (2014).
- Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. Textural Features for Image Classification. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 3 (6), 610-621 (1973).
- . Biofilm Morphology Suite Available from: https://github.com/cdwentworth/Biofilm-Morphology-Suite.git (2018)
- . Cyverse Available from: https://user.cyverse.org/services/mine (2018)
- Benoit, M. R., Conant, C. G., Ionescu-Zanetti, C., Schwartz, M., Matin, A. New Device for High-Throughput Viability Screening of Flow Biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 76 (13), 4136-4142 (2010).
- Ding, A. M., Palmer, R. J., Cisar, J. O., Kolenbrander, P. E. Shear-Enhanced Oral Microbial Adhesion. Applied and Environmental Microbiology. 76 (4), 1294-1297 (2010).
- Diaz De Rienzo, M. A., Stevenson, P. S., Marchant, R., Banat, I. M. Effect of biosurfactants on Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus biofilms in a BioFlux channel. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (13), 5773-5779 (2016).
- Moormeier, D. E., Bayles, K. W. Staphylococcus aureus Biofilm: A Complex Developmental Organism. Molecular Microbiology. 104 (3), 365-376 (2017).
- Tremblay, Y. D. N., Vogeleer, P., Jacques, M., Harel, J. High-Throughput Microfluidic Method To Study Biofilm Formation and Host-Pathogen Interactions in Pathogenic Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 81 (8), 2827-2840 (2015).
- Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Streptococcus Adherence and Colonization. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 73 (3), 407-450 (2009).
- Díez-Aguilar, M., Morosini, M. I., Köksal, E., Oliver, A., Ekkelenkamp, M., Cantón, R. Use of Calgary and Microfluidic BioFlux Systems To Test the Activity of Fosfomycin and Tobramycin Alone and in Combination against Cystic Fibrosis Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (1), 01650-01717 (2018).
