Scoperta di romanzo sequenza genomica sottrattiva

Lo scopo di questo metodo consiste nell’identificare un’obiettivo novello (T) sequenza genomic, DNA o RNA, da un contesto genomico, o un riferimento (R) (Figura 1). Il metodo è più utile se la destinazione non può essere fisicamente separata, o che sarebbe stato costoso farlo. Solo alcuni organismi hanno perfettamente finito genomi per sottrazione, quindi un’innovazione chiave del nostro metodo è la combinazione di calcolo e metodi di panca in un ciclo che permette ai ricercatori di isolare sequenze bersaglio quando il riferimento è imperfetto, o un progetto genoma da un organismo non-modello. Alla fine di un ciclo, qPCR test viene utilizzato per determinare se è necessario più di sottrazione. Una sequenza di convalidato candidato T mostrerà statisticamente maggiore rilevamento in noti campioni di T-positivi di qPCR.

Incarnazioni del metodo sono state implementate nella scoperta di nuovi bersagli farmacologici batterica che non dispongono di host omologhi^1,2,3,4 e identificazione di nuovi virus da host infetti ^5,6. Oltre alla identificazione di T, il metodo può migliorare r: recentemente abbiamo utilizzato il metodo per identificare 936 geni mancanti dal genoma di riferimento zebra finch e un nuovo gene da una sola linea germinale del cromosoma (T)⁷. La genomica sottrattiva è particolarmente preziosa quando T rischia di essere estremamente divergenti da sequenze conosciute o quando l’identità di T è ampiamente definito, come la zebra finch germline-limitata del cromosoma⁷.

Non richiedendo identificazione positiva di T in anticipo, un vantaggio chiave della genomica sottrattiva è che è imparziale. In uno studio recente, Readhead et al ha esaminato la relazione tra il morbo di Alzheimer e virale abbondanza nelle quattro regioni del cervello. Per identificazione virale, Readhead et al ha creato un database di 515 virus⁸, limitando gravemente l’agenti virali che poteva identificare i loro studio. Sottrattiva genomica potrebbe sono stati utilizzati per confrontare i sani e genomi di morbo di Alzheimer al fine di isolare possibili nuovi virus associati alla malattia, indipendentemente dalla loro somiglianza con gli agenti infettivi noti. Mentre ci sono 263 noto virus umani-targeting, è stato stimato che circa 1,67 milioni da scoprire specie virale esistono, con 631.000-827.000 di loro che hanno un potenziale di infettare gli esseri umani⁹.

Isolamento di nuovi virus è un’area in cui sottrattiva genomica è particolarmente efficace, ma alcuni studi potrebbero non essere necessario tale metodo rigoroso. Ad esempio, studi identificazione nuovi virus hanno usato imparziale high throughput sequenziamento, seguita da trascrizione d’inversione e BLASTx per sequenze virali⁵ o arricchimento degli acidi nucleici virali per estrarre e invertire trascrivono sequenze virali ⁶. mentre questi studi impiegato sequenziamento de novo e assemblaggio, sottrazione non è stato utilizzato perché le sequenze bersaglio sono stati positivamente identificate attraverso BLAST. Se i virus erano completamente nuovi e non correlati (o lontanamente correlate) ad altri virus, genomica sottrattiva sarebbe stato una tecnica utile. Il vantaggio della genomica sottrattiva è che si possono ottenere sequenze che sono completamente nuove. Se è noto il genoma dell’organismo, possono essere sottratti fuori di lasciare eventuali sequenze virali. Ad esempio, nel nostro studio pubblicato abbiamo isolato una romanzo sequenza virale da zebra finch attraverso sottrattiva genomica, anche se non era nostro intento originale⁷.

Sottrattiva genomica si è dimostrata utile per l’identificazione di bersagli di vaccino batterico, motivati dall’aumento drammatico nella resistenza agli antibiotici^1,2,3,4. Per ridurre al minimo il rischio di reazione autoimmune, ricercatori ha ristretto i potenziali bersagli di vaccino sottraendo qualsiasi proteine che sono omologhi nell’ospite umano. Uno studio particolare, guardando la pseudotuberculosi del corinebatterio, eseguita la sottrazione dei genoma ospite vertebrato da diversi genomi batterici per garantire che gli obiettivi della droga possibile non inciderebbe proteine nei padroni di casa che conduce agli effetti collaterali ¹. il flusso di lavoro di base di questi studi è quello di scaricare il proteoma batterico, determinare le proteine vitali, rimuovere le proteine ridondanti, utilizzare BLASTp per isolare le proteine essenziali e BLASTp contro host proteoma per rimuovere eventuali proteine con gli omologhi host ^{1 , 2 , 3 , 4}. In tal caso, genomica sottrattiva assicura che i vaccini sviluppati non avrà alcun effetto fuori bersaglio in host^1,2,3,4.

Abbiamo usato sottrattiva genomica per identificare il primo gene di proteina-codificazione su un limitato di germline cromosoma (GRC) (in questo caso, T), che si trova in germlines ma non somatica tessuto di entrambi i sessi¹⁰. Prima di questo studio, le informazioni solo genomiche che è state conosciute circa il GRC è stato una regione ripetitiva¹¹. De novo montaggio è stato eseguito su RNA sequenziato dai tessuti dell’ovaia e teste (R + T) da adulti zebra fringuelli. L’eliminazione computazionale delle sequenze è stata eseguita utilizzando pubblicati somatica (muscolo) genome sequence (R₁)¹², suo crudo (Sanger) leggere dati (R₂) e un somatico (cervello) trascrittoma (R₃)¹³. L’uso sequenza di tre riferimenti è stato guidato dalla qPCR test passaggio 5 di ciascun ciclo (Figura 2A), mostrando che altre opzioni di filtro è stato richiesto. Il gene α-SNAP scoperto è stato confermato mediante qPCR da DNA e RNA e clonazione e sequenziamento. Vi mostriamo nel nostro esempio che questo metodo è flessibile: non è dipenda su corrispondenti acidi nucleici (DNA vs RNA) e quello sottrazione può essere eseguita con riferimenti (R) che sono costituiti da assembly o crude letture.