Ritmik aktif hazırlanması Vitro yenidoğan kemirgen beyin-omurilik ve ince dilim
Summary
Bu iletişim kuralı hem görsel olarak beyin-omurilik hazırlık iletişim kurar ve beyin sapı enine dilimleri hazırlanması kapsamlı adım adım bir şekilde açıklar. Bu tekrarlanabilirlik artırmak ve beyin solunum bölgelerinden sinir çıkış kayıt için uygun, uzun ömürlü, ritmik aktif dilimleri elde etme olasılığını artırmak için tasarlanmıştır.
Abstract
Memeli inspiratory ritim inspiratory kasların ritmik kasılma sürüş bir sinyal üreten preBötzinger karmaşık denilen medulla (pBC), bir bölgede nöronal ağ üzerinden oluşturulur. Ritmik sinirsel aktivite pBC içinde oluşturulan ve nöronal havuzlarını solunum kas en bloc sinir kayıtları ve enine dilim kayıtları da dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar kullanarak okudu sürücü için yapılır. Ancak, daha önce yayımlanmış yöntemleri yaygın beyin-omurilik diseksiyon işlem gelecekteki çalışmaları için şeffaf ve tekrarlanabilir bir şekilde tarif var değil. Burada, kapsamlı bir genel bakış tekrarlanarak ritmik aktif beyin sapı dilimleri oluşturma ve gönderme inspiratory sürücü için gerekli ve yeterli nöronal devreler içeren kesmek için kullanılan bir yöntem mevcut. Bu eser üzerine güvenilir pBC, hypoglossal premotor nöronlar (XII pMN), nöronal çıktısı kayıt için uygun ve ritmik aktif dilimleri elde etme olasılığını artırmak için önceki beyin-omurilik Elektrofizyoloji protokolleri kurar ve hypoglossal motor nöronlar (XII MN). Sunulan iş önceki Yayınlanan yöntemleri XII rootlets içeren tüp bebek dilim tüm fare yavru, diseksiyon, ayrıntılı, adım adım çizimleri sağlayarak genişletir.
Introduction
Beyin solunum neural ağ ritmik sinir ağları genel özelliklerini anlamak için verimli bir alan sağlar. Özellikle, nefes ve nefes ritim nasıl gelişir anlama yenidoğan kemirgen gelişiminde meselesi. Bu-ebilmek var olmak içinde vivo bütün hayvan pletismografisi, tüp bebek en bloc de dahil olmak üzere sinir kayıtları, çok düzeyli bir yaklaşım kullanarak yapılır ve tüp bebek dilim solunum ritmi jeneratör içeren kayıtları. İndirgemeci vitro tr blok ve dilim kayıtları için solunum rhythmogenesis ve kemirgenler geliştirme beyin-omurilik bölgedeki nöro çevrim arkasında mekanizmaları sorguya kullanılacak avantajlı bir yöntemi vardır. Gelişmekte olan solunum sistemi desen merkezi solunum1,2de dahil olmak üzere, ateş tarafından karakterize yaklaşık 40 hücre tipleri, içerir. Merkezi solunum ağ ritmik aktif nöron ventrolateral rostral medulla1,3‘ te yer alan bir grup içerir. Memeli solunum rhythmogenesis oluşturulan bir autorhythmic üzerinden olmuştur karmaşık preBötzinger lakaplı interneuron ağ (pBC), deneysel olarak lokalize yenidoğan memeli dilim ve en bloc hazırlıkları beyin-omurilik3,4,5,6,7,8kordonlar. Bu bölge merkezinde Sinoatriyal düğüm (SA) benzer bir işleve hizmet eder ve bir inspiratory zamanlama sistemi sürücü solunum için oluşturur. PBC inspiratory ritim (hypoglossal motor çekirdeğini de dahil olmak üzere) beyin sapı ve omurilik motor havuzları (örneğin diyafram sürücü frenik motor nöronlar)9diğer bölgelerinde yapılmaktadır.
Ritmik etkinlik elde edilebilir beyin omurilik tr bloku hazırlıklar veya hücre popülasyonlarının, C3-C5 sinir rootlets, XII sinir rootlets, dahil olmak üzere çeşitli dilimleri kullanarak hypoglossal motor çekirdeğini (XII MN), hypoglossal premotor nöronlar (XII pMN), ve pBC3,10,11,12. Bu yöntemler, veri toplama laboratuvarlar bir avuç arasında başarılı olmuş olsa da, birçok iletişim kurallarının tam olarak alan girerek yeni araştırmacılar için tekrarlanabilir bir şekilde sunulmaktadır değil. Uygun ve ritmik aktif tr blok ve dilim hazırlıklar alma diseksiyon ve dilim kesme protokol tüm adımlarda detaylara akut bir dikkat gerektirir. Önceki iletişim kuralları kapsamlı çeşitli kayıt yordamları ve Elektrofizyoloji tarif henüz eksikliği ayrıntılı olarak uygun doku hazırlık almak en önemli bölümüdür: beyin-omurilik diseksiyon ve dilim işlemi yapmadan.
Verimli bir ritmik-aktif ve uygulanabilir tr blok veya dilim hazırlık beyin-omurilik Elektrofizyoloji kayıtları alma gerektirir tüm adımların doğru dikkatli bir şekilde ve hızla gerçekleştirilmesi (genellikle, tüm prosedürü burada-ebilmek var olmak ilgili «««yapılır) yaklaşık 30 dk içinde. Kritik noktaları beyin-omurilik Elektrofizyoloji protokolünün değil daha önce de tarif edilmistir sinir rootlets ve vibratome Dilimleme ameliyat diseksiyon içerir. Kademeli ilk görsel olarak beyin-omurilik diseksiyon yeni araştırmacılar ve alanında uzman için iletişim kuralıdır. Bu iletişim kuralı da iyice cerrahi teknikleri, simge ve gelecekteki araştırmacılar dilimleri ve en bloc hazırlıkları her deneyde istenen tam devre içerecek şekilde standartlaştırılması yardımcı olmak için diğer yordamları açıklar. Burada sunulan yordamları fare ve fare yenidoğan pups içinde kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol adapte burada sunulan bir tr blok veya dilim iş akışı laboratuarlar için avantajlıdır ve ya en bloc beyin-omurilik kullanmak ve/veya ince istiyorum çalışmalar Elektrofizyoloji kayıtları için hazırlıklar dilim. Diseksiyon ve dilim yöntem sundu, daha önce başkaları tarafından rapor yöntemleri ile birlikte17,18,19, tekrarlanabilir hazırlanması için bir dizi yaygın olarak uyarlanabilir sağlam ve uy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.B.P bir Loma Linda Üniversitesi yaz lisans araştırma bursu bir alıcı var.
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-1KG | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma Aldrch | S9638-25G | |
| CaCl2•2H2O | Sigma Aldrich | C7902-500G | |
| MgSO4•7H2O | Sigma Aldrich | M7774-500G | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270-1KG | |
| Cold-Light source Halogen lamp 150W | AmScope | H2L50-AY | |
| Dissection Microscope | Leica | M-60 | |
| Vibratome 1000 Plus | Vibratome | W3 69-0353 | |
| Magnetic Base | Kanetic | MB-B-DG6C | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Sword Classic Double Edge Blades | Wilkinson | 97573 | |
| Histoclear | Sigma-Aldrich | H2779 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5/45 Forcep | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handel #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Spring Scissors Straight | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Narrow Pattern Forcep Serrated/straight | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight | Roboz | RS-5650 | |
| Vannas Scissors 3" Curved | Roboz | RS-5621 | |
| Insect pins, 0 | Fine Science Tools/8840604 | 26000-35 | |
| Insect pins, 0, SS | Fine Science Tools | 26001-35 | |
| Insect pins, 00 | Fine Science Tools | 26000-30 | |
| Insect pins, 00, SS | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Insect pins, 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Insect pins, 000, SS | Fine Science Tools | 26001-25 | |
| Minutien pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Minutien pins, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Minutien pins, 0.2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Fisher Tissue prep Parafin | fisher | T56-5 | |
| Graphite | fisher | G67-500 | |
| Delrin Plastic | Grainger | 3HMT2 | |
| 18 Gauge Hypodermic Needle | BD | 305195 |
References
- Hilaire, G., Duron, B. Maturation of the Mammalian Respiratory System. Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).
- Pinkerton, K. E., Joad, J. P. The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children’s Health. Environmental Health Perspectives. 108, 6 (2000).
- Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science. 254, 726-729 (1991).
- Smith, J. C., et al. Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model. Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).
- Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. Selective lesioning of the cat pre-Bötzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping. The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).
- Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-Bötzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons. Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).
- Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).
- Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreBötzinger Complex. Journal of Neuroscience. 20, 113 (2000).
- Rousseau, J. -. P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. Journal of Visualized Experiments. , e53071 (2015).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
- Koizumi, H., et al. Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro. Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).
- Danneman, P., Mandrell, T. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).
- Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respiratory Physiology & Neurobiology. 205, 61-65 (2015).
- Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).
- Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).
- Negro, C. A. D., et al. Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation. Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).
- Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-Bötzinger Complex “Island”. Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).
- Funk, G. D., et al. Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene. Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).
- Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).
- Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro. NeuroReport. 6, 165-168 (1994).
- Ruangkittisakul, A., et al. High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices. Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).
- Rybak, I. A., et al. Modeling the ponto-medullary respiratory network. Respiratory Physiology & Neurobiology. 143, 307-319 (2004).
- Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated ‘sandwich’ slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons. Physiological Reports. 2, (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).
