Preparación de rítmicamente activa en Vitro Neonatal roedor del médula oblonga-medulares y rebanada fina
Summary
Este protocolo tanto visualmente comunica la preparación de la médula espinal de la médula oblonga y aclara la preparación de cortes transversales del tronco encefálico de forma integral paso a paso. Fue diseñado para aumentar la reproductibilidad y mejorar la probabilidad de obtener rodajas viables, duraderas, rítmicamente activa para grabación salida neuronal de las regiones respiratorias del tronco encefálico.
Abstract
Mamífero ritmo inspiratorio se genera de una red neuronal en una región de la médula llamada la preBötzinger complejo (pBC), que produce una señal que conduce a la contracción rítmica de los músculos inspiratorios. Actividad neuronal rítmica generada en el pBC y llevado a otras piscinas neuronales a la musculatura de la respiración puede ser estudiada mediante varios enfoques, incluyendo en bloque del nervio grabaciones y grabaciones de corte transversal en coche. Sin embargo, métodos previamente publicados no han descrito el proceso de disección de la médula espinal tronco encefálico extensivamente de manera transparente y reproducible para futuros estudios. Aquí, presentamos una visión completa de un método reproducible Cortar rodajas rítmicamente activa del médula oblonga que contiene los circuitos neuronales necesarios y suficientes para generar y transmitir la impulsión inspiratoria. Este trabajo se basa en protocolos anteriores de electrofisiología de la médula espinal tronco encefálico para aumentar la probabilidad de obtener confiablemente sectores viables y rítmicamente activa para grabación salida neuronal de la pBC, neuronas premotor hipoglosos (XII pMN), y neuronas motoras hipoglosos (XII MN). El trabajo presentado se expande sobre los métodos publicados anteriores proporcionando ilustraciones detalladas, paso a paso de la disección, de crías de rata entera, cortar en vitro con las raicillas XII.
Introduction
La red neuronal respiratoria del médula oblonga proporciona un dominio fértil para entender las características generales de las redes neuronales rítmicas. En particular, el interés es en el desarrollo de roedores neonatales respirar y entender cómo se desarrolla el ritmo de la respiración. Esto puede ser hecho usando un acercamiento de niveles múltiples, incluidas en la pletismografía todo animal vivo, in vitro en bloque del nervio grabaciones e in vitro cortar grabaciones que contienen el generador de ritmo de respiración. Reduccionista en vitro en bloque y rebanar las grabaciones son un método ventajoso utilizar al interrogar los mecanismos detrás de rhythmogenesis respiratoria y los circuitos neuronales en la región de la médula espinal tronco encefálico de desarrollo de roedores. El sistema respiratorio en desarrollo incluye aproximadamente 40 tipos de células, caracterizados por el disparo de patrón, los del centro respiratorio1,2incluidos. La red respiratoria central incluye un grupo de rítmicamente activas neuronas localizadas en la médula ventrolateral rostral1,3. Mamíferos rhythmogenesis respiratorio se genera de un autorhythmic interneurona red apodado el complejo preBötzinger (pBC), que ha sido localizada experimentalmente mediante preparaciones de rebanada y en bloque de mamíferos neonatal tronco encefálico espinal cordones3,4,5,6,7,8. Esta región sirve una función similar a la del nódulo sinoauricular (SA) en el corazón y genera un sistema de tiempo inspiratorio para respiración de la unidad. De la pBC, el ritmo inspiratorio es llevado a otras regiones de la médula oblonga (incluyendo el núcleo hipogloso motor) y piscinas de motor espinal (por ejemplo, las neuronas motoras frénicas que impulsan el diafragma)9.
Actividad rítmica puede obtenerse utilizando preparaciones de médula oblonga médula espinal en bloque o rebanadas de una variedad de poblaciones celulares, incluyendo raicillas del nervio de C3-C5, raicillas de nervio XII, núcleo motor hipogloso (XII MN), neuronas premotor hipoglosos (XII pMN), y el pBC3,10,11,12. Mientras que estos métodos de recogida de datos han tenido éxito a través de un puñado de laboratorios, muchos de los protocolos no se presentan de una manera que es totalmente reproducible para nuevos investigadores entrar en el campo. Viable y rítmicamente activa en la obtención de preparaciones y rebanada requiere una aguda atención al detalle a través de todos los pasos de la disección y el protocolo de corte de rebanada. Protocolos anteriores ampliamente describir los diversos procedimientos de grabación y electrofisiología, sin embargo, carecen de detalle en la parte más crítica de la obtención de una preparación de tejido viable: realizar el procedimiento de disección y corte de médula espinal tronco encefálico.
Eficiente la obtención de una preparación de bloque o rebanada de rítmicamente activa y viable en grabaciones de electrofisiología de la médula espinal tronco encefálico requiere realizar todos los pasos correctamente, con cuidado y rápidamente (por lo general, todo el procedimiento relacionado aquí, puede ser realizado en aproximadamente 30 min). Puntos críticos del Protocolo de electrofisiología de la médula espinal tronco encefálico que no han sido previamente bien descritos incluyen la disección de las raicillas del nervio y el procedimiento de corte en el vibratome. Este protocolo es el primero que paso a paso comunicar visualmente la disección de la médula espinal tronco encefálico para nuevos investigadores y expertos en la materia. Este protocolo explica también muy bien las técnicas quirúrgicas, hitos y otros procedimientos para ayudar a futuros investigadores en estandarización de cortes y preparaciones en bloque para contener el circuito exacto deseado en cada experimento. Los procedimientos aquí presentados pueden usarse en cachorros neonatales de rata y ratón.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adaptando el protocolo presentado aquí en un en bloque o rebanada workflow es ventajosa para los laboratorios y estudios que le gustaría utilizar ya sea medular en bloque del tronco encefálico o delgada rebanada preparados para grabaciones de electrofisiología. El método de disección y corte presentado, combinado con métodos divulgados previamente por otros17,18,19, permitirá la preparación reproducible de tejido viable…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.B.C. es un receptor de una beca de investigación en pregrado Loma Linda Universidad de verano.
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-1KG | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma Aldrch | S9638-25G | |
| CaCl2•2H2O | Sigma Aldrich | C7902-500G | |
| MgSO4•7H2O | Sigma Aldrich | M7774-500G | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270-1KG | |
| Cold-Light source Halogen lamp 150W | AmScope | H2L50-AY | |
| Dissection Microscope | Leica | M-60 | |
| Vibratome 1000 Plus | Vibratome | W3 69-0353 | |
| Magnetic Base | Kanetic | MB-B-DG6C | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Sword Classic Double Edge Blades | Wilkinson | 97573 | |
| Histoclear | Sigma-Aldrich | H2779 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5/45 Forcep | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handel #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Spring Scissors Straight | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Narrow Pattern Forcep Serrated/straight | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight | Roboz | RS-5650 | |
| Vannas Scissors 3" Curved | Roboz | RS-5621 | |
| Insect pins, 0 | Fine Science Tools/8840604 | 26000-35 | |
| Insect pins, 0, SS | Fine Science Tools | 26001-35 | |
| Insect pins, 00 | Fine Science Tools | 26000-30 | |
| Insect pins, 00, SS | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Insect pins, 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Insect pins, 000, SS | Fine Science Tools | 26001-25 | |
| Minutien pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Minutien pins, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Minutien pins, 0.2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Fisher Tissue prep Parafin | fisher | T56-5 | |
| Graphite | fisher | G67-500 | |
| Delrin Plastic | Grainger | 3HMT2 | |
| 18 Gauge Hypodermic Needle | BD | 305195 |
References
- Hilaire, G., Duron, B. Maturation of the Mammalian Respiratory System. Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).
- Pinkerton, K. E., Joad, J. P. The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children’s Health. Environmental Health Perspectives. 108, 6 (2000).
- Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science. 254, 726-729 (1991).
- Smith, J. C., et al. Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model. Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).
- Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. Selective lesioning of the cat pre-Bötzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping. The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).
- Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-Bötzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons. Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).
- Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).
- Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreBötzinger Complex. Journal of Neuroscience. 20, 113 (2000).
- Rousseau, J. -. P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. Journal of Visualized Experiments. , e53071 (2015).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
- Koizumi, H., et al. Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro. Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).
- Danneman, P., Mandrell, T. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).
- Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respiratory Physiology & Neurobiology. 205, 61-65 (2015).
- Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).
- Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).
- Negro, C. A. D., et al. Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation. Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).
- Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-Bötzinger Complex “Island”. Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).
- Funk, G. D., et al. Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene. Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).
- Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).
- Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro. NeuroReport. 6, 165-168 (1994).
- Ruangkittisakul, A., et al. High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices. Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).
- Rybak, I. A., et al. Modeling the ponto-medullary respiratory network. Respiratory Physiology & Neurobiology. 143, 307-319 (2004).
- Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated ‘sandwich’ slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons. Physiological Reports. 2, (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).
