Подготовка ритмично активные в Vitro неонатальной грызунов ствола мозга-спинного мозга и тонкий ломтик
Summary
Этот протокол как визуально общается спинного мозга подготовки и разъясняет подготовку ствола мозга поперечных срезов всеобъемлющим образом шаг за шагом. Он был разработан для увеличения воспроизводимость и повысить вероятность получения жизнеспособных, длительное, ритмично активные фрагменты для записи нейронной вывода из дыхательных регионов мозга.
Abstract
У млекопитающих вдоха ритм генерируется из нейронной сети в регионе мозга называется preBötzinger комплекс (КПБ), которая производит сигнал вождения Ритмичное сокращение мышц вдоха. Ритмические нейронной активности в КПБ и в других нейронов бассейны диск мускулатура дыхания могут быть изучены с использованием различных подходов, включая комплектно нерва и поперечный срез записей. Однако опубликованных ранее методы не описал подробно процесс вскрытия спинного мозга на основе прозрачной и воспроизводимость для будущих исследований. Здесь мы представляем всеобъемлющий обзор метод, используемый для герметизации нарезать ломтиками ритмично активные ствола мозга, содержащий необходимые и достаточные нейрональных схемотехника для генерации и передачи вдоха диск. Эта работа опирается на предыдущие протоколы электрофизиологии спинного мозга для повышения вероятности надежно получения жизнеспособных и ритмично активные фрагменты записи нейронов выходного от КПБ, подъязычного премоторной нейронов (XII ПМН), и подъязычный двигательных нейронов (XII MN). Работы, представленные расширяет предыдущий опубликованные методы, предоставляя подробный, шаг за шагом иллюстрации рассечения, от всего крыса щенка, в пробирке фрагмент, содержащий XII корешков.
Introduction
Респираторные нейронной сети мозга обеспечивает плодородные домен для понимания общие характеристики художественной нейронных сетей. В частности интерес является в развитие новорожденных грызунов дыхание и понять, как развивается ритм дыхания. Это может быть сделано с использованием многоуровневого подхода, в том числе в vivo весь животных плетизмографии экстракорпорального комплектно нерва записи и in vitro фрагмент записи, которые содержат генератор ритм дыхания. Редукционистской в vitro en блока и фрагмент записи являются выгодным методом для использования при опрашивания механизмы за дыхательной ритмогенеза и нейронные цепи в регионе спинного мозга развивающихся грызунов. Развивающихся дыхательная система включает в себя около 40 типов клеток, характеризуется стрельбы шаблон, в том числе из Центральной дыхательных1,2. Центральный дыхательных сеть включает в себя группу ритмично активных нейронов, расположенный в ростральной вентролатеральные продолговатого1,3. Млекопитающих дыхательных ритмогенеза генерируется из autorhythmic межнейронного сети называли preBötzinger комплекс (КПБ), которая была экспериментально локализован через срез и en блока подготовки новорожденных млекопитающих спинного мозга шнуры3,4,5,6,,78. Этот регион служит аналогичную функцию в синоатриальном узле (SA) в самом сердце и создает систему вдоха сроков для привода дыхания. От КПБ вдоха ритм осуществляется в других регионах мозга (включая ядро подъязычного двигатель) и позвоночника мотор бассейнов (например, диафрагмальный двигательных нейронов, которые привод диафрагмы)9.
Ритмической активности может быть получен с помощью спинного мозга en блока препаратов или фрагментов из различных клеточных популяций, в том числе С3-С5 нервных корешков, XII нервных корешков, ядро подъязычного двигатель (XII MN), подъязычного премоторной нейронов (XII ПМН), и КПБ3,10,,1112. Хотя эти методы сбора данных успешно через несколько лабораторий, многие из протоколов не представлены таким образом, чтобы полностью воспроизводимый для новых исследователей, входящие в область. Получения жизнеспособных и ритмично активных en блока и ломтик препаратов требует острого внимания к деталям через все шаги диссекции и ломтик резки протокола. Предыдущих протоколов подробно описывают различные процедуры записи и электрофизиологии, но не хватает деталей в наиболее важной частью получения подготовки жизнеспособных ткани: выполнение процедуры вскрытия и ломтик спинного мозга.
Эффективно получение ритмично активных и жизнеспособной en блока или ломтик подготовка спинного мозга электрофизиологии записей требует все действия правильно, тщательно и быстро (как правило, вся процедура связанных здесь может быть выступал в приблизительно 30 мин.) Критические точки протокола электрофизиологии спинного мозга, которые не были ранее хорошо описаны относятся рассечение нервных корешков и нарезки процедуры на vibratome. Этот протокол является первым поэтапного визуально общаться рассечение спинного мозга для новых исследователей и экспертов в области. Этот протокол также тщательно объясняет хирургические методы, достопримечательности и другие процедуры для оказания помощи будущих исследователей в стандартизации ломтиками и комплектно препараты содержат точные схемы, желательно в каждом эксперименте. Процедуры, представленные здесь могут использоваться в крысы и мыши новорожденных щенков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Адаптация протокола представлены здесь в en блока или ломтик рабочего процесса является выгодным для лабораторий и исследования, которые хотели бы использовать либо комплектно ствола мозга-спинного мозга и/или тонкий ломтик подготовка к записи электрофизиологии. Метод вскрытия и ломт…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.B.P является получателем Лома Линда университета летом Бакалавриат стипендии для проведения исследований.
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-1KG | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma Aldrch | S9638-25G | |
| CaCl2•2H2O | Sigma Aldrich | C7902-500G | |
| MgSO4•7H2O | Sigma Aldrich | M7774-500G | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270-1KG | |
| Cold-Light source Halogen lamp 150W | AmScope | H2L50-AY | |
| Dissection Microscope | Leica | M-60 | |
| Vibratome 1000 Plus | Vibratome | W3 69-0353 | |
| Magnetic Base | Kanetic | MB-B-DG6C | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Sword Classic Double Edge Blades | Wilkinson | 97573 | |
| Histoclear | Sigma-Aldrich | H2779 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5/45 Forcep | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handel #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Spring Scissors Straight | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Narrow Pattern Forcep Serrated/straight | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight | Roboz | RS-5650 | |
| Vannas Scissors 3" Curved | Roboz | RS-5621 | |
| Insect pins, 0 | Fine Science Tools/8840604 | 26000-35 | |
| Insect pins, 0, SS | Fine Science Tools | 26001-35 | |
| Insect pins, 00 | Fine Science Tools | 26000-30 | |
| Insect pins, 00, SS | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Insect pins, 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Insect pins, 000, SS | Fine Science Tools | 26001-25 | |
| Minutien pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Minutien pins, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Minutien pins, 0.2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Fisher Tissue prep Parafin | fisher | T56-5 | |
| Graphite | fisher | G67-500 | |
| Delrin Plastic | Grainger | 3HMT2 | |
| 18 Gauge Hypodermic Needle | BD | 305195 |
References
- Hilaire, G., Duron, B. Maturation of the Mammalian Respiratory System. Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).
- Pinkerton, K. E., Joad, J. P. The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children’s Health. Environmental Health Perspectives. 108, 6 (2000).
- Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science. 254, 726-729 (1991).
- Smith, J. C., et al. Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model. Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).
- Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. Selective lesioning of the cat pre-Bötzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping. The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).
- Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-Bötzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons. Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).
- Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).
- Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreBötzinger Complex. Journal of Neuroscience. 20, 113 (2000).
- Rousseau, J. -. P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. Journal of Visualized Experiments. , e53071 (2015).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
- Koizumi, H., et al. Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro. Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).
- Danneman, P., Mandrell, T. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).
- Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respiratory Physiology & Neurobiology. 205, 61-65 (2015).
- Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).
- Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).
- Negro, C. A. D., et al. Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation. Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).
- Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-Bötzinger Complex “Island”. Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).
- Funk, G. D., et al. Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene. Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).
- Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).
- Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro. NeuroReport. 6, 165-168 (1994).
- Ruangkittisakul, A., et al. High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices. Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).
- Rybak, I. A., et al. Modeling the ponto-medullary respiratory network. Respiratory Physiology & Neurobiology. 143, 307-319 (2004).
- Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated ‘sandwich’ slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons. Physiological Reports. 2, (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).
