Preparazione di ritmicamente-attivo In Vitro neonatale del roditore del tronco cerebrale-spinale e fetta sottile
Summary
Questo protocollo sia visivamente comunica la preparazione del tronco cerebrale-spinale e chiarisce la preparazione di sezioni trasversali del tronco cerebrale in maniera completa e dettagliata. È stato progettato per aumentare la riproducibilità e aumentare la probabilità di ottenere fette praticabile, duraturi, ritmicamente-attivo per la registrazione di output neurali dalle regioni respiratori del tronco cerebrale.
Abstract
Mammiferi ritmo inspiratorio è generata da una rete di un neurone in una regione del midollo chiamato il preBötzinger complex (pBC), che produce un segnale guida la contrazione ritmica dei muscoli inspiratori. Attività neurale ritmica il PBC e ha trasportato ad altre piscine neuronale per la muscolatura della respirazione può essere studiata utilizzando vari approcci, tra cui del blocco dell’en del nervo registrazioni e registrazioni di sezione trasversale in auto. Tuttavia, metodi precedentemente pubblicati non sono ampiamente descritti il processo di dissezione del tronco cerebrale-spinale del cavo in modo trasparente e riproducibile per gli studi futuri. Qui, presentiamo una panoramica completa di un metodo utilizzato riproducibile taglio fette ritmicamente-attivo del tronco cerebrale che contiene la circuiteria neuronale necessaria e sufficiente per la generazione e trasmissione inspiratori in auto. Questo lavoro si basa su protocolli di elettrofisiologia del tronco cerebrale-spinale del cavo precedente per migliorare la probabilità di ottenere in modo affidabile fette praticabile e ritmicamente-attivo per la registrazione di un neurone uscita da pBC, neuroni premotoria hypoglossal (XII pMN), e motoneuroni hypoglossal (XII MN). Il lavoro presentato si espande sulla precedenti metodi pubblicati fornendo illustrazioni dettagliate della dissezione, da cucciolo di ratto intera, fetta in vitro contenenti le radichette XII.
Introduction
La rete neurale respiratoria del tronco cerebrale fornisce un dominio fertile per comprendere le caratteristiche generali delle reti neurali ritmiche. In particolare, l’interesse è lo sviluppo di roditore neonatale respirazione e comprendere come si sviluppa il ritmo del respiro. Questo può essere fatto utilizzando un approccio multi-livello, tra cui in vivo animale intero pletismografia, in vitro del blocco dell’en del nervo registrazioni e in vitro affettare le registrazioni che contengono il generatore di ritmo di respirazione. Riduzionista in vitro en bloc e fetta registrazioni sono un metodo vantaggioso usare quando interrogare i meccanismi dietro rhythmogenesis respiratoria e circuiti neurali nella regione del tronco cerebrale-spinale del cavo di sviluppo di roditori. Lo sviluppo del sistema respiratorio comprende circa 40 tipi di cellule, caratterizzati da sparo modello, compresi quelli del centro respiratorio1,2. La rete respiratoria centrale comprende un gruppo di neuroni ritmicamente attivi che si trova in rostral midollo ventrolateral1,3. Rhythmogenesis respiratorio dei mammiferi è generato da un autorhythmic Interneurone rete soprannominato il preBötzinger complesso (pBC), che è stato localizzato sperimentalmente tramite sia fetta ed en bloc preparazioni a base di mammiferi neonatali tronco cerebrale-spinale cavi3,4,5,6,7,8. Questa regione serve una funzione simile al nodo senoatriale (SA) nel cuore e genera un sistema di cronometraggio inspiratori alla respirazione in auto. Da pBC, il ritmo inspiratorio è trasportato ad altre regioni del tronco cerebrale (tra cui il nucleo motore hypoglossal) e spinale motore piscine (come i motoneuroni frenici che guidano il diaframma)9.
L’attività ritmica può essere ottenuta utilizzando del tronco cerebrale del midollo spinale en bloc preparati o fette da una varietà di popolazioni di cellule, tra cui radichette nervo di C3-C5, radichette del nervo XII, nucleo motore hypoglossal (XII MN), neuroni premotoria hypoglossal (XII pMN), e il pBC3,10,11,12. Mentre questi metodi di raccolta dei dati hanno avuto successo attraverso una manciata di laboratori, molti dei protocolli non sono presentati in un modo che è completamente riproducibile per nuovi ricercatori entrano nel campo. Ottenere praticabile e ritmicamente attivo en bloc e fetta preparazioni richiede un’acuta attenzione al dettaglio attraverso tutte le fasi della dissezione e protocollo di taglio fetta. Precedenti protocolli ampiamente descrivere le varie procedure di registrazione ed elettrofisiologia, ancora prive di dettagli nella parte più critica di ottenere una preparazione di tessuto vitale: eseguire la procedura di dissezione e fetta di tronco cerebrale-spinale.
In modo efficiente ottenere una preparazione di blocco o fetta ritmicamente-attivi e vitali en registrazioni di elettrofisiologia del tronco cerebrale-spinale richiede che essere effettuati tutti i passaggi correttamente, accuratamente e rapidamente (in genere, l’intera procedura relative qui può essere eseguita in circa 30 min). Punti critici del protocollo elettrofisiologia del tronco cerebrale-spinale che precedentemente non sono stati ben descritti includono la dissezione delle radichette del nervo e la procedura per affettare il del vibratome. Questo protocollo è il primo a graduale comunicare visivamente la dissezione del tronco cerebrale-spinale per nuovi ricercatori ed esperti nel campo. Questo protocollo spiega anche accuratamente le tecniche chirurgiche, monumenti e altre procedure per assistere i futuri ricercatori nella standardizzazione fette e del blocco dell’en preparati per contenere il circuito esatto desiderato in ogni esperimento. Le procedure qui presentate possono essere utilizzatoin cuccioli neonatali mouse e del ratto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adattare il protocollo presentato qui in un blocco di it o fetta flusso di lavoro è vantaggiosa per i laboratori e studi che vorrebbero utilizzare entrambi del blocco dell’en del tronco cerebrale-spinale cavo e/o sottile fetta preparativi per registrazioni di elettrofisiologia. Il metodo di dissezione e fetta presentato, combinati con metodi precedentemente segnalati da altri17,18,19, permetterà la preparazione riproducibile d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.B.P è un destinatario di un assegno di ricerca di Loma Linda University Summer Undergraduate.
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-1KG | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma Aldrch | S9638-25G | |
| CaCl2•2H2O | Sigma Aldrich | C7902-500G | |
| MgSO4•7H2O | Sigma Aldrich | M7774-500G | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270-1KG | |
| Cold-Light source Halogen lamp 150W | AmScope | H2L50-AY | |
| Dissection Microscope | Leica | M-60 | |
| Vibratome 1000 Plus | Vibratome | W3 69-0353 | |
| Magnetic Base | Kanetic | MB-B-DG6C | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Sword Classic Double Edge Blades | Wilkinson | 97573 | |
| Histoclear | Sigma-Aldrich | H2779 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5/45 Forcep | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handel #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Spring Scissors Straight | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Narrow Pattern Forcep Serrated/straight | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight | Roboz | RS-5650 | |
| Vannas Scissors 3" Curved | Roboz | RS-5621 | |
| Insect pins, 0 | Fine Science Tools/8840604 | 26000-35 | |
| Insect pins, 0, SS | Fine Science Tools | 26001-35 | |
| Insect pins, 00 | Fine Science Tools | 26000-30 | |
| Insect pins, 00, SS | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Insect pins, 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Insect pins, 000, SS | Fine Science Tools | 26001-25 | |
| Minutien pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Minutien pins, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Minutien pins, 0.2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Fisher Tissue prep Parafin | fisher | T56-5 | |
| Graphite | fisher | G67-500 | |
| Delrin Plastic | Grainger | 3HMT2 | |
| 18 Gauge Hypodermic Needle | BD | 305195 |
References
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