הכנת בקצב אחיד-פעיל חוץ גופית Neonatal מכרסמים גזע המוח-השדרה, פרוסה דק
Summary
פרוטוקול זה מתקשר ההכנה גזע המוח-עמוד השדרה של מבהיר את הכנת פרוסות רוחבי גזע המוח באופן מקיף שלב אחר שלב. זה נועד להגדיל את הפארמצבטית ולשפר את הסבירות של קבלת פרוסות קיימא, לאורך זמן, בקצב אחיד-פעיל עבור הקלטה פלט עצבית מהאזורים הנשימה של גזע המוח.
Abstract
בתרבית של קצב inspiratory מופק ברשת העצבית באזור של לשד בשם preBötzinger את מורכבות (ות ת), אשר מייצר אות נהיגה קצבית התכווצות של השרירים inspiratory. פעילות עצבית הקצבי שנוצר נכסים ובנין ונשאנו לבריכות עצביים אחרים לכונן שמערכת השרירים של הנשימה עשויים להילמד תוך שימוש בשיטות שונות, כולל en bloc עצב הקלטות, הקלטות פרוסה רוחבי. עם זאת, שיטות שפורסמו בעבר לא בהרחבה תיארו את תהליך ניתוח גזע המוח-השדרה באופן שקוף לשחזור עבור מחקרים עתידיים. כאן, אנו מציגים סקירה מקיפה של שיטה המשמשת reproducibly חותכים פרוסות גזע המוח בקצב אחיד-פעיל המכיל את המעגלים עצביים חיוני ומספיק עבור הפקת ושידור נסיעה inspiratory. עבודה זו מתבססת על פרוטוקולים אלקטרופיזיולוגיה גזע המוח-השדרה הקודם כדי להגביר את הסבירות של אמין קבלת פרוסות בקצב אחיד-פעיל ובר קיימא עבור הקלטה עצביים ופלט נכסים ובנין, הנוירונים premotor hypoglossal (נויטרופיל XII), ו hypoglossal מוטורי לגלוקוז (XII MN). העבודה הציגה ומרחיב על שיטות קודמות שפורסמו על-ידי מתן איורים מפורט, צעד אחר צעד של הקרע, מן החולדה כל גור, פרוסה במבחנה המכילה את rootlets XII.
Introduction
הרשת העצבית בדרכי הנשימה של גזע המוח מספק תחום פורייה להבנת מאפייניה של קצבי רשתות עצביות. בפרט, העניין הוא בפיתוח של מכרסם neonatal נושם והבנה איך מתפתח בקצב הנשימה. זה עשוי להיות נעשה שימוש בגישה מרובת רמות, כולל ויוו plethysmography כל בעלי חיים, אין ויטרו en bloc עצב הקלטות, במבחנה לחתוך הקלטות מכילות את הגנרטור קצב הנשימה. רדיוקציוניסטי בהקלטות חוץ גופית en הגוש ופרוסות הן שיטה יתרון לשימוש בעת חקירת המנגנון מאחורי rhythmogenesis הנשימה ואת המעגלים העצביים באזור גזע המוח-עמוד השדרה של פיתוח מכרסמים. מערכת הנשימה פיתוח כולל כ 40 סוגי תאים, המאופיינת על ידי ירי דפוס, כולל אלה של מרכז הנשימה1,2. לרשת מרכזי הנשימה כוללת קבוצה של נוירונים פעילים בקצב ממוקם לשד ventrolateral rostral1,3. Rhythmogenesis הנשימה יונקים נוצר מן autorhythmic interneuron רשת כינו את preBötzinger מורכבים (ות ת), אשר היה מקומי השפעול דרך ההכנות הגוש פרוסה והן en של מידע יונקים neonatal גזע המוח-שדרתית חוטי3,4,5,6,7,8. אזור זה משמש פונקציה דומה סינוס-פרוזדור (SA) בלב ויוצרת מערכת תזמון inspiratory נסיעה נשימה. מ נכסים ובנין, הקצב inspiratory מתבצע באזורים אחרים של גזע המוח (כולל את הגרעין מנוע hypoglossal), בריכות מנוע בעמוד השדרה (כגון הנוירונים מנוע הסרעפת לנהוג הסרעפת)9.
פעילות אומנותית ניתן להשיג באמצעות גזע המוח חוט השדרה en הגוש ההכנות או פרוסות ממגוון רחב של אוכלוסיות תאים, כולל C3-C5 עצב rootlets, rootlets עצב XII, גרעין מנוע hypoglossal (XII MN), hypoglossal premotor נוירונים (נויטרופיל XII), ו נכסים ובנין3,10,11,12. בעוד אלה שיטות איסוף הנתונים היו הצלחה מעבר קומץ של מעבדות, רבים מן הפרוטוקולים לא מוצגים באופן שאינו לשחזור באופן מלא עבור חוקרים חדשים להזין את השדה. קבלת en קיימא ופעיל בקצב ההכנות הגוש ופרוסות דורש תשומת לב חדה לפרטים דרך כל השלבים של דיסקציה, פרוטוקול חיתוך פרוסה. הפרוטוקולים הקודמים בהרחבה לתאר את ההקלטה הליכים שונים, אלקטרופיזיולוגיה, עדיין מחסור פירוט בחלק הקריטי ביותר של קבלת הכנה מעשית רקמות: ביצוע ההליך חיתוך ופרוסות גזע המוח-השדרה.
קבלת ביעילות en בקצב אחיד-פעיל בר -קיימא הגוש או פרוסה הכנה גזע המוח-השדרה אלקטרופיזיולוגיה הקלטות דורש כי כל השלבים להתבצע כראוי, בזהירות ובמהירות (בדרך כלל, כל התהליך קשורים כאן יכול להיות הופיעה כ 30 דקות). נקודות קריטיות של פרוטוקול אלקטרופיזיולוגיה גזע המוח-השדרה לא קודם לכן טוב שתוארו כוללים את הקרע של עצב rootlets, את ההליך עם פרוסות על vibratome. פרוטוקול זה הוא הראשון stepwise באופן חזותי את הקרע גזע המוח-השדרה עבור חוקרים חדשים והן מומחים בתחום. פרוטוקול זה מסביר באופן יסודי גם טכניקות ניתוחיות, ציוני דרך, הליכים אחרים כדי לסייע לחוקרים עתידיים ביצירת אחידות פרוסות והכנות en bloc להכיל את המעגלים המדויק הרצוי ניסוי. הגורים neonatal עכבר ועכבר יכולים לשמש ההליכים המובאים כאן.
Protocol
Representative Results
Discussion
התאמת הפרוטוקול המוצגים כאן לתוך הגוש en או פרוסה זרימת העבודה היא יתרון עבור מעבדות ולחתוך מחקרים כי הייתי רוצה לנצל גם en bloc גזע המוח-השדרה ו/או דק ההכנות להקלטות אלקטרופיזיולוגיה. שיטת חיתוך ופרוסות שהוצגו, בשילוב עם שיטות דיווח בעבר על-ידי אחרים17,18,<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.B.P הוא אחד מנמעני לומה לינדה אוניברסיטת קיץ לתואר ראשון מחקר לאגודה.
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-1KG | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma Aldrch | S9638-25G | |
| CaCl2•2H2O | Sigma Aldrich | C7902-500G | |
| MgSO4•7H2O | Sigma Aldrich | M7774-500G | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270-1KG | |
| Cold-Light source Halogen lamp 150W | AmScope | H2L50-AY | |
| Dissection Microscope | Leica | M-60 | |
| Vibratome 1000 Plus | Vibratome | W3 69-0353 | |
| Magnetic Base | Kanetic | MB-B-DG6C | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Sword Classic Double Edge Blades | Wilkinson | 97573 | |
| Histoclear | Sigma-Aldrich | H2779 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5/45 Forcep | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handel #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Spring Scissors Straight | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Narrow Pattern Forcep Serrated/straight | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight | Roboz | RS-5650 | |
| Vannas Scissors 3" Curved | Roboz | RS-5621 | |
| Insect pins, 0 | Fine Science Tools/8840604 | 26000-35 | |
| Insect pins, 0, SS | Fine Science Tools | 26001-35 | |
| Insect pins, 00 | Fine Science Tools | 26000-30 | |
| Insect pins, 00, SS | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Insect pins, 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Insect pins, 000, SS | Fine Science Tools | 26001-25 | |
| Minutien pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Minutien pins, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Minutien pins, 0.2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Fisher Tissue prep Parafin | fisher | T56-5 | |
| Graphite | fisher | G67-500 | |
| Delrin Plastic | Grainger | 3HMT2 | |
| 18 Gauge Hypodermic Needle | BD | 305195 |
References
- Hilaire, G., Duron, B. Maturation of the Mammalian Respiratory System. Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).
- Pinkerton, K. E., Joad, J. P. The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children’s Health. Environmental Health Perspectives. 108, 6 (2000).
- Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science. 254, 726-729 (1991).
- Smith, J. C., et al. Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model. Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).
- Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. Selective lesioning of the cat pre-Bötzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping. The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).
- Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-Bötzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons. Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).
- Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).
- Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreBötzinger Complex. Journal of Neuroscience. 20, 113 (2000).
- Rousseau, J. -. P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. Journal of Visualized Experiments. , e53071 (2015).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
- Koizumi, H., et al. Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro. Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).
- Danneman, P., Mandrell, T. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).
- Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respiratory Physiology & Neurobiology. 205, 61-65 (2015).
- Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).
- Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).
- Negro, C. A. D., et al. Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation. Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).
- Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-Bötzinger Complex “Island”. Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).
- Funk, G. D., et al. Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene. Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).
- Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).
- Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro. NeuroReport. 6, 165-168 (1994).
- Ruangkittisakul, A., et al. High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices. Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).
- Rybak, I. A., et al. Modeling the ponto-medullary respiratory network. Respiratory Physiology & Neurobiology. 143, 307-319 (2004).
- Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated ‘sandwich’ slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons. Physiological Reports. 2, (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).
