Préparation de rythmiquement actifs In Vitro néonatale rongeurs tronc cérébral-moelle épinière et fine tranche
Summary
Ce protocole tant visuellement communique la préparation du tronc cérébral-moelle épinière et clarifie la préparation des tranches transversale du tronc cérébral d’une façon complète étape par étape. Il a été conçu pour accroître la reproductibilité et la probabilité d’obtenir des tranches viables, durables et rythmiquement actifs pour l’enregistrement de sortie neuronale des régions respiratoires du tronc cérébral.
Abstract
Mammifères rythme inspiratoire est généré à partir un réseau de neurones dans une région du bulbe rachidien appelé la preBötzinger complexe (pBC), produisant un signal conduisant à la contraction rythmique des muscles inspiratoires. Activité neuronale rythmique générée en pBC et transportés aux autres piscines neuronales au lecteur que la musculature de la respiration peut être étudiée en utilisant diverses approches, y compris en bloc nerf enregistrements et tranche transversale. Cependant, méthodes publiées antérieurement n’ont pas largement décrit le processus de dissection du tronc cérébral-moelle épinière de manière transparente et reproductible pour de futures études. Nous présentons ici une vue d’ensemble d’une méthode permettant de façon reproductible couper en tranches de tronc cérébral rythmiquement actifs contenant le circuit neuronal nécessaire et suffisant pour la production et de transmission entraînement inspiratoire. Ce travail s’appuie sur les précédents protocoles d’électrophysiologie de tronc cérébral-moelle épinière pour accroître la probabilité d’obtention fiable des tranches viables et rythmiquement actifs pour l’enregistrement de la sortie neuronale de la pBC, neurones prémoteur hypoglosse (XII pMN), et motoneurones hypoglosse (XII MN). Le travail présenté élargit les précédentes méthodes publiées en fournissant des illustrations détaillées, étape par étapes de la dissection, de chiot tout rat, à in vitro de tranches contenant les radicelles XII.
Introduction
Le réseau de neurones respiratoire du tronc cérébral fournit un domaine fertile pour comprendre les caractéristiques générales des réseaux de neurones rythmiques. En particulier, l’intérêt est dans le développement de rongeurs nouveau-nés respirer et comprendre comment le rythme de la respiration se développe. Cela peut être fait en utilisant une approche à plusieurs niveaux, y compris en pléthysmographie animaux vivo, in vitro en bloc les enregistrements de nerf et in vitro couper les enregistrements qui contiennent le générateur de rythme de respiration. Réductionniste in vitro en bloc et tranche enregistrements constituent une méthode avantageuse à utiliser pour interroger les mécanismes derrière rythmogenèse respiratoire et des circuits neuronaux dans la région du tronc cérébral-moelle épinière, de développer des rongeurs. Le développement du système respiratoire comprend environ 40 types de cellules, caractérisés par le modèle, y compris ceux du centre respiratoire1,2de tir. Le réseau respiratoire central comprend un groupe de neurones rythmiquement actives située dans la medulla ventrolatérale rostrale1,3. Rythmogenèse respiratoire chez les mammifères est généré depuis une autorhythmic interneurone réseau baptisé le preBötzinger complexe (pBC), qui a été localisée expérimentalement par tranche tant en préparations de bloc de mammifères néonatale tronc cérébral-moelle cordons3,4,5,6,7,8. Cette région joue un rôle semblable au nœud sino-auriculaire (SA) dans le coeur et génère un système de chronométrage inspiratoire à la respiration en voiture. De la pBC, le rythme inspiratoire se fait dans d’autres régions du tronc cérébral (y compris le noyau moteur Hypoglosse) et spinal bassins de moteur (tels que les motoneurones phréniques qui animent le diaphragme)9.
L’activité rythmique peut-être être obtenue à l’aide de préparations de tronc cérébral la moelle épinière en bloc ou tranches de différentes populations de cellules, y compris les radicelles nerveuses de C3-C5, radicelles de nerf XII, noyau moteur hypoglosse (XII MN), les neurones prémoteur hypoglosse (XII pMN), et le pBC3,10,11,12. Bien que ces méthodes de collecte de données ont réussi, à travers une poignée de laboratoires, bon nombre des protocoles ne sont pas présentés d’une manière qui est parfaitement reproductible pour les nouveaux chercheurs entrant dans le champ. Obtention viable et rythmiquement actif en bloc et tranche préparations nécessite une attention aiguë aux détails à travers toutes les étapes de la dissection et la tranche coupe protocole. Précédents protocoles largement décrivent les diverses procédures d’enregistrement et électrophysiologie, mais manque de détail dans la partie la plus critique de l’obtention d’une préparation de tissu viable : effectuez la procédure de dissection et de la tranche du tronc cérébral-moelle épinière.
Efficacement obtention d’une préparation de bloc ou tranche rythmiquement active et viable en enregistrements d’électrophysiologie du tronc cérébral-moelle épinière exige que toutes les étapes correctement, soigneusement et rapidement (en général, l’ensemble de la procédure liée ici peut être effectué en environ 30 min). Des points critiques du protocole électrophysiologie du tronc cérébral-moelle épinière qui n’ont pas été préalablement bien décrites comprennent la dissection des radicelles nerveuses et la procédure de découpage en tranches sur le vibratome. Ce protocole est le premier à stepwise communiquer visuellement la dissection du tronc cérébral-moelle épinière pour les nouveaux chercheurs et experts en la matière. Ce protocole explique aussi bien les techniques chirurgicales, monuments et autres procédures afin d’aider les futurs chercheurs en normalisant les tranches et en bloc les préparations pour contenir les circuits exact désiré dans chaque expérience. Les procédures présentées ici peuvent être utilisés chez les chiots nouveau-nés rat et souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adapter le protocole présenté ici dans un bloc fr ou tranche workflow est avantageuse pour les laboratoires et études qui tient à utiliser soit en bloc du tronc cérébral-moelle épinière et/ou mince tranche de préparations pour des enregistrements de l’électrophysiologie. La méthode de dissection et tranche présenté, combinée à méthodes précédemment signalées par d’autres17,18,19, permettra la préparation …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.B.P est récipiendaire d’une bourse de recherche de Loma Linda University Summer Undergraduate.
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-1KG | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma Aldrch | S9638-25G | |
| CaCl2•2H2O | Sigma Aldrich | C7902-500G | |
| MgSO4•7H2O | Sigma Aldrich | M7774-500G | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270-1KG | |
| Cold-Light source Halogen lamp 150W | AmScope | H2L50-AY | |
| Dissection Microscope | Leica | M-60 | |
| Vibratome 1000 Plus | Vibratome | W3 69-0353 | |
| Magnetic Base | Kanetic | MB-B-DG6C | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Sword Classic Double Edge Blades | Wilkinson | 97573 | |
| Histoclear | Sigma-Aldrich | H2779 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5/45 Forcep | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handel #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Spring Scissors Straight | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Narrow Pattern Forcep Serrated/straight | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight | Roboz | RS-5650 | |
| Vannas Scissors 3" Curved | Roboz | RS-5621 | |
| Insect pins, 0 | Fine Science Tools/8840604 | 26000-35 | |
| Insect pins, 0, SS | Fine Science Tools | 26001-35 | |
| Insect pins, 00 | Fine Science Tools | 26000-30 | |
| Insect pins, 00, SS | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Insect pins, 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Insect pins, 000, SS | Fine Science Tools | 26001-25 | |
| Minutien pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Minutien pins, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Minutien pins, 0.2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Fisher Tissue prep Parafin | fisher | T56-5 | |
| Graphite | fisher | G67-500 | |
| Delrin Plastic | Grainger | 3HMT2 | |
| 18 Gauge Hypodermic Needle | BD | 305195 |
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