ウイルス感染とキイロショウジョウバエのホスト ウイルスの相互作用の解析
Summary
このプロトコルでは、キイロショウジョウバエナノ注入法と基本的なテクニックを使用して、ウイルスとの相互作用を分析する生体内でウイルス感染を確立する方法について説明します。
Abstract
ウイルスの拡散は、流行病の主要な原因です。したがって、ウイルスとホスト間の相互作用を理解することは非常に重要なウイルス感染症の治療と予防の知識を拡張します。ミバエ ショウジョウバエ メランogasterが画面の抗ウイルスの要因と強力な遺伝学的ツールと非常に節約された生得の免疫のためのウイルス-宿主の相互作用を調査する最も効率的かつ生産的なモデル生物の一つであることが証明されてシグナル伝達経路。ここで説明する手順は、ウイルス感染を確立し、成虫の全身性抗ウイルス反応を引き起こすナノ射出方法を示します。この方法でウイルス注入量の正確なコントロールにより、実験再現性の高い。本研究では説明されているプロトコルには、ハエとウイルス、注入方法、生存率分析、ウイルス負荷測定、抗ウイルス経路評価の準備が含まれます。ハエの背景によってウイルス感染の影響効果はここで言及されました。この感染方法は行い易い定量的再現;それは、画面のウイルスとの相互作用におけるホスト/増殖因子、免疫シグナル伝達とウイルス感染への応答の他の生物学的経路間のクロストークを解剖に適用できます。
Introduction
特に、チクングニア ウイルス1などのアルボ ウイルスによるウイルス感染を新興デング熱ウイルス、黄熱ウイルス2とジカウイルス3がパンデミックを引き起こすことによって国民の健康に大きな脅威をされています。4します。 したがって、流行の制御と人間のウイルス性疾患の治療のためにますます重要なっているウイルスとの相互作用の理解を深める。この目標のためウイルス感染のメカニズムを調査するより適切かつ効率的なモデルを確立されなければなりません。
ショウジョウバエ、キイロショウジョウバエ (キイロショウジョウバエ)、ウイルス-宿主相互作用5,6を調査するための強力なシステムを提供し、人間のウイルス性疾患7を勉強する最も効率的なモデルの一つであると証明しました。,8,9します。 シグナル伝達経路と比類のない遺伝的ツールを作る非常に節約された抗ウイルス剤ハエ人間抗ウイルス研究にとって重要な意味を持つ重要な結果を生成する素晴らしいモデル。さらに、ハエ簡単で安価な実験室で維持するために、感染時に新規調節因子6,10ウイルスのホストの大規模スクリーニングに最適。
4 つの非常に節約された抗ウイルス経路 (e.g、RNA 干渉 (RNAi) 経路11、JAK-STAT 経路12、NF-κ b の経路、オートファジー経路13) 最近ではショウジョウバエの十分に研究。年6。RNAi の経路は、ウイルス感染症6,14のほとんどの種類を抑制することができます広範な抗ウイルス機構です。ダイサー 2 (Dcr-2)やアルゴノート 2 (AGO2)のような遺伝子の突然変異によって、この経路の障害は、大量のウイルス力価およびホスト死亡15,16,17につながります。JAK-STAT 経路はDicistroviridae家族と昆虫、例えばフラビ家族からウイルスによって感染の制御に関与している、ハエ16および西ナイル ウイルス (WNV) におけるショウジョウバエ C ウイルス (DCV)。蚊18,19のデング熱ウイルス。ショウジョウバエの通行料 (人間の NF-κ B の経路に相同性) と免疫不全 (IMD) 経路 (人間 NF-κ B と TNF 経路に類似) はウイルスの侵略20,21,を守るために関与して22. オートファジーはショウジョウバエ23,24のよく特徴付けられるウイルス感染の制御に関わる別の節約されたメカニズム。したがって、これらの経路と解離性クロストークこれら抗ウイルス シグナル伝達とその他の新規調節因子の同定ショウジョウバエの代謝、老化、神経反応などの生物学的経路が簡単に設定することができますシステム。
ショウジョウバエで最もよく確立されたウイルス感染モデルは RNA ウイルス、無脊椎動物の虹色ウイルス 6I による感染によって引き起こされるが (4-6) カリテア ウイルス飛んで25、DNA ウイルスの研究の可能性を示していると 26。さらに、ウイルスは、ショウジョウバエの遺伝学9インフルエンザ ウイルスなどの感染を許可するように変更もできます。これはショウジョウバエスクリーニング プラットフォームのアプリケーションを大きく拡げた。この手順では、DCV の使用例としてショウジョウバエのウイルス感染システムを開発するのに方法を説明します。DCV は約 9300 のヌクレオチドの肯定的な感覚単一鎖の RNA ウイルス 9 タンパク質27をエンコーディングします。キイロショウジョウバエ自然な病原体として DCV ホスト ウイルスの相互作用と共進化28における生理・行動・基礎免疫応答をホストに適切なウイルスとしてと見なされます。さらに、野生型のハエで感染の急速な死亡率は、DCV 耐性や影響を受けやすい遺伝子のスクリーニングに有用なホスト29です。
しかし、ショウジョウバエのウイルス感染症を勉強して懸念のいくつかの側面もあります。たとえば、共生細菌ボルバキアはショウジョウバエと蚊の30,31,32の RNA ウイルス増殖の広いスペクトルを抑制する能力を持っています。最近の証拠は、どのボルバキアブロック シンドビス ウイルス (SINV)、アップレギュレーションを介しての感染メチルトランスフェラーゼ ホスト33Mt2 式の可能なメカニズムを示しています。また、昆虫の遺伝的背景もウイルス感染のために重要です。たとえば、 pastrel (pst)、遺伝子の天然ポリモーフィズム決まりますショウジョウバエ34,35、DCV 感染に対する感受性間Ubc E2HとCG8492の軌跡コオロギ麻痺ウイルス (CrPV) とそれぞれ36群れ家ウイルス) 感染に関与しています。
ショウジョウバエのセル行37,38, 口腔のホスト細胞成分の高スループット画面など研究目的に応じて、ハエでのウイルス-宿主相互作用を確立する特定の方法を選択する必要があります。腸に特有な抗ウイルス応答22,39,40, 全身の免疫を刺激するために上皮性の障壁を渡すことによって41,42やナノ注射をチクチク針を勉強する感染症応答。正確に実験的再現性の高い44保証制御抗ウイルス反応と生理学的病変43を誘発するウイルスの線量がナノ注射によって制御できます。この研究では、ショウジョウバエ, ハエの背景効果の重要性を強調におけるウイルス-宿主間相互作用を研究するナノ注入法について述べる。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事で詳細な手順で紹介アダルトキイロショウジョウバエでウイルス感染システムを確立する方法ナノ注射を使用します。プロトコルには、適切なフライラインとウイルスの株式市場、感染手法、感染の指標の評価と抗ウイルス応答の測定の準備が含まれます。DCV ウイルス性病原体の例として使用されますが、ウイルスの種類の数十はショウジョウバエ システムの研究のため正?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IPS で全体のパン研究室に感謝したいと思います。CAS。コメントの博士ハンセン朱 (IPS、パリ) 博士ジェシカ ・ バルガス (IPS、パリ) と博士 Gonalo コルドバ スティーガー (スプリンガー自然) 実験支援博士ランコウ王 (IPS, CA) をありがちましょう。この作品は、中国科学アカデミーの戦略的な重点研究課題からを結んだ (XDA13010500) と同 H.T (XDB29030300)、結んだ (31870887 と 31570897) と同し J.Y (31670909) 中国の国家自然科学基金助成金によって支えられました。結んだと同 CA 青年革新推進協議会 (2012083) のフェローであります。
Materials
| 0.22um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Brand | 352070 | |
| 1.5 ml RNase free Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm cell culture dish | Sigma | CLS430167 | Cell culture |
| 100 Replacement tubes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| 15 ml tube | Corning | 352096 | |
| ABI 7500 qPCR system | ABI | 7500 | qPCR |
| Cell Incubator | Sanyo | MIR-553 | |
| Centriguge | Eppendof | 5810R | |
| Centriguge | Eppendof | 5424R | |
| Chloroform | Sigma | 151858 | RNA extraction |
| DEPC water | Sigma | 95284-100ML | RNA extraction |
| Drosophila Incubator | Percival | I-41NL | Rearing Drosophila |
| FBS | Invitrogen | 12657-029 | Cell culture |
| flat bottom 96-well-plate | Sigma | CLS3922 | Cell culture |
| Fluorescence microscope | Olympus | DP73 | |
| Isopropyl alcohol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Lysis buffer (RNA extraction) | Thermo Fisher | 15596026 | TRIzol Reagent |
| Lysis buffer (liquid sample RNA extraction) | Thermo Fisher | 10296028 | TRIzol LS Reagent |
| Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Nanoject II Variable Volume (2.3 to 69 nL) Automatic Injector with Glass Capillaries (110V) |
| Optical Adhesive Film | ABI | 4360954 | qPCR |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
| qPCR plate | ABI | A32811 | qPCR |
| Schneider’s Insect Medium | Sigma | S9895 | Cell culture |
| statistical software | GraphPad Prism 7 | ||
| TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix | TransScript | AT301 | RNA extraction |
| Vortex | IKA | VORTEX 3 | RNA extraction |
References
- Rahim, M. A., Uddin, K. N. Chikungunya: an emerging viral infection with varied clinical presentations in Bangladesh: Reports of seven cases. BMC Research Notes. 10, 410 (2017).
- Douam, F., Ploss, A. Yellow Fever Virus: Knowledge Gaps Impeding the Fight Against an Old Foe. Trends in Microbiology. , (2018).
- Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9. 9, 1391 (2018).
- Gould, E., Pettersson, J., Higgs, S., Charrel, R., de Lamballerie, X. Emerging arboviruses: Why today?. One Health. 4, 1-13 (2017).
- Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
- Xu, J., Cherry, S. Viruses and antiviral immunity in Drosophila. Developmental & Comparative Immunology. 42, 67-84 (2014).
- Shirinian, M., et al. A Transgenic Drosophila melanogaster Model To Study Human T-Lymphotropic Virus Oncoprotein Tax-1-Driven Transformation In Vivo. Journal of Virology. 89, 8092-8095 (2015).
- Adamson, A. L., Chohan, K., Swenson, J., LaJeunesse, D. A Drosophila model for genetic analysis of influenza viral/host interactions. Genetics. 189, 495-506 (2011).
- Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454, 890-893 (2008).
- Webster, C. L., et al. The Discovery, Distribution, and Evolution of Viruses Associated with Drosophila melanogaster. Plos Biology. 13, e1002210 (2015).
- Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila. Genetics. 208, 853-874 (2018).
- West, C., Silverman, N. p38b and JAK-STAT signaling protect against Invertebrate iridescent virus 6 infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 14, e1007020 (2018).
- Liu, Y., et al. STING-Dependent Autophagy Restricts Zika Virus Infection in the Drosophila Brain. Cell Host & Microbe. 24, 57-68 (2018).
- Wang, X. H., et al. RNA interference directs innate immunity against viruses in adult Drosophila. Science. 312, 452-454 (2006).
- van Rij, R. P., et al. The RNA silencing endonuclease Argonaute 2 mediates specific antiviral immunity in Drosophila melanogaster. Genes & Development. 20, 2985-2995 (2006).
- Deddouche, S., et al. The DExD/H-box helicase Dicer-2 mediates the induction of antiviral activity in drosophila. Nature Immunology. 9, 1425-1432 (2008).
- Chotkowski, H. L., et al. West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response. Virology. 377, 197-206 (2008).
- Paradkar, P. N., Trinidad, L., Voysey, R., Duchemin, J. B., Walker, P. J. Secreted Vago restricts West Nile virus infection in Culex mosquito cells by activating the Jak-STAT pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 18915-18920 (2012).
- Souza-Neto, J. A., Sim, S., Dimopoulos, G. An evolutionary conserved function of the JAK-STAT pathway in anti-dengue defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17841-17846 (2009).
- Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 7257-7262 (2005).
- Costa, A., Jan, E., Sarnow, P., Schneider, D. The Imd pathway is involved in antiviral immune responses in Drosophila. PLoS One. 4, e7436 (2009).
- Ferreira, A. G., et al. The Toll-dorsal pathway is required for resistance to viral oral infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 10, e1004507 (2014).
- Moy, R. H., et al. Antiviral autophagy restrictsRift Valley fever virus infection and is conserved from flies to mammals. Immunity. 40, 51-65 (2014).
- Shelly, S., Lukinova, N., Bambina, S., Berman, A., Cherry, S. Autophagy is an essential component of Drosophila immunity against vesicular stomatitis virus. Immunity. 30, 588-598 (2009).
- Bronkhorst, A. W., et al. The DNA virus Invertebrate iridescent virus 6 is a target of the Drosophila RNAi machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E3604-E3613 (2012).
- Palmer, W. H., Medd, N. C., Beard, P. M., Obbard, D. J. Isolation of a natural DNA virus of Drosophila melanogaster, and characterisation of host resistance and immune responses. PLOS Pathogens. 14, e1007050 (2018).
- Jousset, F. X., Bergoin, M., Revet, B. Characterization of the Drosophila C virus. Journal of General Virology. 34, 269-283 (1977).
- Gupta, V., Stewart, C. O., Rund, S. S. C., Monteith, K., Vale, P. F. Costs and benefits of sublethal Drosophila C virus infection. J Evol Biol. 30, 1325-1335 (2017).
- Yang, S., et al. Bub1 Facilitates Virus Entry through Endocytosis in a Model of Drosophila Pathogenesis. Journal of Virology. , (2018).
- Teixeira, L., Ferreira, A., Ashburner, M. The bacterial symbiont Wolbachia induces resistance to RNA viral infections in Drosophila melanogaster. Plos Biology. 6, e2 (2008).
- Ferguson, N. M., et al. Modeling the impact on virus transmission of Wolbachia-mediated blocking of dengue virus infection of Aedes aegypti. Science Translational Medicine. 7, 279ra237 (2015).
- Hedges, L. M., Brownlie, J. C., O’Neill, S. L., Johnson, K. N. Wolbachia and virus protection in insects. Science. 322, 702 (2008).
- Bhattacharya, T., Newton, I. L. G., Hardy, R. W. Wolbachia elevates host methyltransferase expression to block an RNA virus early during infection. PLOS Pathogens. 13, e1006427 (2017).
- Magwire, M. M., et al. Genome-wide association studies reveal a simple genetic basis of resistance to naturally coevolving viruses in Drosophila melanogaster. PLOS Genetics. 8, e1003057 (2012).
- Cao, C., Cogni, R., Barbier, V., Jiggins, F. M. Complex Coding and Regulatory Polymorphisms in a Restriction Factor Determine the Susceptibility of Drosophila to Viral Infection. Genetics. , 2159-2173 (2017).
- Martins, N. E., et al. Host adaptation to viruses relies on few genes with different cross-resistance properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5938-5943 (2014).
- Moser, T. S., Sabin, L. R., Cherry, S. RNAi screening for host factors involved in Vaccinia virus infection using Drosophila cells. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Zhu, F., Ding, H., Zhu, B. Transcriptional profiling of Drosophila S2 cells in early response to Drosophila C virus. Journal of Virology. 10, 210 (2013).
- Ekstrom, J. O., Hultmark, D. A Novel Strategy for Live Detection of Viral Infection in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 6, 26250 (2016).
- Durdevic, Z., et al. Efficient RNA virus control in Drosophila requires the RNA methyltransferase Dnmt2. EMBO Reports. 14, 269-275 (2013).
- Chrostek, E., et al. Wolbachia variants induce differential protection to viruses in Drosophila melanogaster: a phenotypic and phylogenomic analysis. PLOS Genetics. 9, e1003896 (2013).
- Gupta, V., Vale, P. F. Nonlinear disease tolerance curves reveal distinct components of host responses to viral infection. Royal Society Open Science. 4, 170342 (2017).
- Chtarbanova, S., et al. Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction. Journal of Virology. 88, 14057-14069 (2014).
- Merkling, S. H., van Rij, R. P. Analysis of resistance and tolerance to virus infection in Drosophila. Nature Protocols. 10, 1084-1097 (2015).
- Goic, B., et al. RNA-mediated interference and reverse transcription control the persistence of RNA viruses in the insect model Drosophila. Nature Immunology. 14, 396-403 (2013).
- Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2011).
- . Biochemical and Biophysical Research Communications: 1991 index issue. Cumulative indexes for volumes 174-181. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 1-179 (1991).
- Cotarelo, M., et al. Cytopathic effect inhibition assay for determining the in-vitro susceptibility of herpes simplex virus to antiviral agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 44, 705-708 (1999).
- Reed, L. J. M., H, A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
- Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic bacterial infection and immune defense phenotypes in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. , e52613 (2015).
- Schwenke, R. A., Lazzaro, B. P. Juvenile Hormone Suppresses Resistance to Infection in Mated Female Drosophila melanogaster. Current Biology. 27, 596-601 (2017).
- Sabin, L. R., Hanna, S. L., Cherry, S. Innate antiviral immunity in Drosophila. Current opinion in immunology. 22, 4-9 (2010).
- Yin, J., Zhang, X. X., Wu, B., Xian, Q. Metagenomic insights into tetracycline effects on microbial community and antibiotic resistance of mouse gut. Ecotoxicology. 24, 2125-2132 (2015).
