Uso de proteínas de fusión recombinantes en una plataforma de ensayo fluorescente proteasa y su renaturalización en gel

1. generación de la plásmidos de expresión codificación de sustrato Alinear el plásmido de expresión pDest su6- MBP-FP por PacI y NheI endonucleases de la restricción. Para la generación de su pDest6- MBP-FP, ver Bozóki et al.14. Añadir 1.500-2.000 μg de plásmido de expresión pDest su6- MBP-FP, 2 μl de PacI y NheI endonucleases de la restricción, 10 μl de tampón de x 10 (véase Tabla de materiales) y agua libre de nucleasas (NFW) a 100 μL en un tubo de microcentrífuga. Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante 1 hora. Añadir 20 μl de 6 x púrpura de ADN carga colorante a la mezcla de reacción y separar los productos de la hendidura por electroforesis, utilizando gel de agarosa al 1%. Aplicar una escalera de DNA de 1 kB como estándar. Enjuagar el gel durante 15 min en 20 mL de TAE buffer (40 mM Tris, ácido acético de 20 mM, 1 mM EDTA, pH 8,5) que contiene 20 μl de solución de verde de SYBR y suprimir la banda del plásmido linearizado del gel de agarosa, con una herramienta afilada.Nota: Al iluminar el gel por un transiluminador azul oscuro-lectura (DRBT), plásmido linearizado pDest su6- MBP-FP aparece como una banda discreta y brillante en alrededor de 7-8 kB. Purificar el plásmido de expresión linealizada de la rebanada de gel utilizando un kit de extracción de gel según las instrucciones del fabricante. Introduzca la secuencia de sustrato en el plásmido de expresión linealizada pDest su6- MBP-FP. Recuece el forward (FWD) y las inversas cartillas de oligonucleótidos codón-optimizado (REV) e. coli que codifica para la secuencia de sustrato de interés.Nota: Los iniciadores recocidos se va flanqueados por los extremos cohesivos correspondiente a PacI y NheI sitios escote del endonuclease de la restricción (figura 2). Mezcla 150 ng de plásmido de expresión linealizada con 200 ng de FWD y 200 ng de REV oligonucleótidos cebadores en una reacción en cadena de polimerasa (PCR) 0,2 mL del tubo y ajustan el volumen a 17 μl añadiendo NFW. Incubar la mezcla a 65 ° C por 2 min y, después, a 4 ° C durante al menos 2 minutos. Realizar la inserción de los cebadores recocidos en el plásmido linearizado por la ligadura. Añadir 2 μl de tampón de la ligasa de T4 (10 x) y 1 μl de T4 ligasa a la mezcla que contiene el plásmido lineal y los cebadores recocidos. Incubar la mezcla de la ligadura a 16 ° C por 16 h. Figura 2 : Cartillas del oligonucleótido de codificación para un clivaje proteolítico del sitio secuencia. Cartillas de avance y retroceso codifican el VSQNY * secuencia de sitio de escote PIVQ de VIH-1 PR. Después de recocer los cebadores oligonucleótidos complementarios, el ADN de doble hebra corta contiene extremos pegajosos, correspondiente a la de PacI y NheI endonucleases de la restricción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Transformar 100 μl de células competentes BL21(DE3) por 5 μl de mezcla de ligadura y propagación de las células en placas de agar caldo (LB) Lisogenia que contiene ampicilina.Nota: Las proteínas fluorescentes será en el mismo marco de lectura abierto con los tags de fusión N-terminal solamente después de una ligadura acertada. Unos días después de la transformación, las colonias (que contiene el plásmido de expresión para el sitio de la hendidura insertado de interés) muestran fluorescencia visible con o incluso sin utilizar un DRBT. Preparar el caldo glicerol de las colonias representadas. Lave una colonia discreta en un tubo de centrífuga de 50 mL que contiene 5 μl de medio LB con ampicilina (a una concentración final de 100 μg/mL). Incubar a 37 ° C durante 8 h agitando continuamente a 220 rpm; Luego, cosechar las células por centrifugación a 1.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Suspender las células en 1 mL de solución de glicerol 80% (diluida con agua destilada) y agregar 500 μl de 10 mM MgCl2 solución a la suspensión. Transfiera la suspensión a un tubo de congelación y almacén las existencias a-70 ° C. Verificar la secuencia del plásmido generado por la secuencia de la DNA. Añadir 10 μl del stock de glicerol (preparado en el paso 1.7) a 5 mL de medio LB con ampicilina 100 de μg/mL en un tubo de centrífuga de 50 mL. Incubar la suspensión a 37 ° C por 16 h agitando continuamente a 220 rpm; Luego, cosechar las células por centrifugación a 2.000 x g por 10 min a 4 ° C. Aislamiento del plásmido de expresión pellets celulares por una miniprep de plásmido kit (véase Tabla de materiales) de acuerdo a las instrucciones del fabricante y use el plásmido purificado para secuenciación de ADN.Nota: para la secuencia, 5′-GATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAG-3′ (adelante) y 5′-GCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGC-3′ pueden utilizarse las cartillas del oligonucleótido (inversa). 2. expresión de los sustratos fluorescentes Preparar la cultura de arrancador. Añadir 10 μl del stock de glicerol (preparado en el paso 1.7) a 5 mL de medio LB con ampicilina 100 de μg/mL en un tubo de centrífuga de 50 mL. Incubar la suspensión a 37 ° C durante 15 h agitando continuamente a 220 rpm. Transferir el cultivo bacteriano (5 mL) en 50 mL de medio fresco de LB con ampicilina 100 de μg/mL en un matraz de Erlenmeyer estériles de 500 mL. Crecen las células a 37 ° C a una absorbancia de 0.6-0.8 en 600 nm longitud de onda, agitando continuamente a 220 rpm.Nota: Si un tratamiento de tetraciclina debe ser aplicada en el paso 2.5, se recomienda no cultivar las células a una absorbancia de 0.6 más de a 600 nm. Añadir isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a la concentración final de 1 mM para inducir la expresión de la proteína. Si no se aplica un tratamiento de tetraciclina, incubar la cultura por 3 h a 37 º C agitando continuamente a 220 rpm y continuar el protocolo con paso 2.6. Si se aplica un tratamiento de tetraciclina, seguir el protocolo con medidas 2.5.1-2.5.3.Nota: Algunos FPs producida por las células de e. coli pueden tener un tiempo de maduración (ver anterior)16,17; en estos casos, la traducción de la proteína puede ser opcionalmente arrestada por el tratamiento de tetraciclina, para aumentar la producción fluorescente de la solución sustrato. Incubar la suspensión celular por 2 h a 37 º C agitando continuamente a 220 rpm; a continuación, agregar una solución de tetraciclina (a una concentración final de 200 μg/mL). Incubar el cultivo celular según el tiempo de maduración de la proteína fluorescente de elección a 37 ° C, agitando continuamente a 220 rpm. 2 x 25 ml de la cultura para limpiar tubos de centrífuga de 50 mL y cosechar las células por centrifugación a 4.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante y almacenar los pellets de células bacterianas a-70 ° C durante al menos 1 h.Nota: Las células que contienen los substratos fluorescentes expresados muestran fluorescencia visible con o incluso sin utilizar un DRBT. 3. interrupción de la célula Coloque el precipitado de células congeladas en hielo y se deja descongelar durante 15 minutos. Añadir 2 mL de tampón de lisis (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, 0,05% Tween 20, pH 8) para el sedimento y suspender las células. Añadir 10 μl de solución de inhibidor de proteasa recién preparada phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF) (8,7 mg/mL, disuelto en etanol) a la suspensión. Añadir 2 mg de lisozima y 20 unidades de la ADNsa a la suspensión y suspenderlo. Incubar la suspensión en hielo por 15 min y de vórtice que de vez en cuando. Transferencia de 2 x 1 mL de la suspensión a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y someter a ultrasonidos las suspensiones por 3 min, en rondas de 10 s de sonicación y 5 s de descanso. Centrifugar los tubos a 10.000 x g por 20 min a temperatura ambiente; a continuación, retire con cuidado el sobrenadante fluorescente (lisado despejado célula bacteriana) de cada tubo y transferencia a nuevos tubos de microcentrífuga.Nota: Despejados lisados que contiene el sustrato fluorescente presentan fluorescencia visible con o incluso sin utilizar un DRBT y pueden almacenarse a 4 ° C hasta por 2 semanas. NO lo congele. Lisados despejado pueden ser utilizado directamente para preparación de muestras en el análisis de la proteasa (ver sección 4.1) o también puede ser utilizado para la purificación del substrato (ver paso 4.5.1). 4. ensayo de proteasa basado en grano magnético Ni-NTA Nota: Debido a la flexibilidad de la plataforma de análisis, se puede ser optimizado para diferentes tipos de estudios. Por esta razón y debido a la diferencia en la tasa de actividad de las enzimas de la elección, algunos de los parámetros de ensayo (que se denota) no se puede describir explícitamente pero necesitan ser optimizados para los objetivos individuales y diseño experimental. Como una dirección, se indican los parámetros de algunos tipos de estudios en lo particular. Preparación de la muestra Generación de bolas magnéticas adheridas a sustrato Coloque un cerrado 2 mL baja proteínas de unión (véase Tabla de materiales) tubo de microcentrífuga con nuevo o reciclado (ver sección 4.7) perlas de agarosa magnético de Ni-NTA en un concentrador de partículas magnéticas (MPC).Nota: La cantidad de la suspensión aplicada grano debe ajustarse basándose en el diseño experimental. Se utilizó 1 mL de solución de grano magnético (5%, v/v) en cada experimento. Granos pueden pegarse a la pared o en la tapa del tubo de microcentrífuga. por lo tanto, invierta el MPC en todas direcciones para asegurarse de que todos los granos son recogidos. Quite el sobrenadante y deséchelo. Lavar los granos de tampón de lisis. Añadir 1.8 mL de tampón de lisis a los granos y quitar el tubo cerrado del MPC. Suspender los granos en el tubo por sacudir o girar los tubos boca abajo hasta que la muestra esté completamente homogénea. Coloque el tubo en el MPC y gírelo boca abajo para recoger los granos. Abra el tubo y descarte el sobrenadante. Añada 1.0-1.8 mL del despejado lisado (preparado en el paso 3.7) a los granos y quitar el tubo del MPC. Invierta el tubo cerrado hasta que los granos son completamente homogéneos y giren lentamente el tubo por un agitador a temperatura ambiente durante 30 minutos. Coloque en el MPC y retire la célula despejada lisada de los granos y de la tapa.Nota: La célula despejada lisada puede ser descartada o guarda para su uso posterior (véase la nota después del paso 3.7). Agregar 1% Tween 20 (pH 7) para las bolas magnéticas sustrato Unido (SAMBs).Nota: SAMBs muestran fluorescencia visible con o incluso sin utilizar un DRBT. Lavado de las SAMBs Coloque el tubo con la suspensión SAMB en el MPC y descarte el sobrenadante. Lavar el SAMBs 3 x con cada tampón: i) 1.8 mL de 1% Tween 20 (pH 7); II) 1.8 mL de tampón de lavado (50 mM NaH2PO4, 300 mM de NaCl, 5 mM imidazol, 0,05% Tween 20, pH 7); III) 1.8 mL de tampón de escote (50 mM NaH2PO4, 300 mM de NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7).Nota: Para el procedimiento de lavado, consulte el paso 4.1.1.4. El búfer de hendidura puede cambiarse según las necesidades experimentales, pero se recomienda verificar el manual de las bolas magnéticas de Ni-NTA para determinar la compatibilidad. Preparación de la solución stock de SAMB Añadir un buffer de escote a las SAMBs lavados para crear una solución stock de SAMB.Nota: Después de la adición del buffer, no sacuda o gire el tubo boca abajo. El volumen del buffer de escote depende del diseño experimental individual y debe ser calculado basado en el número de bolas magnéticas (ver paso 4.1.1.1) y en los volúmenes que se utilizará en el paso 4.1.4.2. Para tubos de 2 mL, el volumen aplicado es hasta 1.900 μl (ver tabla 1). La densidad de grano magnético recomendado de la solución madre de SAMB es 2-10% (v/v). Tipo de estudio Volumen de tampón de escote (μL) Medidas S-dependientes (Fig 4) 1600 Curso del tiempo las mediciones (Fig. 5A) 1600 Estudio de inhibición (Fig. 5B) 1900 estudio de dependencia de pH (Fig. 6) 1400 Tabla 1: Volumen del buffer de escote para preparar la solución madre de SAMB en los diferentes tipos de mediciones. Retire el tubo cerrado del MPC. Utilice la solución SAMB inmediatamente o guardar a 4 ° C por 24 h. Generación de las muestras de ensayo con la solución stock de SAMBNota: Los detalles de esta parte del ensayo están fuertemente dependientes en el diseño experimental (muestra tipos se muestran en la tabla 2). Tipo de muestra Notas Muestra de reacción (R) -utilizado para la evaluación de propiedades de escote-contiene la enzima y el substrato en solución tampón de escote Muestra en blanco del substrato (B) -utilizado para evaluar la disociación espontánea del sustrato (ver paso 4.6.2)-contiene sólo el substrato en solución tampón de escote Ejemplo de control de sustrato (C) -para detemining la concentración de substrato (ver paso 4.6.3)-contiene solamente el substrato en solución tampón de elución Tabla 2: Tipos de muestras de la prueba de la proteasa basado en grano magnético de Ni-NTA. Preparar 2 mL de los tubos de microcentrífuga de baja proteína de Unión para las muestras de ensayo.Nota: Otra baja proteína vinculante mercancías plásticas puede también utilizarse. Utilice tubos de fondo redondo o plano para garantizar la libre circulación de SAMBs. Ver la cantidad recomendada de tubos en la tabla 3. Tipo de estudio R B C Medidas S-dependientes (Fig 4) 5 5 2 Curso del tiempo las mediciones (Fig. 5A) 6 6 2 Estudio de inhibición (Fig. 5B) 7 7 1 estudio de dependencia de pH (Fig. 6) 5 5 1 Tabla 3: Número de tubos de microcentrífuga requiere 2 mL para cada tipo de muestra en los estudios demostrados. Suspender la solución SAMB hasta homogeneidad y transferir la cantidad de sustrato a analizar en las reacciones inmediatamente en los frascos de muestra. El volumen recomendado es de 25-300 μL, pero debe ser fijado según el diseño experimental individual (tabla 4).Nota: Verifique si todos SAMBs han sido medidos en la parte inferior de los tubos. SAMBs puede pegarse a la pared del tubo, que puede distorsionar los resultados del ensayo. Si diferentes volúmenes van a ser medidos secuencialmente, empezar a tomar con el volumen más alto y tratar de minimizar el cambio de las pipetas o pipetas. Tipo de estudio R B C Medidas S-dependientes (Fig 4) 25 – 50 – 100 – 150 – 250 25 – 50 – 100 – 150 – 250 25 Curso del tiempo las mediciones (Fig. 5A) 25 25 25 Estudio de inhibición (Fig. 5B) 120 120 120 estudio de dependencia de pH (Fig. 6) 100 100 100 Tabla 4: Volumen de la solución SAMB medido en los frascos de muestra de cada tipo de muestra en los estudios demostrados. Colocar los tubos de muestra que contiene la suspensión alícuotas de SAMB en el MPC y el MPC se desplazará ligeramente hacia adelante y hacia atrás. Con cuidado retire el sobrenadante de las SAMBs y deséchela. Retirar los tubos del MPC y agregar el volumen calculado de buffer de reacción (buffer [100 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 7] del escote o elución) cuidadosamente a las SAMBs.Nota: Calcular el volumen de tampón según el diseño experimental (tabla 5). Para tubos de 2 mL, el volumen final recomendado de la mezcla de reacción (el volumen del buffer de reacción para ser añadido en este paso + el volumen de la solución que se agregará en el paso 4.2.3) es 50-150 μL. Asegúrese de que todos los SAMBs se lavan en el búfer adicional. Tampón de elución se usa en lugar del búfer del escote en el caso de muestras de control (C) sustrato. Para un estudio de inhibición, el inhibidor de elección se recomienda añadir en este paso. Tipo de estudio Volumen del buffer de reacción (μL) Medidas S-dependientes (Fig 4) 68 μl de tampón de escote Curso del tiempo las mediciones (Fig. 5A) 68 μl de tampón de escote Estudio de inhibición (Fig. 5B) Banco de 67,3 μl de tampón de escote + inhibidor de 0,7 μl solución * estudio de dependencia de pH (Fig. 6) Escote de 69,5 μl tampón ** Tabla 5: volumen de tampón de reacción en los estudios demostrados. * Amprenavir fue solucionado en dimetilsulfóxido; soluciones stock de amprenavir (desde 1 nM a concentraciones de 1 μm) se aplicaron para estudio inhibitorio (ver figura 5B). ** El pH del buffer escote aplicada osciló entre pH 6.0-8.5. Cerrar las tapas de los tubos. Ahora están listas para el análisis de las muestras.Nota: Las muestras pueden almacenarse a 4 ° C por 24 h, pero el almacenamiento de información sólo es aplicable si la solución SAMB fue utilizada inmediatamente después de la preparación (ver paso 4.1.3.2). Iniciación de las reacciones proteolíticas Preparar la solución de enzima proteolítica según las necesidades experimentales.Nota: Se recomienda utilizar un búfer de escote para disolver o diluir la enzima. Protocolos para tratamiento de VIH-114 y TEV PRs18 han sido publicados con anterioridad. Establecer el termoagitador agitación velocidad (600 rpm) y temperatura de incubación (tabla 6). Tipo de estudio Temperatura de incubación (º C) Medidas S-dependientes (Fig 4) 37 Curso del tiempo las mediciones (Fig. 5A) 37 Estudio de inhibición (Fig. 5B) 37 estudio de dependencia de pH (Fig. 6) 30 Tabla 6: temperaturas de incubación aplicadas en tipos de estudios diferentes. Para VIH-1, 37 ° C se recomienda, aunque 30 ° C se recomienda para TEV PR. Añadir la solución de enzima a las muestras de reacción para inicializar las reacciones proteolíticas.Nota: En el caso de sustrato en blanco (B) y muestras, añadir escote buffer (tampón de enzima) y tampón de elución, respectivamente. El volumen debe calcularse según las necesidades experimentales (Tabla 7). Para tubos de 2 mL, el volumen final recomendado de la mezcla de reacción (el volumen del buffer de reacción, agregado en el paso 4.1.4.5 + el volumen de la solución que se añadan en este paso) es de 50-150 μL. Tipo de estudio Volumen del enzima enzimático solución tampón/elución tampón (μL) Medidas S-dependientes (Fig 4) 2 Curso del tiempo las mediciones (Fig. 5A) 2 Estudio de inhibición (Fig. 5B) 2 estudio de dependencia de pH (Fig. 6) 0.5 Cuadro 7: Volumen del enzima enzimático solución tampón/elución buffer añadido durante la inicialización de las muestras de ensayo en el caso de los estudios demostradas. Remover los granos con cuidado moviendo suavemente los tubos y colocar los tubos inmediatamente en el termoagitador ya temblando.Nota: Terminación Manual de las muestras (ver sección 4.3) lleva más tiempo que la iniciación; por lo tanto, se recomienda un retraso registrado de al menos 2 minutos entre las iniciaciones de las reacciones. Incubar las muestras según el diseño experimental (Tabla 8). Tipo de estudio Tiempos de incubación (min) Medidas S-dependientes (Fig 4A) 7 Medidas S-dependientes (Fig 4B) 120 Curso del tiempo las mediciones (Fig. 5A) 0 – 2.5 – 5 – 10 – 15 – 20 Estudio de inhibición (Fig. 5B) 10 estudio de dependencia de pH (Fig. 6) 60 Tabla 8: Tiempos de incubación aplicados a las muestras de ensayo en las diferentes mediciones. Terminación de las reacciones proteolíticas Sacar la muestra de la coctelera, 30 s antes de final de la incubación y girar rápidamente. Coloque el tubo en el MPC, dejar reposar durante 15 s, y el MPC se desplazará ligeramente hacia adelante y hacia atrás. Abra la tapa y transferir el sobrenadante cuidadosamente a una placa o un tubo nuevo.Nota: No toque los granos concentrados con la punta de la pipeta. El sobrenadante recogido de muestras de C y R con un alto grado de hendidura puede mostrar fluorescencia visible con o sin la utilización de un DRBT. Detección fluorescente Transferencia de 2 x 30 μl de los sobrenadantes de muestras separadas a una microplaca de área mitad negro. Medida de la fluorescencia con los filtros adecuados de excitación y emisión.Nota: Medir la fluorescencia básica de la hendidura tampón y tampón de elución. Necesidad de combinaciones de filtro a elegir basado en la proteína fluorescente medida (Tabla 9). Proteína fluorescente Filtros de excitación (nm) Filtros de emisión (nm) mTurqiouse2 355/40 460/25 mEYFP 544/15 590/10 mApple 544/15 590/10 Tabla 9: Filtros de excitación y emisión para detectar diferentes proteínas fluorescentes. CalibraciónNota: Para generar las curvas de calibración en paso 4.6.1, valores de intensidad de fluorescencia de escote o elución-tampón-resuelto sustratos purificados en diferentes concentraciones que deba medirse. Purificar los sustratos fluorescentes.Nota: Para purificación, SAMBs del sustrato en blanco (B) las muestras después de que se puede recoger el ensayo de proteasa o un nuevo SAMB suspensión puede también ser preparada (ver las secciones 4.1.1 y 4.1.2). Colocar un tubo con SAMBs suspendidas en 1 mL de tampón de escote (2% – 10%; v/v) del MPC y recoger las bolas magnéticas girando el MPC al revés en cada dirección. Abra el tubo y retire el búfer del escote, tanto del tubo y la tapa. Quite el tubo del MPC y añadir 400-600 μl de tampón de elución a las SAMBs. Gire lentamente el tubo cerrado con un agitador a temperatura ambiente durante 5 minutos. Coloque el tubo en el MPC y recoger los granos girando el MPC al revés. Quite el sobrenadante que contiene el sustrato fluorescente intacto purificado (efluente) y transferir a un tubo nuevo de microcentrífuga de baja proteína de Unión.Nota: Efluente muestra fluorescencia visible con o incluso sin utilizar un DRBT. Realizar cambio de buffer paralelo mediante dos dispositivos de ultrafiltración de 10K de 0.5 mL. Mida la mitad de volumen de eluido preparado (200-300 μL) en cada dispositivo de ultrafiltración. Después en cada paso de centrifugación, diluir el efluente concentrado en el primero y el segundo dispositivos de ultrafiltración por tampón de elución y búfer de escote, respectivamente. Después de la recuperación, ajustar las muestras concentradas en los buffers diferentes para el mismo volumen, entre 120-200 μl.Nota: Ahora el contenido de proteína del sustrato tampón resuelto escote es idéntico al sustrato de resuelto de tampón de elución; por lo tanto, no es necesario determinar el contenido de éste en el paso 4.5.3, en proteínas si el método utilizado para medir la concentración de la proteína interfiere con EDTA. Determinar el contenido de proteína de los substratos disuelto en tampón de elución o escote midiendo la absorbancia a 280 nm.Nota: Otros métodos (por ejemplo, Bradford o bicinchoninic ácido (BCA) ensayos) pueden usarse para medir la concentración de la proteína, pero la posible interferencia con EDTA (presente en el tampón de elución) o con la absorbancia del sustrato fluorescente debe ser considerado. El contenido de proteína inicial de la solución del sustrato para ser aplicado en paso 4.5.4 se recomienda entre 0.4-2.0 mg/mL con el fin de generar una calibración de la curva en un rango apropiado. Véase la tabla 10 para los coeficientes de extinción. Sustrato Peso molecular(Da) Coeficiente de extinción(M-1 cm-1, a 280 nm medido en agua) Su6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 72101.7 96845 Su6- MBP-KARVL * AEAM-mTurquoise2 72042.7 95355 Su6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP 72367.1 94325 Su6- MBP-VSQNY * PIVQ-mApple 72145.9 105200 Tabla 10: pesos moleculares y los coeficientes de extinción de los substratos de la proteína de fusión fluorescente recombinante diferente. Preparar una dilución seriada de doble en al menos ocho pasos tanto desde la elución, las soluciones de sustrato escote-tampón-resuelto, con elución o escote búfer para la dilución, respectivamente. Transferencia 30 μl de cada dilución punto a una microplaca de área mitad negro. Medida de la fluorescencia con un Fluorímetro, usando el ajuste aplicado en el paso 4.4.2.Nota: Medir la fluorescencia básica de la división y el tampón de elución. Evaluación del ensayo Trazar las curvas de calibración. Calcular la concentración (en mM) de las soluciones de substrato purificado (utilizado en el paso 4.5.4), basada en el contenido en proteínas determinado en el paso 4.5.3. Corregir los valores de intensidad de fluorescencia relativa (RFU) de los puntos de dilución seriada de los valores básicos de la RFU del tampón de dilución aplicada (el buffer del escote o el tampón de elución). Parcela los valores corregidos de la RFU contra la concentración molar de los substratos purificados resuelto escote o con elución-almacenador intermediario y realizar una regresión lineal (fuerza de la intercepción a cero).Nota: Un valor alto de R2 (˃0.97) indica una buena correlación lineal entre la fluorescencia y la concentración de la proteína fluorescente. En este caso, la pendiente de la recta de regresión puede utilizarse para evaluar la concentración de los componentes del ensayo en la gama examinado en pasos 4.6.2 y 4.6.3. Distribución de punto de datos y errores experimental puede afectar a la fiabilidad de la calibración; por lo tanto, una evaluación gráfica puede realizarse con la ayuda del zoom en gráficos (como se muestra en la figura 3), con el fin de comprobar si los valores de pendiente y R2 son influenciados por los datos. Calcular la cantidad de producto de escote fluorescente C-terminal en las muestras de la reacción. Corregir los valores de la RFU de cada muestra de R con los valores de la RFU de la muestra B correspondiente. Calcular la concentración de producto de escote (en mM) en las muestras de reacción, dividiendo la corregida valores RFU por la pendiente de la calibración de escote-basadas de la curva (ver paso 4.6.1.3). Calcular la concentración de sustrato aplicada en las muestras de la reacción. Corregir los valores de la RFU de la muestra de C con el valor de la RFU del tampón de elución básica. Calcular la concentración del sustrato eluída (en mM) en el sobrenadante de la muestra C dividiendo su corrección valores RFU por la pendiente de la calibración base de tampón de elución de la curva (ver paso 4.6.1.3). Determinar la concentración de sustrato (en mM) de la solución madre de SAMB que se utiliza para crear las muestras de ensayo en paso 4.1.4.2, basado en la siguiente ecuación:Aquí, cSAMB es la concentración molar de la solución madre de SAMB en sección 4.1.3; cC es la concentración molar del sustrato eluída de la muestra de C calculado en el paso 4.6.3.3; Vr es el volumen de la mezcla de reacción por la adición de la buffer de reacción en paso 4.1.4.5 y el buffer de la enzima en el paso 4.2.3.; y VSAMB es el volumen de la solución madre de SAMB en la muestra C (paso 4.1.4.2). Calcular la concentración molar de los sustratos en cada muestra de R basada en la concentración molar de la SAMB solución (en mM) según el volumen (en μL) en cada tubo de muestras de reacción a paso 4.1.4.2. Realizar el procesamiento de datos.Nota: El análisis de datos depende de la finalidad del experimento. El video muestra un ejemplo de procesamiento de datos de un estudio cinético dependiente del sustrato en PR de VIH-1 con su6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 sustrato. Los valores de velocidad inicial se calculan el número de fragmentos de escote C-terminal y se trazan contra la concentración del substrato aplicado. Los parámetros cinéticos se determinan mediante un análisis de regresión no lineal de Michaelis-Menten. Reciclaje de las bolas magnéticasNota: Después de realizar un ensayo, las perlas de agarosa magnético pueden ser recogidas y recicladas. Recoger las bolas magnéticas usadas con el MPC y descarte el sobrenadante. Lavar los granos con 1,8 mL de los siguientes topes, en el orden dado: búfer de regeneración A (0.05% Tween 20, 0.5 M NaOH), búfer de regeneración B (0.05% Tween 20), búfer de regeneración C (0,05% Tween 20, 100 mM EDTA, pH 8), regeneración tampón B, (regeneración) buffer D 0,05% Tween 20, NiSO4de 100 mM, pH 8), regeneración tampón B y el búfer de regeneración E (0,5% de Tween 20, 30% etanol, pH 7).Nota: Para el procedimiento de lavado, consulte el paso 4.1.1.4. Almacenar los granos reciclados en búfer de regeneración E a 4 ° C. 5. Análisis de la página Preparación de la muestraNota: Después de realizar el ensayo basado en grano magnético de Ni-NTA, los sobrenadantes de ensayo pueden ser analizados por la página. En este caso, omita los pasos 5.1.1 y 5.1.2. Sin embargo, también es posible analizar la solución purificada sustratos fluorescentes o sus fragmentos escote después de la solución en la digestión con la proteasa de interés. En este caso, seguir el protocolo con el paso 5.1.1. Preparar la solución de sustrato fluorescente purificado según paso 4.5.1. Llevar a cabo la digestión en solución. Cambio de tampón de elución con tampón de escote en el dispositivo de ultrafiltración de 10K de 0.5 mL y alícuota las muestras a ser digerido en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.Nota: para el análisis de la página, tenemos alícuotas 68 μl de cada sustrato, pero el número de tubos de muestras y el volumen de solución de substrato que alícuotas pueden ser optimizados según el diseño experimental. Añadir la solución de enzima a las muestras.Nota: Para el análisis de la página, se aplicaron 2 μl de VIH-1, preparado según lo descrito por Bozóki et al14, pero el volumen se puede optimizar según el diseño experimental. Se recomienda utilizar tampón escote para disolver o diluir la enzima. Incubar las muestras según el diseño experimental.Nota: Para el análisis de la página, incubó la mezcla de reacción durante 45 min a 37 ° C, pero el tiempo de incubación y temperatura tienen que ajustarse según el diseño experimental. Terminar la reacción realizando paso 5.1.3. Preparar la muestra para la página.Nota: Las muestras que contienen el sustrato fluorescente se pueden preparar para la página por un nondenaturing o un método de desnaturalización. Para el uso de condiciones nondenaturing o desnaturalización, siga el paso 5.1.3.1 o 5.1.3.2, respectivamente. Preparar una muestra de nondenatured: mezclar 30 μl de la muestra con 6 μl de 6 x nondenaturing tampón de muestra de carga (300 mM de Tris, glicerol al 20%, 0.05% azul de bromofenol pH 6.8). Preparar una muestra desnaturalizada: mezclar 30 μl de la muestra con 6 μl de 6 x desnaturalización muestra carga buffer (300 mM Tris, glicerol al 20%, 0.05% bromofenol azul, 12% SDS, 100 mM β-mercaptoetanol, pH 6.8) y calentar las muestras a 95 ° C durante 10 minutos. Análisis de SDS-PAGENota: Opcionalmente, si sólo muestras nondenatured (preparado en paso 5.1.3.1) deben ser analizadas, una página nativa puede realizarse también. En este caso, sáltese la sección 5.3. Preparar un gel de SDS-poliacrilamida (uso 14% separador y 4% gel de apilamiento) y llenar el tanque con el tampón de electroforesis (2,5 mM de Tris, glicina de 19,2 mM, 0.01% SDS). Añadir las muestras (preparadas en el paso 5.1.3.1 o 5.1.3.2) en los pocillos de un gel de poliacrilamida y realizar la electroforesis a 120 V de tensión. Retire el cartucho de gel desde el módulo de ejecución y coloque el gel en un tanque de lavado.Nota: Las muestras Nondenatured ya son visibles en el gel, incluso por el ojo desnudo o con un DRBT. En gel de renaturalización y la detección de proteínas fluorescentesNota: Para detectar las proteínas fluorescentes en muestras desnaturalizadas (preparadas en el paso 5.1.3.2) en el DRBT, SDS debe ser lavado fuera del gel, que parcialmente renature de las proteínas. Añadir ~ 100 mL de agua destilada al gel y enjuague el gel por lo menos durante 30 minutos.Nota: Para mejorar la eliminación de la SDS, reemplace el agua cada 10 minutos y enjuague hasta 60 min. Visualizar las proteínas fluorescentes mediante una DRBT, o proyección de imagen de rayos UV. Tinción de Coomassie convencional del gel Tinción del gel con azul brillante de Coomassie tinte para visualizar proteínas nonfluorescent.