Utilização de proteínas recombinantes de fusão em uma plataforma de ensaio de Protease fluorescente e sua renaturalização em-gel

1. geração de plasmídeo de expressão o substrato-codificação Linearizar o plasmídeo de expressão pDest-His6- MBP-FP pela PacI e NheI endonucleases de restrição. Para a geração de sua pDest6- MBP-FP, ver Bozóki et al.14. Adicione 1.500-2.000 µ g do plasmídeo de expressão pDest-His6- MBP-FP, 2 μL de cada de PacI e NheI endonucleases de restrição, 10 µ l de tampão de x 10 (ver Tabela de materiais) e água livre de nuclease (NFW) de 100 µ l em um tubo de microcentrifugadora. Incube a mistura a 37 ° C por 1h. Adicionar 20 µ l de 6 x roxo de ADN carregando o corante para a mistura de reação e separar os produtos de clivagem por eletroforese, utilizando gel de agarose 1%. Aplica uma escada de DNA kB 1 como padrão. Lave o gel durante 15 min em 20 mL de TAE buffer (40 mM Tris, ácido acético de 20 mM, 1 mM EDTA, pH 8,5) contendo 20 µ l de solução SYBR green e impostos especiais de consumo da banda do plasmídeo linear fora o gel de agarose, usando uma ferramenta afiada.Nota: Enquanto iluminando o gel por um transiluminador azul escuro-leitura (DRBT), o plasmídeo de – MBP-FP pDest-His linear6aparece como uma banda discreta e luminosa em cerca de 7-8 kB. Purifica o plasmídeo de expressão linear da fatia gel usando um kit de extração do gel de acordo com as instruções do fabricante. Inserir a sequência de substrato o plasmídeo de expressão linear, sua pDest6- MBP-FP. Recoze a frente (FWD) e as inversa (REV) Escherichia coli códon otimizado primeiras demão do oligonucleotide codificação para a sequência de substrato de interesse.Nota: Os primers recozidos vão ser ladeados pelas extremidades coesas correspondente a PacI e NheI sítios de clivagem de endonuclease de restrição (Figura 2). Mix 150 ng do plasmídeo de expressão linear com 200 ng de FWD e 200 ng do oligonucleotide REV primers em 0,2 mL uma reação em cadeia do polymerase (PCR) tubo e ajuste o volume para µ l 17 adicionando NFW. Incube a mistura a 65 ° C por 2 min e, em seguida, a 4 ° C, durante pelo menos 2 min. Execute a inserção dos primers recozidos para o plasmídeo linear pela ligadura. Adicione 2 µ l de tampão de T4 ligase (10x) e 1 µ l de T4 ligase à mistura contendo o plasmídeo linear e as primeiras demão recozidas. Incube a mistura de ligadura a 16 ° C, durante 16 h. Figura 2 : Primeiras demão do oligonucleotide que codifica para uma clivagem proteolítica site sequência. Cartilhas para diante e reversos codificam o VSQNY * sequência de sítio de clivagem PIVQ de HIV-1 PR. Após as primeiras demão do oligonucleotide complementares de recozimento, o DNA de cadeia dupla curto contém extremidades pegajosas, correspondente do PacI e NheI endonucleases de restrição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Transformar 100 µ l de células competentes de BL21(DE3) por 5 µ l de mistura de ligadura e espalhar as células em placas de ágar caldo (LB) lisogenia contendo ampicilina.Nota: As proteínas fluorescentes será no mesmo quadro de leitura aberto com as tags de fusão do N-terminal somente após uma bem sucedida da ligadura. Alguns dias depois da transformação, as colônias (contendo o plasmídeo de expressão que codifica para o local de clivagem inserido de interesse) mostrará fluorescência visível com ou mesmo sem usar um DRBT. Prepare o estoque de glicerol das colônias retratadas. Lave uma colônia discreta em um tubo de centrífuga de 50 mL contendo 5 µ l de meio LB com ampicilina (em uma concentração final de 100 µ g/mL). -Incubar a 37 ° C para 8 h agitando continuamente a 220 rpm; em seguida, recolher as células por centrifugação a 1.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Delicadamente, suspender as células em 1 mL de solução de glicerol de 80% (diluída com água destilada) e adicionar 500 µ l de solução de MgCl2 a 10 mm para a suspensão. Transfira a suspensão para um tubo de congelação e armazenar os estoques a-70 ° C. Verifique se a sequência do plasmídeo gerado pelo sequenciamento de DNA. Adicione 10 µ l do estoque de glicerol (preparado na etapa 1.7) para 5 mL de meio LB contendo 100 ampicilina µ g/mL em um tubo de centrífuga de 50 mL. Incube a suspensão a 37 ° C durante 16 h agitando continuamente a 220 rpm; em seguida, recolher as células por centrifugação a 2.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Isolar o plasmídeo de expressão do centrifugado por miniprep um plasmídeo kit (veja a Tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante e use o plasmídeo purificado para o sequenciamento de DNA.Nota: para o sequenciamento, 5′-GATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAG-3′ (em frente) e 5′-GCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGC-3′ primeiras demão do oligonucleotide (reverso) podem ser usadas. 2. a expressão de substratos fluorescentes Prepare a cultura starter. Adicione 10 µ l do estoque de glicerol (preparado na etapa 1.7) para 5 mL de meio LB contendo 100 ampicilina µ g/mL em um tubo de centrífuga de 50 mL. Incube a suspensão a 37 ° C por 15 h agitando continuamente a 220 rpm. Transferi a cultura bacteriana (5 mL) a 50 mL de meio LB fresco contendo 100 ampicilina µ g/mL em um Erlenmeyer de 500 mL estéril. Crescem as células a 37 ° C para uma absorvância de 0.6-0.8 no comprimento de onda de nm 600, agitando continuamente a 220 rpm.Nota: Se um tratamento de tetraciclina é para ser aplicado na etapa 2.5, não se recomenda a crescer as células para uma absorvância de mais de 0,6 a 600 nm. Adicione isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) para a concentração final de 1 mM para induzir a expressão da proteína. Se não é aplicado um tratamento de tetraciclina, incubar a cultura por 3 h a 37 ° C, agitando continuamente a 220 rpm e continuar o protocolo com passo 2.6. Se for aplicado um tratamento de tetraciclina, continue o protocolo com passos 2.5.1-2.5.3.Nota: Alguns FPs produzido pelas células de e. coli pode ter um tempo de maturação (ver trabalhos anteriores)16,,17; nesses casos, a tradução de proteínas pode ser opcionalmente preso pelo tratamento a tetraciclina, a fim de aumentar o rendimento fluorescente da solução de substrato. Incube a suspensão de eritrócitos durante 2 h a 37 ° C, agitando continuamente a 220 rpm; em seguida, adicione uma solução de tetraciclina (em uma concentração final de 200 µ g/mL). Incube a cultura de células de acordo com o tempo de maturação da proteína fluorescente de escolha a 37 ° C, agitando continuamente a 220 rpm. 2 x 25 ml da cultura para limpar tubos de centrífuga de 50 mL e colher as células por centrifugação a 4.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e armazenar as pelotas de célula bacteriana a-70 ° C durante pelo menos 1 h.Nota: As células contendo os substratos fluorescentes expressados apresentam fluorescência visível com ou mesmo sem usar um DRBT. 3. rompimento da pilha Coloque o centrifugado congelado no gelo e deixe descongelar por 15 min. Adicionar 2 mL de tampão de lise (50mm NaH2PO4, 300 mM de NaCl, imidazol 10 mM, 0,05% de Tween 20, pH 8) para a pelota e suspender as células. Adicione 10 µ l de solução de inibidor de protease recentemente preparada phenylmethanesulfonyl-fluoreto (PMSF) (8,7 mg/mL, dissolvido em etanol) à suspensão. Adicionar 2 mg de lisozima e 20 unidades de DNase à suspensão e suspendê-lo. Incube a suspensão no gelo por 15 min e vórtice que ocasionalmente. 2 x 1 mL da suspensão de transferência para tubos de 1,5 mL microcentrifuga e proceda à sonicação as suspensões por 3 min, nas rodadas de 10 s de sonication e 5 s de descansar. Centrifugar os tubos a 10.000 x g por 20 min à temperatura ambiente; em seguida, remover o sobrenadante fluorescente (apurado bacteriano lisado celular) cuidadosamente cada tubo e transferi-lo para novos tubos de microcentrifuga.Nota: Lysates apuradas contendo o substrato fluorescente mostrar fluorescência visível com ou mesmo sem usar um DRBT e podem ser armazenadas a 4 ° C por até 2 semanas. Não congele. Lisados limpos podem ser utilizados diretamente para a preparação de amostra no ensaio de protease (ver seção 4.1) ou também pode ser usado para a purificação de substrato (ver passo 4.5.1). 4. ensaio de Ni-NTA magnética do grânulo-baseado protease Nota: Devido à flexibilidade da plataforma de ensaio, ele pode ser otimizado para muitos tipos diferentes de estudos. Por este motivo e devido à diferença na taxa de atividade das enzimas de escolha, alguns dos parâmetros do ensaio (onde ele é denotado) não podem ser descrito explicitamente, mas precisam ser otimizado para os objectivos individuais e delineamento experimental. Como uma orientação, parâmetros de alguns tipos de estudos são indicados nas etapas a seguir particular. Preparação da amostra Geração de grânulos magnéticos substrato-inscritos Coloca um fechado 2ml baixa proteína-ligação (consulte a Tabela de materiais) microcentrifuga tubo contendo novos ou reciclados (ver secção 4.7) grânulos de agarose magnética Ni-NTA em um concentrador de partículas magnéticas (MPC).Nota: A quantidade de suspensão aplicada do grânulo é definida com base no desenho experimental. Usamos 1 mL de solução magnética do grânulo (5%, v/v) em cada experimento. Grânulos podem aderir à parede e/ou na tampa do tubo microcentrifuga; Portanto, transformar o MPC de ponta-cabeça em todas as direções para certificar-se de que todos os grânulos são coletados. Remover o sobrenadante e descartá-lo. Lave os grânulos por Lise. Adicionar 1,8 mL de tampão de Lise para os grânulos e retire o tubo fechado o MPC. Suspenda os grânulos no tubo de agitação e/ou transformando os tubos de cabeça para baixo até que a amostra é completamente homogênea. Coloque o tubo de volta para o MPC e transformá-lo de ponta-cabeça para coletar os grânulos. Abra o tubo e descartar o sobrenadante. Adicionar 1,0-1,8 ml de solução a limpo lisado (na etapa 3.7) para as contas e retire o tubo do MPC. Gire o tubo fechado de ponta-cabeça até que os grânulos são completamente homogêneos e giram lentamente o tubo por um rotador em temperatura ambiente por 30 min. Coloque-o no MPC e remover o lisado celular total apurado de grânulos e da tampa.Nota: O lisado celular total apurado pode ser descartado ou salvos de continuar a utilizar (consulte a observação após etapa 3.7). Adicionar 1% Tween 20 (pH 7) para os grânulos magnéticos conectado à carcaça (SAMBs).Nota: SAMBs mostrar fluorescência visível com ou mesmo sem usar um DRBT. Lavagem dos SAMBs Colocar o tubo com a suspensão SAMB o MPC e descartar o sobrenadante. Lavar os SAMBs 3 x com cada buffer: i) 1,8 mL de 1% Tween 20 (pH 7); II) 1,8 mL de tampão de lavagem (50mm NaH2PO4, 300 mM de NaCl, imidazol 5mm, 0,05% de Tween 20, pH 7); III) 1,8 mL de tampão de clivagem (50mm NaH2PO4, 300 mM de NaCl, 0,05% de Tween 20, pH 7).Nota: Para o procedimento de lavagem, consulte a etapa 4.1.1.4. O buffer de clivagem pode ser alterado de acordo com as necessidades de experimentais, mas recomenda-se verificar o manual dos grânulos Ni-NTA magnéticos para determinar a compatibilidade. Preparação da solução-mãe SAMB Adicione um buffer de clivagem para os lavado SAMBs para criar uma solução stock de SAMB.Nota: Após a adição do buffer, não agitar ou girar o tubo de ponta-cabeça. O volume da reserva clivagem varia de acordo com o desenho experimental individual e deve ser calculado com base no número de grânulos magnéticos (consulte a etapa 4.1.1.1) e sobre os volumes a ser usado na etapa 4.1.4.2. Para tubos de 2 mL, o volume aplicado é até 1.900 µ l (ver tabela 1). A densidade recomendada do grânulo magnético da solução SAMB é 2% – 10% (v/v). Tipo de estudo Volume de tampão de clivagem (µ l) Medições de S-dependente (Fig. 4) 1600 Medições de tempo-curso (Fig. 5A) 1600 Estudo de inibição (Fig. 5B) 1900 estudo de dependência do pH (Fig. 6) 1400 Tabela 1: Volume do decote buffer usado para preparar a solução de estoque SAMB nos diferentes tipos de medições. Remova o tubo fechado o MPC. Use a solução de estoque SAMB imediatamente ou armazená-lo em 4 ° C por até 24 h. Geração das amostras de ensaio, utilizando a solução de estoque SAMBNota: Os detalhes desta parte do ensaio são fortemente dependentes do delineamento experimental individual (amostra tipos são mostrados na tabela 2). Tipo de amostra Notas Amostra de reação (R) -usado para avaliar Propriedades de clivagem-contém a enzima e o substrato no buffer de clivagem Amostra em branco do substrato (B) -usado para avaliar a dissociação espontânea do substrato (ver passo 4.6.2)-contém apenas o substrato no buffer de clivagem Amostra de controle de substrato (C) -para a concentração de substrato detemining (consulte a etapa 4.6.3)-contém apenas o substrato em tampão de eluição Tabela 2: Tipos de amostras do ensaio Ni-NTA magnética do grânulo-baseado protease. Prepare-se para as amostras de ensaio 2 mL de tubos microcentrifuga de baixa proteína-ligação.Nota: Outra baixa proteína de ligação de utensílios de plástico também pode ser usada. Use tubos ou plano-fundo redondo para garantir a livre circulação de SAMBs. Consulte o número recomendado de tubos na tabela 3. Tipo de estudo R B C Medições de S-dependente (Fig. 4) 5 5 2 Medições de tempo-curso (Fig. 5A) 6 6 2 Estudo de inibição (Fig. 5B) 7 7 1 estudo de dependência do pH (Fig. 6) 5 5 1 Tabela 3: Número de tubos de microcentrifuga 2ml necessários para cada tipo de amostra em estudos de demonstrada. Suspender a solução estoque SAMB até homogeneidade e transferir a quantidade de substrato a ser analisado nas reações imediatamente em frascos de amostra. O volume recomendado é de 25-300 µ l, mas é a ser definido de acordo com o projeto experimental individual (tabela 4).Nota: Verifique se todos os SAMBs foram medidos no fundo dos tubos. SAMBs pode aderir à parede do tubo, que pode distorcer os resultados do ensaio. Se diferentes volumes devem ser medidos sequencialmente, começar alíquotas com maior volume e tentar minimizar a alteração da pipeta e/ou pontas de pipetas. Tipo de estudo R B C Medições de S-dependente (Fig. 4) 25 – 50 – 100 – 150 – 250 25 – 50 – 100 – 150 – 250 25 Medições de tempo-curso (Fig. 5A) 25 25 25 Estudo de inibição (Fig. 5B) 120 120 120 estudo de dependência do pH (Fig. 6) 100 100 100 Tabela 4: Volume da solução SAMB medido em frascos de amostra de cada tipo de amostra em estudos de demonstrada. Coloque os tubos de amostra contendo a suspensão SAMB aliquotada para o MPC e deslocar ligeiramente o MPC e para trás. Cuidadosamente remova os SAMBs o sobrenadante e descartá-lo. Retirar os tubos do MPC e adicionar o volume calculado de amortecedor da reação (clivagem ou eluição tampão [100 mM EDTA, 0,05% de Tween 20, pH 7]) com cuidado para os SAMBs.Nota: Calcule o volume de reserva de acordo com o projeto experimental individual (tabela 5). Para tubos de 2 mL, volume final da mistura de reação (o volume do buffer a ser adicionado nesta etapa de reação + o volume da solução a ser adicionado na etapa 4.2.3) recomendado é 50-150 µ l. Certifique-se de que todos os SAMBs são lavados no buffer adicionado. Tampão de eluição é usado em vez de buffer de clivagem nos casos de amostras de controlo (C) substrato. Para um estudo de inibição, o inibidor da escolha é recomendado para ser adicionado a este passo. Tipo de estudo Volume de tampão de reação (µ l) Medições de S-dependente (Fig. 4) Buffer de clivagem µ l 68 Medições de tempo-curso (Fig. 5A) Buffer de clivagem µ l 68 Estudo de inibição (Fig. 5B) 67,3 buffer de clivagem µ l + inibidor de 0,7 µ l estoque solução * estudo de dependência do pH (Fig. 6) µ L 69.5 clivagem reserva * * Tabela 5: Volume de tampão de reação nos estudos demonstraram. * Amprenavir foi resolvido em dimetil-sulfóxido; soluções estoque amprenavir (variando de 1 nanômetro a concentrações de 1 µM) foram aplicados para estudo inibitório (ver Figura 5B). * * O pH do buffer clivagem aplicada variou entre pH 6.0-8.5. Feche as tampas dos tubos. Agora as amostras estão prontas para o ensaio.Nota: As amostras podem ser armazenadas a 4 ° C por até 24 h, mas o armazenamento só é aplicável se a solução estoque SAMB foi usada imediatamente após o preparo (ver passo 4.1.3.2). Iniciação das reações proteolíticas Prepare a solução de enzima proteolítica de acordo com as necessidades de experimentais.Nota: É recomendável usar um buffer de clivagem para dissolver ou diluir a enzima. Protocolos para a purificação do HIV-114 e TEV PRs18 foram publicados anteriormente. Defina do thermoshaker taxa de agitação (600 rpm) e temperatura de incubação (quadro 6). Tipo de estudo Temperatura de incubação (° C) Medições de S-dependente (Fig. 4) 37 Medições de tempo-curso (Fig. 5A) 37 Estudo de inibição (Fig. 5B) 37 estudo de dependência do pH (Fig. 6) 30 Tabela 6: temperaturas de incubação aplicadas no estudo de diferentes tipos. Para HIV-1 PR, 37 ° C é recomendado, enquanto 30 ° C é recomendado para TEV PR. Adicione a solução de enzima para as amostras de reação para inicializar reações proteolíticas.Nota: No caso do branco do substrato (B) e amostras C, adicione clivagem buffer (buffer de enzima) e tampão de eluição, respectivamente. O volume é calculado de acordo com as necessidades individuais de experimentais (tabela 7). Para tubos de 2 mL, recomendado volume final da mistura reacional (o volume da reação reserva adicionado na etapa 4.1.4.5 + o volume da solução a ser adicionado nesta etapa) é de 50-150 µ l. Tipo de estudo Volume de tampão de eluição/tampão de solução/enzima a enzima (µ l) Medições de S-dependente (Fig. 4) 2 Medições de tempo-curso (Fig. 5A) 2 Estudo de inibição (Fig. 5B) 2 estudo de dependência do pH (Fig. 6) 0,5 Tabela 7: Volume da enzima enzima/solução tampão/eluição reserva adicionado durante a inicialização das amostras de ensaio, no caso os estudos demonstraram. Agitar as contas cuidadosamente movendo suavemente os tubos e colocar imediatamente os tubos da thermoshaker já tremendo.Nota: Terminação Manual da amostra (ver secção 4.3) leva mais tempo do que a iniciação; Portanto, recomenda-se um atraso registrado de pelo menos 2 min entre iniciações das reações. Incube as amostras de acordo com o projeto experimental (tabela 8). Tipo de estudo Tempos de incubação (min) Medições de S-dependente (Fig. 4A) 7 Medições de S-dependente (Fig. 4B) 120 Medições de tempo-curso (Fig. 5A) 0 – 2,5 – 5 – 10 – 15 – 20 Estudo de inibição (Fig. 5B) 10 estudo de dependência do pH (Fig. 6) 60 Tabela 8: Os tempos de incubação aplicados para as amostras de ensaio nas diferentes medições. Estaçãation das reações proteolíticas Tire o agitador, 30 s antes do final da incubação, a amostra e girá-lo prontamente. Coloque o tubo sobre o MPC, deixe 15 s, e deslocar ligeiramente o MPC e para trás. Abra a tampa e transferir o sobrenadante cuidadosamente para um prato ou um tubo novo.Nota: Não toque os grânulos concentrados com a ponta da pipeta. O sobrenadante coletado de amostras C e R amostras com um alto grau de segmentação pode mostrar fluorescência visível com ou mesmo sem o uso de um DRBT. Deteção fluorescente Transferi 2 x 30 µ l dos sobrenadantes de amostra separada para uma microplaca de metade-área preta. Medir a fluorescência usando os filtros apropriados de excitação e emissão.Nota: Medir a fluorescência básica do buffer de clivagem e tampão de eluição, também. Combinações de filtro precisa ser escolhido com base na proteína fluorescente medida (tabela 9). Proteína fluorescente Filtros de excitação (nm) Filtros de emissão (nm) mTurqiouse2 355/40 460/25 mEYFP 544/15 590/10 mApple 544/15 590/10 Tabela 9: Excitação e emissão de filtros usados para detectar diferentes proteínas fluorescentes. CalibraçãoNota: Para gerar as curvas de calibração na etapa 4.6.1, valores de intensidade de fluorescência de clivagem – ou eluição-tampão-resolvido substratos purificados em diferentes concentrações precisam ser medido. Purifica os substratos fluorescentes.Nota: Para a purificação, SAMBs de substrato em branco (B) amostras após o ensaio de protease pode ser recolhido ou um SAMB nova suspensão pode também ser preparado (ver seções 4.1.1 e 4.1.2). Coloque um tubo com SAMBs suspendidos em 1 mL de tampão de clivagem (2% – 10%; v/v) para o MPC e coletar os grânulos magnéticos girando o MPC de ponta-cabeça em todas as direções. Abra o tubo e retire o buffer de clivagem, tanto do tubo e a tampa. Retire o tubo do MPC e adicionar 400-600 µ l de tampão de eluição para as SAMBs. Gire lentamente o tubo fechado com um rotador em temperatura ambiente por 5 min. Coloque o tubo sobre o MPC e coletar os grânulos girando o MPC de ponta-cabeça. Remover o sobrenadante contendo o substrato fluorescente intacto purificado (eluído) e transferi-lo para um novo tubo de baixa proteína-vinculação microcentrifuga.Nota: O eluato mostra fluorescência claramente visível com ou mesmo sem usar um DRBT. Realizar a troca de amortecedor paralela usando dois dispositivos de ultrafiltração de 0,5 mL 10K. Medir a metade do volume do eluato preparado (200-300 µ l) para cada dispositivo de ultrafiltração. Depois em cada etapa de centrifugação, diluir o eluído concentrado no primeiro e os segundo dispositivos de ultrafiltração por buffers de eluição e clivagem, respectivamente. Após a recuperação, ajuste as amostras concentradas resolvidas nos buffers diferentes para o mesmo volume, entre 120-200 µ l.Nota: Agora o teor de proteínas do substrato reserva-resolvido clivagem é idêntico ao substrato de resolvido-tampão de eluição; Portanto, não é necessário determinar o conteúdo de um último passo 4.5.3, a proteína se o método usado para medir a concentração de proteína interfere com EDTA. Determinar o teor de proteínas dos substratos dissolvido em tampão de eluição ou clivagem medindo a absorbância em 280 nm.Nota: Outros métodos (por exemplo, Bradford ou bicinchoninic ácido (BCA) ensaios) também podem ser usados para medir a concentração de proteína, mas a possível interferência com EDTA (presente no buffer de eluição) ou com a absorção do substrato fluorescente precisa ser considera-se. Recomenda-se o teor de proteínas inicial da solução de substrato a ser aplicado na etapa 4.5.4 estar entre 0,4-2,0 mg/mL, a fim de gerar uma calibração curva em uma gama adequada. Ver tabela 10 para coeficientes de extinção. Substrato Peso molecular(Da) Coeficiente de extinção(Cm M-1 -1, em 280 nm medido na água) Seu6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 72101.7 96845 Seu6- MBP-KARVL * macacos-mTurquoise2 72042.7 95355 Seu6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP 72367.1 94325 Seu6- MBP-VSQNY * PIVQ-mApple 72145.9 105200 Quadro 10: pesos moleculares e os coeficientes de extinção de substratos de proteína da fusão fluorescente recombinante diferentes. Prepare uma diluição serial duplo pelo menos oito passos, tanto da eluição – e a partir das soluções de substrato de clivagem-tampão-resolvido, usando o buffer de clivagem ou eluição para a diluição, respectivamente. Transferi 30 µ l de cada diluição ponto para uma microplaca de metade-área preta. Medir a fluorescência com um fluorímetro, usando a configuração aplicada na etapa 4.4.2.Nota: Medir a fluorescência básica de ambos o decote e o tampão de eluição. Avaliação do ensaio Traça as curvas de calibração. Calcule a concentração (em mM) das soluções de substrato purificado (usado na etapa 4.5.4), baseada-se o teor de proteínas, determinado na etapa 4.5.3. Corrigi os valores de intensidade de fluorescência relativo (RFU) de pontos de diluição serial pelos valores RFU básicos do buffer (buffer de clivagem ou o tampão de eluição) diluição aplicada. Plotar os valores RFU corrigidos contra a concentração molar de substratos purificados clivagem – ou eluição-tampão-resolvido e realizar uma regressão linear (força a interceptar a zero).Nota: Um valor elevado de2 R (˃0.97) indica uma boa correlação linear entre a fluorescência e a concentração da proteína fluorescente. Neste caso, o declive da linha de regressão pode ser usado para avaliar as concentrações dos componentes do ensaio na faixa analisada em etapas 4.6.2 e 4.6.3. Distribuição de ponto de dados e erros experimental pode afetar a confiabilidade da calibração; assim, uma avaliação gráfica pode ser realizada com a ajuda de zoom em gráficos (como mostrado na Figura 3), a fim de verificar se R2 e os valores de inclinação são influenciados pelos dados. Calcule a quantidade de produto de clivagem fluorescente C-terminal nas amostras de reação. Corrigi os valores RFU de cada amostra R com os valores RFU da amostra B correspondente. Calcular a concentração do produto de clivagem (em mM) nas amostras de reação dividindo o corrigido valores RFU pela encosta da calibração clivagem reserva-com base em curva (consulte a etapa 4.6.1.3). Calcule a concentração de substrato aplicado nas amostras de reação. Corrigi os valores RFU da amostra C com o valor RFU do buffer de base de eluição. Calcular a concentração do substrato (em mM) eluted nos sobrenadantes da amostra C dividindo sua corrigido valores RFU pela encosta da calibração eluição reserva-com base em curva (consulte a etapa 4.6.1.3). Determine a concentração de substrato (em mM) da solução-mãe SAMB usada para criar as amostras de ensaio na etapa 4.1.4.2, com base na seguinte equação:Aqui, cSAMB é a concentração molar da solução-mãe SAMB preparada na seção 4.1.3; cC é a concentração molar do substrato eluted na amostra C calculado no passo 4.6.3.3; Vr é o volume da mistura de reação, criado pela adição de buffer reação na etapa 4.1.4.5 e o buffer de enzima na etapa 4.2.3.; e VSAMB é o volume da solução da amostra C (etapa 4.1.4.2) SAMB. Calcule a concentração molar de substratos em cada amostra R baseada a concentração molar da SAMB solução-mãe (em mM) de acordo com o volume (em µ l) medida em cada tubo de amostra de reação na etapa 4.1.4.2. Execute o processamento de dados.Nota: A análise dos dados depende do objetivo do experimento. O vídeo mostra um exemplo de processamento de dados de um estudo cinético do substrato dependentes em HIV-1 PR usando seu6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrato. Os valores de velocidade inicial são calculados a partir do número de fragmentos de clivagem do C-terminal e são plotados contra a concentração de substrato aplicado. Os parâmetros cinéticos são determinados por uma análise de regressão não-linear de Michaelis-Menten. Reciclagem dos grânulos magnéticosNota: Após a realização de um ensaio, os grânulos de agarose magnético podem ser recolhidos e reciclados. Recolher os grânulos magnéticos usados com o MPC e descartar o sobrenadante. Lave os grânulos com 1,8 mL de buffers de seguir, na ordem dada: tampão de regeneração A (0,05% Tween 20, 0.5 M de NaOH), buffer de regeneração B (0,05% Tween 20), buffer de regeneração C (0,05% Tween 20, 100 mM EDTA, pH 8), buffer de regeneração B, regeneração tampão D ( 0,05% Tween 20, NiSO4a 100 mM, pH 8), buffers de regeneração B e regeneração E (0,5% de Tween 20, 30% de etanol, pH 7).Nota: Para o procedimento de lavagem, consulte a etapa 4.1.1.4. Armazenar os grânulos reciclados em buffer de regeneração E a 4 ° C. 5. análise de página Preparação da amostraNota: Depois de executar o ensaio de Ni-NTA magnética do grânulo-baseado, os sobrenadantes de ensaio podem ser analisados por página. Nesse caso, ignore os passos 5.1.1 e 5.1.2. No entanto, também é possível analisar a solução purificada substratos fluorescentes e/ou seus fragmentos de clivagem após digestão na solução com a protease de interesse. Neste caso, continue o protocolo com passo 5.1.1. Prepare a solução de substrato fluorescente purificado conforme item 4.5.1. Execute em solução de digestão. Troca o tampão de eluição com buffer de clivagem no dispositivo de ultrafiltração de 0,5 mL 10K e alíquota as amostras para ser digerido em tubos de microcentrifuga de 1,5 mL.Nota: para a análise de página, nós aliquotadas 68 µ l de cada substrato, mas o número de tubos de amostra e o volume de solução de substrato para ser aliquotadas podem ser otimizadas de acordo com o projeto experimental individual. Adicione a solução de enzima para as amostras.Nota: Para a análise de página, aplicamos 2 µ l de HIV-1 PR, preparado como descrito por Bozóki et al.14, mas o volume pode ser otimizado de acordo com o projeto experimental individual. É recomendável usar o buffer de clivagem para dissolver ou diluir a enzima. Incube as amostras de acordo com o projeto experimental.Nota: Para a análise de página, estamos incubados a mistura de reação por 45 min a 37 ° C, mas o tempo de incubação e temperatura precisam ser definidas de acordo com o projeto experimental. Terminar a reação executando passo 5.1.3. Prepare a amostra para a página.Nota: As amostras fluorescentes-substrato-contendo podem estar preparadas para a página por um nondenaturing ou por um método de desnaturação. Para o uso de condições nondenaturing ou desnaturação, siga o passo 5.1.3.1 ou 5.1.3.2, respectivamente. Preparar uma amostra de nondenatured: misturar 30 µ l da amostra com 6 µ l de 6 x nondenaturing tampão de amostra-carregamento (300 mM Tris, glicerol 20%, 0,05% de bromofenol, pH 6,8). Preparar uma amostra de desnaturado: misturar 30 µ l da amostra com 6 µ l de 6 x tampão de amostra-carregamento desnaturação (300 mM Tris, 20% de glicerol, 100mm de bromofenol, SDS de 12%, 0,05% β-Mercaptoetanol, pH 6,8) e aquecer as amostras a 95 ° C por 10 min. Análise de SDS-PAGENota: Opcionalmente, se apenas amostras nondenatured (preparado no passo 5.1.3.1) estão a ser analisado, uma página nativa também pode ser realizada. Nesse caso, ignore a secção 5.3. Preparar um gel de SDS-poliacrilamida (uso 14% separando e 4% gel de empilhamento) e encha o depósito com tampão de eletroforese (2,5 mM Tris, glicina 19,2 mM, 0,01% SDS). Adicionar as amostras (preparadas na etapa 5.1.3.1 ou 5.1.3.2) nos poços de um gel de poliacrilamida e executar eletroforese na tensão de 120 V. Remova o cartucho de gel do módulo de execução e colocar o gel em um tanque de lavar roupa.Nota: Amostras de Nondenatured já são visíveis no gel, até mesmo para o olho nu ou com um DRBT. Renaturalização em-gel e detecção de proteínas fluorescentesNota: Para detectar as proteínas fluorescentes em amostras desnaturadas (preparadas na etapa 5.1.3.2) sobre o DRBT, SDS precisa ser lavada do gel, a renaturalização parcialmente as proteínas. Adicionar ~ 100 mL de água destilada para o gel e lave o gel pelo menos durante 30 min.Nota: Para melhorar a remoção de SDS, substituir a água a cada 10 minutos, ou lave até 60 min. Visualize as proteínas fluorescentes, usando um DRBT, ou imagem de UV. Coloração de Coomassie convencional do gel Manche o gel com corante azul brilhante de Coomassie Visualizar nonfluorescent proteínas.