蛍光プロテアーゼ アッセイプラット フォームとそのゲルの下で遺伝子組換えの融合蛋白質の使用

1. 基板コーディング発現プラスミドの世代 パーチと NheI の制限酵素によって pDest 彼6- MBP FP 発現プラスミドをリニア化します。PDest 彼6- MBP FP の世代、Bozóki ら14を参照してください。 PDest 彼6- MBP FP 発現プラスミドの 1,500-2,000 μ g、パーチの 2 μ を追加し、NheI 制限エンドヌクレアーゼ、10 μ L の 10 x バッファー (材料の表を参照)、ヌクレアーゼ フリー水 (NFW) 微量遠心チューブに 100 μ L を。 1 h の 37 ° C で反応混合物を孵化させなさい。 反応混合物にローディングの染料 DNA パープル x 6 の 20 μ L を追加、1% のアガロースゲルを用いる電気泳動で開裂製品を区切ります。1 kB の DNA ラダーを標準として適用します。 15 分のためのゲルを TAE バッファー (40 mM トリス、20 mM 酢酸、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.5) 含む 20 μ l SYBR グリーン溶液 20 mL でリンスし、シャープなツールを使用して agarose のゲルから線形プラスミッドのバンドをします。注: 暗い読書ブルー transilluminator (DRBT) によるゲルを照明しながら線形 pDest 彼6- MBP FP プラスミドは 7-8 kB のまわりで離散、明るいバンドとして表示されます。 製造元の指示に従ってゲル抽出キットを使用してゲルのスライスから一直線に並べられた発現プラスミドを浄化します。 線形 pDest 彼6- MBP FP 発現プラスミドに基板のシーケンスを挿入します。 フォワード (FWD) と興味の基板シーケンスを符号化逆 (REV)エシェリヒア属大腸菌コドン最適化のオリゴヌクレオチドのプライマーをアニールします。注: アニールされたプライマーは、パーチと NheI の制限の endonuclease 胸の谷間部位 (図 2) に対応する粘着性がある端に補強されます。 200 で一直線に並べられた発現プラスミドのミックス 150 ng の FWD と 200 ng REV オリゴヌクレオチドのプライマー 0.2 mL ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) のチューブし、地上デジタルを追加することにより 17 μ L にボリュームを調整の ng。 混合物は 2 分の 65 ° c とし、少なくとも 2 分のための 4 ° C で孵化させなさい。 結紮アニールされたプライマーの線形プラスミッドへの挿入を実行します。 T4 リガーゼ バッファー (10 倍) の 2 μ L と T4 リガーゼの 1 μ L を線形プラスミッドおよびアニールされたプライマーを含んでいる混合物に追加します。 16 h 16 ° C で結紮混合物を孵化させなさい。 図 2: 蛋白質分解開裂のためのコーディングのオリゴヌクレオチドのプライマー サイト シーケンス。前方および逆プライマーをエンコード、VSQNY * HIV 1 PR の PIVQ 胸の谷間サイト シーケンス相補的なオリゴヌクレオチドのプライマーをアニール後短い二本鎖 DNA はパーチと NheI の制限酵素のそれに対応する粘着末端を含まれています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 結紮の混合物を 5 μ l 添加による BL21(DE3) の有能なセルの 100 μ L を変換し、アンピシリンを含むホストゲノム スープ (LB) 寒天培地プレート上のセルを広めます。注: 蛍光タンパク質の N 末端融合タグと、同じ開いたリーディング ・ フレームに、結紮後のみとなります。変換した後、数日 (関心のある挿入された胸の谷間サイトのコーディング発現プラスミドを含む) 植民地が可視蛍光または、DRBT を使用しなくても表示されます。 描かれた植民地からのグリセロール ストックを準備します。 (最終濃度 100 μ G/ml) にアンピシリンを含む LB 培地の 5 μ L を含む 50 mL の遠心管に離散コロニーを洗います。 継続的に 220 rpm で揺れながら 37 ° C 8 時間インキュベートします。その後、室温で 5 分間 1,000 × gで遠心分離によってセルを収穫します。 優しく (蒸留水で希釈) 80% グリセロールの解決の 1 mL の細胞を中断し、懸濁液 500 μ L の 10 mM MgCl2ソリューションを追加します。 凍結管に懸濁液を移し、-70 ° C で在庫を保管 DNA シーケンスによって生成されたプラスミドのシーケンスを確認します。 50 mL の遠心管中 100 μ g/mL アンピシリンを含む LB 培地 5 ml (1.7 の手順で準備) グリセロール ストックの 10 μ L を追加します。 継続的に 220 rpm で揺れながら 16 h の 37 ° C の懸濁液を孵化させなさいその後、4 ° C で 10 分間 2,000 × gで遠心分離によって細胞を収穫します。 分離発現プラスミド プラスミド miniprep によって細胞ペレットからキット (材料の表を参照してください) 製造元の指示によると、DNA シークエンシングのため精製プラスミドを使用します。注: のシーケンス、5′-GATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAG-3′ (フォワード) と 5′-GCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGC-3′ (逆方向) のオリゴヌクレオチドのプライマーを使用することがあります。 2. 蛍光基質の発現 スターターを準備します。 50 mL の遠心管中 100 μ g/mL アンピシリンを含む LB 培地 5 ml (1.7 の手順で準備) グリセロール ストックの 10 μ L を追加します。 継続的に 220 rpm で振りながら 15 h の 37 ° C の懸濁液を孵化させなさい。 細菌培養 (5 mL) を 500 mL 滅菌三角フラスコ中 100 μ g/mL アンピシリンを含む新鮮な LB 培地 50 mL に転送します。 37 ° C で細胞を継続的に 220 rpm で揺れながら 0.6 から 0.8 600 nm の波長での吸光度に成長します。注: テトラサイクリン治療ステップ 2.5 で適用する場合は、勧めできません 600 0.6 以上の吸光度に細胞を成長する nm。 タンパク質の発現を誘導する 1 mM の最終濃度にイソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) を追加します。 テトラサイクリン治療は適用されません 220 rpm で継続的に揺れながら 37 ° C で 3 h の文化をインキュベートして 2.6 の手順とプロトコルを続行します。テトラサイクリン治療が適用される場合は、手順 2.5.1-2.5.3 でプロトコルを続行します。メモ:エシェリヒア属大腸菌の細胞によって生成されるいくつかの FPs が付いて長い成熟時間 (前作参照)16,17;これらの場合、タンパク質翻訳は必要に応じて基板の解決の蛍光の収率を高めるためにテトラサイクリン治療によって逮捕することができますされます。 継続的に 220 rpm で揺れながら 37 ° C で 2 h の細胞懸濁液を孵化させなさい(最終濃度 200 μ G/ml) にテトラサイクリン ソリューションを追加します。 220 回転で継続的に揺れながら 37 ° C で好みの蛍光タンパク質の成熟の時間に従って細胞培養を孵化させなさい。 50 mL 遠沈管をきれいにし、4 ° C で 15 分間 4,000 x gで遠心分離によって細胞を収穫する文化の 2 x 25 mL を転送します。 上澄みを廃棄し、-70 ° c 少なくとも 1 h で細菌の細胞ペレットを格納します。注: セル表現蛍光基板表示可視蛍光または、DRBT を使用しなくても。 3. セル中断 氷の上凍結細胞ペレットを置き、15 分のために解凍しましょう。 ペレットに 2 mL の溶解バッファー (50 mM NaH2PO4, 300 mM の NaCl、10 mM のイミダゾール、0.05% Tween 20、pH 8) を追加し、セルを中断します。 懸濁液に作りたて phenylmethanesulfonyl-フッ化物 (PMSF) プロテアーゼ阻害剤溶液 (8.7 mg/mL、エタノールに溶解) の 10 μ L を追加します。 懸濁液にリゾチーム 2 mg と DNase の 20 単位を追加し、それを中断します。 15 分と渦の氷の懸濁液を孵化させなさいそれは時折。 1.5 mL 遠心チューブに懸濁液の 2 x 1 mL を転送し、10 回のラウンドで、3 分間懸濁液を超音波超音波処理と 5 s の s。 部屋の温度で 20 分間 10,000 x gでチューブを遠心分離します。各チューブから慎重に蛍光清 (クリア細菌細胞ライセート) を削除し、新しいマイクロ遠心チューブ用にそれを転送します。注: 蛍光性基質の溶解液をクリアまたは、DRBT を使用しなくても目に見える蛍光を示し 4 ° C で 2 週間まで保存できます。凍結しないでください。クリア lysates はプロテアーゼの試金 (セクション 4.1 参照) のサンプル準備のために直接利用できるまたはまた基板の浄化のために使用できます (手順 4.5.1 参照)。 4. Ni NTA 磁気ビーズによるプロテアーゼの試金 注: 分析プラットフォームの柔軟性のためそれを最適化できます研究の多くの異なる種類に。この理由と好みの酵素の活動率の違いにより、(どこにそれが表されます) アッセイ パラメーターの一部明示的に記述することはできませんが、個々 の目的と実験的なデザインを最適化する必要があります。ガイダンス、として研究のいくつかの型のパラメーターは特定のステップで示されます。 サンプル準備 磁気ビーズの基板接続の生成 閉じた 2 mL 低タンパク結合 (材料の表を参照) 微量遠心チューブまたは新しいを含む磁気コンセントレーター (MPC) で (4.7 節を参照) Ni NTA 磁気アガロース ビーズをリサイクルを配置します。注: 応用ビーズ懸濁液の量は実験的なデザインに基づいて設定します。各実験で 5% (v/v) 磁気ビーズ溶液 1 mL を使いました。 遠心管のふたおよび/または壁にビーズが付いていますしたがって、裏返して MPC ビーズのすべてを収集できるかどうかを確認するすべての方向で。 上澄みを除去し、それを破棄します。 換散バッファーによってビーズを洗浄します。 ビーズに 1.8 mL の溶解バッファーを追加し、MPC から閉じた管を削除します。 管の振動および/またはサンプルが完全に均一になるまでチューブを逆さま回すビーズを中断します。 MPC に戻しチューブ、ビーズを収集するために逆さまにそれを回します。 管を開き、上澄みを廃棄します。 ビーズに (3.7 の手順で準備) ライセートのクリアの 1.0 1.8 mL を追加、MPC からチューブを取り外します。 裏返して閉じたチューブ ビーズは完全に同質なゆっくりと 30 分間室温で回転子によってチューブを回転させてまで。 MPC に入れます、ビーズと蓋からクリア細胞ライセートを削除します。注: オフになって細胞ライセートが破棄されるかそれ以上の使用のために保存 (3.7 の手順の後のメモを参照)。 1% 追加基板に接続された磁気ビーズ (SAMBs) にトゥイーン 20 (pH 7)。注: SAMBs はまたは、DRBT を使用しなくても目に見える蛍光を表示します。 SAMBs の洗浄 MPC に SAMB 懸濁液管を置き、上澄みを廃棄します。 SAMBs 3 を洗って各バッファーに x: i) 1.8 mL の 1% Tween 20 (pH 7);ii) 1.8 mL の洗浄バッファー (50 mM NaH2PO4、300 mM の NaCl、5 mM のイミダゾール、0.05% Tween 20、pH 7);iii) 1.8 mL の胸の谷間バッファー (50 mM NaH2PO4, 300 mM の NaCl、0.05% Tween 20、pH 7)。注: 洗濯の手順ステップ 4.1.1.4 を参照してください。実験ニーズに合わせて胸の谷間バッファーを変更可能性がありますが、互換性を判断する Ni NTA 磁気ビーズのマニュアルをチェックをお勧めします。 SAMB ストック溶液の調製 胸の谷間のバッファーを洗浄 SAMBs SAMB 在庫ソリューションを作成するに追加します。注: バッファーの添加後、振るかチューブを裏返ししないします。胸の谷間バッファーのボリュームは、個々 の実験的デザインによって左右 4.1.4.2 の手順で使用するボリュームに (手順 4.1.1.1 参照) 磁気ビーズの数に基づいて計算する必要があります。2 mL 管応用のボリュームは最大 1,900 μ L (表 1参照)。SAMB 原液の推奨される磁性体粒子密度は 2%-10% (v/v) です。 研究の種類 胸の谷間のバッファー (μ L) のボリューム S 依存測定 (図 4) 1600 経時的測定 (図 5 a) 1600 阻害試験 (図 5 b) 1900 pH 依存性の解明 (図 6) 1400 表 1: 量の測定の種類に SAMB ストック溶液を調製するために使用胸の谷間バッファー。 MPC から閉じた管を削除します。すぐに SAMB 原液を使用または 24 h まで 4 ° C で保存します。 SAMB 原液を使用して検体の世代注: 試金のこの部分の詳細は、個々 の実験計画 (サンプルの種類は、表 2に示す) に強く依存します。 サンプルの種類 ノート 反作用のサンプル (R) -胸の谷間プロパティを評価するために使用-胸の谷間バッファーの基質と酵素が含まれています 基板ブランク サンプル (B) -自発的な基板解離を評価するために使用 (手順 4.6.2 参照)-胸の谷間バッファー基板のみが含まれています 基板のコントロールのサンプル (C) -組織基質濃度の (手順 4.6.3 参照)-溶出バッファー基板のみが含まれています 表 2: サンプル タイプの Ni NTA 磁気ビーズによるプロテアーゼの試金。 試験サンプルの低タンパク結合マイクロ遠心チューブ用の 2 mL を準備します。注: 他の低蛋白プラスチックの構造を結合を使用もことがあります。SAMBs の自由な移動を確保するためには、ラウンドまたはフラット底チューブを使用します。テーブル 3の中の管の推奨数を参照してください。 研究の種類 R B C S 依存測定 (図 4) 5 5 2 経時的測定 (図 5 a) 6 6 2 阻害試験 (図 5 b) 7 7 1 pH 依存性の解明 (図 6) 5 5 1 表 3: 実証研究のサンプルの種類ごとの必要な 2 mL マイクロ遠心チューブ用の数です。 均質性まで SAMB 原液を中断し、サンプル瓶にすぐに反応で分析する基板の量を転送します。推奨されるボリュームは 25 300 μ L、だ、個々 の実験計画 (表 4) によると設定します。注: は、すべて SAMBs をチューブの底に測定されているかどうかを確認します。SAMBs が分析結果を歪めることができる管の壁に固執します。別のボリュームを連続的に測定する場合は、早かったから始まる最高のボリューム、ピペット、ピペット チップの変更を最小限にしようとします。 研究の種類 R B C S 依存測定 (図 4) 25-50-100-150-250 25-50-100-150-250 25 経時的測定 (図 5 a) 25 25 25 阻害試験 (図 5 b) 120 120 120 pH 依存性の解明 (図 6) 100 100 100 表 4: SAMB 溶液の量は、実証研究のサンプルの種類ごとのサンプル瓶で測定されます。 MPC に検体 SAMB 懸濁液を含むサンプル チューブを置き、少し MPC を前後移動します。 慎重に、SAMBs から上澄みを除去し、それを破棄します。 MPC からチューブを削除し、SAMBs に慎重に計算量の反応バッファー (胸の谷間や溶出バッファー [100 mM EDTA、0.05% Tween 20、pH 7]) を追加します。注: は、個々 の実験計画 (表 5) によるとバッファー量を計算します。2 mL 管反応混合物 (この手順で追加する反作用バッファーのボリューム + 4.2.3 の手順で追加する溶液の量) の推奨最終巻は 50-150 μ L.、SAMBs のすべてが追加されたバッファーで洗浄を確認してください。溶出バッファーは、基板制御 (C) 試料の場合胸の谷間バッファーの代わりに使用されます。抑制の研究では、このステップで追加する選択の阻害剤を使用することをお勧めします。 研究の種類 量の反応バッファー (μ L) S 依存測定 (図 4) 68 μ L 胸の谷間バッファー 経時的測定 (図 5 a) 68 μ L 胸の谷間バッファー 阻害試験 (図 5 b) 67.3 μ L 胸の谷間バッファー + 0.7 μ L 阻害剤在庫ソリューション * pH 依存性の解明 (図 6) 69.5 μ L 胸の谷間バッファー * * 表 5: 実証研究の反応バッファーのボリューム。* アンプレナビル ジメチルスルホキシド; で解けたアンプレナビル原液 (1 から 1 μ M の濃度に nM) 抑制実験に適用された (図 5 b参照)。* * PH 6.0 8.5 から応用胸の谷間バッファーの pH。 チューブの蓋を閉じる。今サンプルは、アッセイのため準備ができています。注: サンプルは 24 h まで 4 ° C で保存できますが、ストレージ、SAMB 原液は調製後直ちに使用された場合のみ (4.1.3.2 の手順を参照してください)。 タンパク質分解反応の開始 実験のニーズによると蛋白分解酵素液を準備します。注: 溶解および/または酵素を希釈する胸の谷間のバッファーを使用することをお勧めします。HIV 114 TEV PRs18の浄化のためのプロトコルは、以前公開されています。 Thermoshaker の攪拌速度 (600 rpm) および培養温度 (表 6) を設定します。 研究の種類 孵化の温度 (° C) S 依存測定 (図 4) 37 経時的測定 (図 5 a) 37 阻害試験 (図 5 b) 37 pH 依存性の解明 (図 6) 30 表 6: 培養温度別の研究の種類に適用されます。TEV 広報のため 30 ° C を推奨しながら HIV 1 PR のため 37 ° C が推奨です。 反作用のサンプル蛋白質分解反応を初期化するために酵素液を追加します。注: 基板空白 (B) と C サンプルの場合胸の谷間 (酵素バッファー) と溶出バッファー、それぞれ追加します。ボリュームは、個々 の実験的ニーズ (表 7) に従って計算することです。反応混合物 (4.1.4.5 の手順で追加反応バッファーのボリューム + この手順で追加する溶液の量) の推奨最終巻は、2 mL チューブ、50-150 μ L です。 研究の種類 酵素ソリューション/酵素バッファー/溶出バッファー (μ L) のボリューム S 依存測定 (図 4) 2 経時的測定 (図 5 a) 2 阻害試験 (図 5 b) 2 pH 依存性の解明 (図 6) 0.5 表 7: 実証研究の場合検体の初期化中に追加酵素ソリューション/酵素バッファー/溶出バッファーのボリューム。 軽くチューブを移動することによって慎重にビーズをかき立てるし、既に振動の thermoshaker にすぐにチューブを配置します。注: マニュアル サンプル終了開始で少し時間がかかります (セクション 4.3 を参照)したがって、反応のイニシエーションの間は、少なくとも 2 分の登録の遅延の使用をお勧めします。 実験的なデザイン (表 8) に従ってサンプルをインキュベートします。 研究の種類 潜伏時間 (分) S 依存測定 (図 4 a) 7 S 依存測定 (図 4 b) 120 経時的測定 (図 5 a) 0-2.5-5-10-15-20 阻害試験 (図 5 b) 10 pH 依存性の解明 (図 6) 60 表 8: インキュベーション時間が異なる測定検体に適用されます。 タンパク質分解反応のTermin情報 シェーカー、インキュベーション、末 30 秒前からサンプルを取るし、速やかにそれを回します。 MPC にチューブを置き、放置 15 s、少し MPC を前後移動と。 蓋を開き、プレートまたは新しいチューブに上清を慎重に転送します。注: は、ピペットの先端を集中してビーズを触れないでください。C と胸の谷間の高度で R サンプルが収集された清は、可視蛍光の有無も、DRBT を使用してを表示ことがあります。 蛍光検出 黒半部のマイクロ プレートに分割サンプル上清の 2 x 30 μ L を転送します。 適切な刺激および放出フィルターを使用して蛍光を測定します。注: は、胸の谷間のバッファーおよび溶出バッファーの基本的な蛍光を測定します。フィルターの組み合わせを選択する必要は、測定された蛍光タンパク質 (表 9) に基づいています。 蛍光タンパク質 励起フィルター (nm) 排ガス浄化装置 (nm) mTurqiouse2 355/40 460/25 mEYFP 544/15 590/10 マップル 544/15 590/10 表 9: 刺激および放出フィルター異なった蛍光蛋白質を検出するために使用します。 校正注: 4.6.1、蛍光強度値の胸の谷間- や溶出-バッファー-解決の手順で較正曲線を生成するには、異なる濃度で精製された基板の測定する必要があります。 蛍光基質を浄化します。注: 浄化、プロテアーゼ アッセイを収集ことがあります後、基板・空白 (B) サンプルの SAMBs または新しい SAMB の懸濁液も用意できます (を参照してくださいセクション 4.1.1 と 4.1.2)。 SAMBs 胸の谷間バッファー (2%-10%; v/v) MPC の 1 mL 中に浮遊とチューブを置き、MPC をあらゆる方向に逆さまに回して磁気ビーズを収集します。 管を開き、胸の谷間のバッファー、チューブと蓋の両方を削除します。 MPC からチューブを削除し、SAMBs に 400-600 μ L の溶出バッファーを追加します。 ゆっくり 5 分間室温で回転子を閉じた管を回転させます。 MPC にチューブを置き、MPC を逆さま回すことによってビーズを収集します。 精製されたそのままの蛍光性基質 (溶出) を含む上清を除去し、新しい低タンパク結合遠心チューブに転送。注: 溶出液または、DRBT を使用しなくてもはっきり見える蛍光を示しています。 2 つの 0.5 mL 10 K 限外濾過装置を用いて並列バッファー交換を実行します。 限外ろ過デバイスごとに準備された溶出液 (200-300 μ L) の半分の量を測定します。 後各遠心分離のステップで希釈する最初の溶出バッファーと胸の谷間のバッファー、2 番目の限外ろ過デバイス集中溶出液それぞれ。 リカバリ後 120-200 μ L の間の同じボリュームに異なるバッファー解決集中されたサンプルを調整します。注意: 今胸の谷間バッファー解決基板のタンパク質含有量は溶出バッファー解決基板と同じです。したがって、それは蛋白質の集中を測定するために使用されるメソッドが EDTA と干渉する場合手順セクション 4.5.3 で後者の 1 つのコンテンツのタンパク質を決定するため必要ではありません。 基板のタンパク質含有量は 280 で吸光度を測定することによって溶解溶出や胸の谷間のバッファーのいずれかを決定する nm。注: 他の方法 (例えば、ブラッドフォードまたはビシンコニン酸 (BCA) の試金) もタンパク質濃度を測定する使用できますが、電気的な妨害の EDTA (溶出バッファーの現在) または蛍光性基質の吸光度は、する必要があります。見なされます。4.5.4 の手順で適用される基板の解決の最初の蛋白質内容は 0.4 から 2.0 の間にある推奨 mg/mL の校正を生成するために適切な範囲の曲線します。消散係数は、表 10を参照してください。 基板 分子の重量(ダ) 消散係数(M-1 cm-1、280 nm の水の測定) 彼の6- MBP-VSQNY * PIVQ mTurquoise2 72101.7 96845 彼の6- MBP-KARVL * AEAM mTurquoise2 72042.7 95355 彼の6- MBP-VSQNY * PIVQ mEYFP 72367.1 94325 彼の6- MBP-VSQNY * PIVQ マップル 72145.9 105200 表 10: 分子量と異なった組換え蛍光融合タンパク質基質の消散係数。 少なくとも 8 つのステップ、溶出からとそれぞれ溶出や胸の谷間のバッファーを使用して希釈では胸の谷間バッファー解決基板ソリューションからの両方の二重シリアル希釈を準備します。 黒半部マイクロ プレートに希釈の各ポイントの 30 μ L を転送します。 4.4.2 の手順で適用された設定を使用して、蛍光、蛍光を測定します。注: は、胸の谷間と溶出バッファーの基本的な蛍光を測定します。 アッセイの評価 較正曲線をプロットします。 4.5.3 のステップで決定したタンパク質のコンテンツに基づいて (4.5.4 のステップで使用される)、精製された基板ソリューション (mM) の濃度を計算します。 (胸の谷間バッファーまたは溶出バッファー) 応用希釈バッファーの基本的な RFU 値によってシリアル希釈ポイントの相対的な蛍光強度値 (RFU) を修正します。 胸の谷間- や溶出-バッファー-解決精製された基質のモル濃度に対する修正 RFU の値をプロットし、線形回帰 (力ゼロとの交点) を実行します。注: 高 R2値 (˃0.97) は、蛍光と蛍光タンパク質の濃度と良い相関を示します。この例では、回帰直線の傾きは、4.6.2 と 4.6.3 の手順で調べた範囲の分析成分濃度を評価するために使用できます。実験でエラーとデータのポイント配分は、校正の信頼性に影響を与えるしたがって、R2や傾斜角の値がデータに影響されてかどうかを確認するためにグラフィカルな評価がズームのグラフ (図 3に示す) としての助けを借りて行われます。 反作用のサンプルの C 末端蛍光胸の谷間プロダクトの量を計算します。 各 R サンプルの RFU 値と対応する B サンプルの RFU の値を修正します。 反作用のサンプルで (mM) で胸の谷間製品の濃度を計算する修正を割る胸の谷間バッファー ベースのキャリブレーションの斜面によって RFU 値曲線 (4.6.1.3 の手順を参照してください)。 反作用のサンプルに適用される基質の濃度を計算します。 基本的な溶出バッファーの RFU の値を持つ C サンプルの RFU の値を修正します。 C サンプルの上清中に (mM) の溶出の基質の濃度を計算する彼らの修正を割る溶出バッファー ベースのキャリブレーションの斜面によって RFU 値曲線 (4.6.1.3 の手順を参照してください)。 SAMB 原液次方程式に基づく 4.1.4.2 の手順で試験サンプルを作成するための (mM) で基質濃度を決定します。ここでは、 cSAMBはセクション 4.1.3; を用意して SAMB ストック溶液のモル濃度です。 cは溶出ステップ 4.6.3.3; で計算され C サンプル基板のモル濃度です。Vrはステップ 4.1.4.5 反応バッファーと 4.2.3 の手順で酵素のバッファーの追加によって作成された反応混合物のボリューム;。VSAMB C のサンプル (ステップ 4.1.4.2) SAMB 原液の量です。 SAMB 原液 (mM) で (μ L) の量に応じてステップ 4.1.4.2 である反応の各サンプル管で測定のモル濃度に基づく各 R サンプル基板のモル濃度を計算します。 データ処理を実行します。注: データの分析は、実験の目的によって異なります。ビデオは彼6- MBP VSQNY を使用して HIV 1 PR の基板依存性の速度論的研究のデータ処理の例を示します * PIVQ mTurquoise2 基板。初期速度値は胸の谷間の C 末端フラグメントの数から計算され、応用基板濃度に対してプロットされます。速度論的パラメーターは、ミカエリス-メンテン型非線形回帰分析によって決定されます。 磁気ビーズのリサイクル注: 実行後アッセイ、磁気アガロース ビーズできます収集、リサイクルします。 MPC で使用される磁気ビーズを収集し、上澄みを廃棄します。 所定の順序で次のバッファーの 1.8 ml ビーズを洗浄: 再生バッファー A (0.05% Tween 20、0.5 M NaOH)、再生バッファー B (0.05% Tween 20)、再生バッファー C (0.05% Tween 20 100 ミリメートルの EDTA、pH 8)、再生バッファー B、再生バッファー D (0.05% Tween 20 100 mM ニーソ4pH 8)、再生バッファー B、および再生バッファー E (0.5 のトゥイーン 20%、30% のエタノール、pH 7)。注: 洗濯の手順ステップ 4.1.1.4 を参照してください。 4 ° C で再生成バッファー E リサイクル ビーズに格納します。 5. ページの分析 サンプル準備メモ: Ni NTA 磁気ビーズによる分析を実行した後培養上清のアッセイはページによって分析できます。この場合、5.1.1、5.1.2 の手順をスキップします。しかし、それも興味のプロテアーゼとソリューションで消化後精製蛍光基板ソリューションおよび/または彼らの胸の谷間の断片を分析する可能です。この場合、5.1.1 の手順とプロトコルを続けます。 4.5.1 のステップに従って精製蛍光基板ソリューションを準備します。 ソリューションで消化を実行します。 1.5 mL 遠心チューブに消化されるべきサンプル 0.5 mL 10 K 限外濾過装置そして因数で胸の谷間バッファーとの溶出バッファーを交換します。注: ページの分析、我々 は検体の個々 の実験デザインによると 68 μ L の各基板、サンプル チューブの数や基板ソリューションをして、検体量を最適化できます。 酵素液をサンプルに追加します。注: ページ解析のため我々 適用 2 μ L HIV 1 PR、Bozóki ら14で説明されているが、個々 の実験デザインによるとボリュームを最適化可能性があります。胸の谷間のバッファーを使用して溶解および/または酵素を希釈することをお勧めします。 実験デザインによるとサンプルをインキュベートします。注: ページ分析、私たち培養 37 ° C、しかし、インキュベーション時間の 45 分の反応混合物と温度を実験計画に従って設定する必要があります。 5.1.3 のステップを実行することで反応を停止させます。 ページのサンプルを準備します。注: nondenaturing または変性法による蛍光基質を含むサンプルが準備ページの可能性があります。Nondenaturing または変性の条件の使用のためそれぞれ 5.1.3.1 または 5.1.3.2 の手順に従います。 Nondenatured サンプルの準備: nondenaturing サンプル読み込みバッファー (300 mM トリス、20% グリセロール、0.05% ブロモフェノール ブルー、pH 6.8) x 6 の 6 μ L で 30 μ L のサンプルをミックスします。 変性のサンプルを準備: 変化サンプル読み込みバッファー (300 mM トリス、20% グリセロール、0.05% ブロモフェノール ブルー、12% SDS 100 mM β-メルカプトエタノール、pH 6.8) x 6 の 6 μ L でサンプルの 30 μ L を混合し、95 ° c 10 分のサンプルを加熱します。 SDS ページの分析注: 必要に応じて、nondenatured (の準備ステップ 5.1.3.1) サンプルは分析するが、場合にのみネイティブ ページも実行できます。この場合、セクション 5.3 をスキップします。 SDS ポリアクリルアミドのゲル (スタッキングのゲルの分離 14% と 4% 使用) を準備し、電気泳動バッファー (2.5 mM トリス、グリシン 19.2 mM、0.01 %sds) でタンクを満たします。 ポリアクリルアミド ゲルの井戸にサンプル (5.1.3.1 または 5.1.3.2 の手順で準備) を追加し、120 V の電圧で電気泳動を実行します。 実行中のモジュールからゲル カセットを取り外し、洗浄槽にゲルを置きます。注: Nondenatured サンプル既にゲル、肉眼でもまたは、DRBT で表示されています。 ゲルの下と蛍光タンパク質の検出注: 変性サンプル (ステップ 5.1.3.2 の準備)、DRBT の蛍光タンパク質を検出するには、SDS の、ゲルからタンパク質の renature 部分的に洗浄する必要があります。 〜 100 mL の蒸留水を加えるゲル、ゲルを少なくとも 30 分間すすぎ。注: SDS の除去を改善するために水の 10 分毎を交換または 60 分をすすいでください。 DRBT を使用して、または紫外イメージングは、蛍光タンパク質を可視化します。 従来クマシー染色ゲルの 無蛍光蛋白質を視覚化する Coomassie ブリリアント ブルーの染料でゲルを染色します。