Utilisation des protéines de Fusion recombinantes dans une plate-forme de test de protéase Fluorescent et leur Renaturation en gel

1. génération des plasmides codant pour substrat expression Linéariser le plasmide d’expression – MBP-FP pDest-His6par des endonucléases de restriction PacI et NheI. Pour la génération de pDest-His6- MBP-FP, consultez Bozóki et al.14. Ajouter 1 500-2 000 µg de plasmide d’expression pDest-His6- MBP-FP, 2 µL de chaque de PacI et endonucléases de restriction NheI, 10 µL de tampon de x 10 (voir Table des matières) et de l’eau exempte de nucléase (NFW) 100 µL dans un tube de microcentrifuge. Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 1 h. Ajouter 20 µL de 6 x purple ADN colorant au mélange réactionnel de chargement et de séparer les produits de clivage par électrophorèse, gel d’agarose à 1 %. Appliquer une échelle 1 kB d’ADN en standard. Rincer le gel pendant 15 min dans 20 mL de tampon (40 mM Tris, d’acide acétique 20 mM, 1 mM EDTA, pH 8,5) de TAE contenant 20 µL de solution SYBR green et exciser la bande du plasmide linéarisé hors du gel d’agarose, avec un outil bien aiguisé.Remarque : Tout en éclairant le gel par un transilluminateur bleu foncé-lecture (DRBT), plasmide linéarisé pDest-His6- MBP-FP apparaît comme une bande discrete et lumineuse à environ 7-8 kB. Purifier le plasmide linéarisé expression de la tranche de gel en utilisant un gel extraction kit selon les instructions du fabricant. Insérez la séquence de substrat dans le plasmide linéarisé pDest-His6d’expression – MBP-FP. Recuire le vers l’avant (FWD) et les marche arrière (REV), e. coli codon optimisé amorces codant pour la séquence de substrat d’intérêt.Remarque : Les amorces recuits seront flanqués par les extrémités cohésives correspondant aux sites de clivage de l’endonucléase de restriction PacI et NheI (Figure 2). Mix 150 ng de plasmide linéarisé expression avec 200 ng de FWD et 200 ng de REV oligonucléotides amorces dans une réaction en chaîne par polymérase (PCR) 0,2 mL de tube et ajuster le volume à 17 µL en ajoutant NFW. Incuber le mélange à 65 ° C pendant 2 min et, ensuite, à 4 ° C pendant au moins 2 min. Effectuer l’insertion des amorces recuits dans le plasmide linéarisé par ligature. Ajouter 2 µL de tampon de ligase T4 (10 x) et 1 µL de ligase T4 au mélange contenant le plasmide linéarisé et les amorces de recuit. Incuber le mélange de ligature à 16 ° C pendant 16 h. Figure 2 : Amorces codant pour un clivage protéolytique du site séquence. Amorces et inverses encoder le VSQNY * séquence de site de clivage PIVQ du VIH-1 PR. Après le recuit les amorces complémentaires, l’ADN double-brin court contient les extrémités cohésives, correspondant à celle des endonucléases de restriction PacI et NheI. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Transformer 100 µL de cellules compétentes BL21 (de3) par 5 µL du mélange de la ligature et la propagation des cellules sur plaques de gélose de bouillon (LB) de lysogénie contenant l’ampicilline.Remarque : Les protéines fluorescentes seront dans le même cadre de lecture ouvert avec les balises de fusion N-terminale qu’après une ligature réussie. Quelques jours après la transformation, les colonies (contenant le plasmide d’expression codant pour le site de clivage inséré d’intérêt) montrera la fluorescence visible avec ou même sans utiliser un DRBT. Préparer le stock de glycérol des colonies dépeinte. Laver une colonie discrète dans un tube à centrifuger 50 mL contenant 5 µL de milieu LB contenant l’ampicilline (à une concentration finale de 100 µg/mL). Il incuber à 37 ° C pendant 8 h et en agitant continuellement à 220 tr/min ; puis, récolter les cellules par centrifugation à 1 000 x g pendant 5 min à température ambiante. Doucement, suspendre les cellules dans 1 mL de solution de glycérol de 80 % (diluée avec de l’eau distillée) et ajouter 500 µL de 10 mM MgCl2 solution dans la suspension. Transférer la suspension dans un tube de gel et de conserver les stocks à-70 ° C. Vérifier la séquence du plasmide généré par séquençage de l’ADN. Ajouter 10 µL du stock de glycérol (préparé à l’étape 1.7) dans 5 mL de milieu LB contenant 100 ampicilline µg/mL dans un tube à centrifuger 50 mL. Incuber la suspension à 37 ° C pendant 16 h et en agitant continuellement à 220 tr/min ; puis, récolter les cellules par centrifugation à 2 000 x g pendant 10 min à 4 ° C. Isoler le plasmide d’expression depuis le culot cellulaire par un miniprep plasmide kit (voir Table des matières) selon les instructions du fabricant et utilisez le plasmide purifié pour le séquençage de l’ADN.Remarque : pour le séquençage, 5′-GATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAG-3′ (avec impatience) et 5′-GCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGC-3′ amorces (inverse) peuvent être utilisés. 2. expression des substrats fluorescents Préparer la culture starter. Ajouter 10 µL du stock de glycérol (préparé à l’étape 1.7) dans 5 mL de milieu LB contenant 100 ampicilline µg/mL dans un tube à centrifuger 50 mL. Incuber la suspension à 37 ° C pendant 15 h et en agitant continuellement à 220 tr/mn. Transfert de la culture bactérienne (5 mL) à 50 mL de milieu LB frais contenant 100 ampicilline µg/mL dans un Erlenmeyer de 500 mL stérile. Cultiver les cellules à 37 ° C pour une absorbance de 0,6 à 0,8 à une longueur d’onde 600 nm, tout en agitant continuellement à 220 tr/mn.Remarque : Si un traitement tétracycline doit s’appliquer à l’étape 2.5, il est déconseillé de cultiver les cellules à une absorbance de plus de 0,6 à 600 nm. Ajouter isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à la concentration finale de 1 mM pour induire l’expression de la protéine. Si un traitement tétracycline n’est pas appliqué, incuber la culture pendant 3 h à 37 ° C en agitant continuellement à 220 tr/min et continuer le protocole avec étape 2.6. Si l’on applique un traitement tétracycline, continuer le protocole avec des mesures 2.5.1-2.5.3.Remarque : Certains FPs produites par les cellules d’Escherichia coli peuvent avoir un temps de maturation plus longs (voir travaux antérieurs)16,17; dans ces cas, la traduction des protéines peut être éventuellement stoppée par le traitement de la tétracycline, afin d’augmenter le rendement fluorescent de la solution de substrat. Incuber la suspension cellulaire pendant 2 h à 37 ° C en agitant continuellement à 220 tr/min ; Ensuite, ajouter une solution de tétracycline (à une concentration finale de 200 µg/mL). Incuber les cultures cellulaires selon le temps de maturation de la protéine fluorescente de choix à 37 ° C, et en agitant continuellement à 220 tr/mn. Transférer 2 x 25 mL de la culture pour nettoyer les tubes à centrifuger 50 mL et de récolter les cellules par centrifugation à 4 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et stocker les pellets de la cellule bactérienne à-70 ° C pendant au moins 1 h.Remarque : Les cellules contenant les substrats fluorescents exprimées montrent une fluorescence visible avec ou même sans utiliser un DRBT. 3. cellule perturbation Placez le culot cellulaire congelés sur la glace et laissez-le décongeler pendant 15 min. Ajouter 2 mL de tampon de lyse (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, imidazole de 10 mM, 0,05 % de Tween 20, pH 8) au culot et suspendre les cellules. Ajouter 10 µL de solution d’inhibiteur de protéase fraîchement préparés phénylméthanesulfonyle-fluorure (PMSF) (8,7 mg/mL, dissous dans l’éthanol) dans la suspension. Ajouter 2 mg de lysozyme et 20 unités de DNase à la suspension et le suspendre. Incuber la suspension sur la glace pendant 15 minutes et vortex il occasionnellement. Transfert de 2 x 1 mL de la suspension pour tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et laisser agir les suspensions pendant 3 min, en séries de 10 s de sonication et 5 s de repos. Centrifuger les tubes à 10 000 x g pendant 20 min à température ambiante ; Ensuite, retirer le surnageant fluorescent (défrichée cellule bactérienne lysat) soigneusement dans chaque tube et le transférer dans de nouveaux tubes de microcentrifuge.Remarque : Les lysats défrichées contenant le substrat fluorescent montrent une fluorescence visible avec ou même sans utiliser un DRBT et peuvent être stockés à 4 ° C pendant 2 semaines. Ne congelez pas. Défrichée lysats peuvent être utilisés directement pour la préparation de l’échantillon dans le dosage de la protéase (voir point 4.1) ou peut également être utilisé pour la purification de substrat (voir étape 4.5.1). 4. dosage de protéase perles magnétiques dotés de Ni-NTA Remarque : En raison de la flexibilité de la plate-forme de test, il peut être optimisé pour différents types d’études. Pour cette raison et à cause de la différence dans le taux d’activité des enzymes de choix, certains paramètres de l’essai (où elle est notée) ne peut pas être décrit explicitement mais doivent être optimisées les buts individuels et de la conception expérimentale. Comme une ligne directrice, les paramètres de certains types d’études sont dénotés les étapes particulières. Préparation des échantillons Génération de billes magnétiques rattaché au substrat Placer un tube de microcentrifuge fermé 2 mL basse-protéine-contraignante (voir Table des matières) contenant neuf ou recyclé (voir section 4.7) Ni-NTA magnétique d’agarose perles dans un concentrateur de particules magnétiques (MPC).Remarque : Le montant de la suspension de perle appliquée doit être définie selon le protocole expérimental. Nous avons utilisé 1 mL de solution de billes magnétiques (5 %, v/v) à chaque expérience. Perles peuvent coller à la paroi ou dans le couvercle du tube microcentrifuge ; par conséquent, renversez le MPC dans tous les sens pour s’assurer que toutes les perles sont collectés. Retirez le surnageant et jetez-le. Laver les perles de tampon de lyse. Ajouter 1,8 mL de tampon de lyse aux talons et retirez le tube fermé de la MPC. Suspendre les perles dans le tube en secouant et/ou en retournant les tubes jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement homogène. Placer le tube dans le CPP et tournez-le à l’envers pour recueillir les perles. Ouvrir le tube et éliminer le surnageant. Ajouter 1.0-1.8 mL de la défrichées lysat (préparé à l’étape 3,7) aux talons et retirer le tube du CPP. Tourner le tube fermé à l’envers jusqu’à ce que les perles sont parfaitement homogènes et tournent lentement le tube par un agitateur à température ambiante pendant 30 min. Placez-le dans la MPC et retirez la cellule défrichée lysate les perles et du couvercle.Remarque : La cellule défrichée lysate peut être mis au rebut ou enregistrée pour une utilisation ultérieure (voir la note après l’étape 3,7). Ajouter 1 % Tween 20 (pH 7) à billes magnétiques (Samb) rattaché au substrat.NOTE : Samb montre une fluorescence visible avec ou même sans utiliser un DRBT. Lavage de la Samb Placer le tube avec la suspension SAMB dans la MPC et éliminer le surnageant. Laver le Samb 3 fois avec chaque tampon : i) 1.8 mL de 1 % Tween 20 (pH 7) ; II) 1,8 mL de tampon de lavage (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, imidazole de 5 mM, 0,05 % de Tween 20, pH 7) ; III) 1,8 mL de tampon de clivage (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 0,05 % de Tween 20, pH 7).Remarque : Pour la procédure de nettoyage, consultez l’étape 4.1.1.4. Le tampon de clivage peut-être être modifié selon les besoins expérimentaux, mais il est recommandé de consulter le manuel de billes magnétiques Ni-NTA pour déterminer la compatibilité. Préparation de la solution mère SAMB Ajouter un tampon de clivage à la Samb lavées pour créer une solution stock SAMB.Remarque : Après l’ajout de la mémoire tampon, ne pas secouer ou tournez le tube à l’envers. Le volume de la mémoire tampon de clivage dépend de la conception expérimentale individuelle et doit être calculé sur la base du nombre de billes magnétiques (voir étape 4.1.1.1) et sur les volumes à utiliser à l’étape 4.1.4.2. Tubes de 2 mL, le volume appliqué est jusqu’à 1 900 µL (voir tableau 1). La densité des billes magnétiques recommandée de la solution mère SAMB est 2-10 % (v/v). Type d’étude Volume de tampon de clivage (µL) S-dépendante des mesures (Fig 4) 1600 Mesures de temps (fig. 5 a) 1600 Étude de l’inhibition (Fig 5 b) 1900 étude de dépendance à l’égard de pH (Fig 6) 1400 Tableau 1 : Volume de la mémoire tampon de clivage utilisé pour préparer la solution SAMB dans les différents types de mesures. Enlever le tube fermé du CPP. Utiliser la solution-mère SAMB immédiatement ou conserver à 4 ° C pendant 24 h. Génération de l’essai des échantillons à l’aide de la solution mère SAMBRemarque : Les détails de cette partie de l’essai sont fortement dépendantes de la conception expérimentale individuelle (exemples types sont indiqués dans le tableau 2). Type d’échantillon Notes Exemple de réaction (R) -utilisé pour l’évaluation des propriétés de clivage-contient l’enzyme et le substrat dans un tampon de clivage Échantillon témoin de substrat (B) -utilisé pour évaluer la dissociation spontanée de substrat (voir étape 4.6.2)-contient seulement le substrat dans un tampon de clivage Exemple de contrôle de substrat (C) -pour la concentration de substrat de déterminer (voir étape 4.6.3)-contient seulement le substrat dans un tampon d’élution Tableau 2 : Types d’échantillons de l’essai de protéase magnétique-perle à base de Ni-NTA. Préparer 2 mL de tubes de microcentrifuge basse-protéine compromettante pour l’essai des échantillons.Remarque : Autre hypoprotidique contraignant de marchandises en plastique peut également être utilisé. Tubes fond rond ou plat permet d’assurer la libre circulation des Samb. Voir le nombre recommandé de tubes dans le tableau 3. Type d’étude R B C S-dépendante des mesures (Fig 4) 5 5 2 Mesures de temps (fig. 5 a) 6 6 2 Étude de l’inhibition (Fig 5 b) 7 7 1 étude de dépendance à l’égard de pH (Fig 6) 5 5 1 Tableau 3 : Nombre de tubes de microcentrifuge requis 2 mL pour chaque type d’échantillon dans les études démontrées. Suspendre la solution SAMB jusqu’à homogénéité et transférer la quantité de substrat doit être analysé dans les réactions immédiatement dans les flacons d’échantillon. Le volume recommandé est de 25 à 300 µL, mais il doit être réglé selon le protocole expérimental individuel (tableau 4).Remarque : Vérifiez si tous les Samb ont été mesurées dans le fond des tubes. Samb peut coller à la paroi de la trompe, qui peut fausser les résultats de titrage. Si différents volumes doivent être mesurés de façon séquentielle, démarrez aliquotage avec le plus grand volume et tenter de réduire au minimum le changement des pipettes ou des pointes de pipette. Type d’étude R B C S-dépendante des mesures (Fig 4) 25 – 50 – 100 – 150 – 250 25 – 50 – 100 – 150 – 250 25 Mesures de temps (fig. 5 a) 25 25 25 Étude de l’inhibition (Fig 5 b) 120 120 120 étude de dépendance à l’égard de pH (Fig 6) 100 100 100 Tableau 4 : Volume de la solution SAMB mesuré dans les flacons d’échantillon de chaque type d’échantillon dans les études démontrées. Placer les tubes échantillon contenant la suspension SAMB aliquotée dans la MPC et déplacer légèrement le MPC en arrière. Retirez délicatement le surnageant de la Samb et jetez-le. Retirer les tubes du CPP et ajouter le volume calculé du tampon (buffer [100 mM EDTA, 0,05 % de Tween 20, pH 7] clivage ou d’élution) de la réaction soigneusement à la Samb.Remarque : Calculer le volume de tampon selon le protocole expérimental individuel (tableau 5). Pour tubes de 2 mL, le volume final conseillé du mélange réactionnel (le volume de la mémoire tampon de réaction à ajouter dans cette étape + le volume de la solution d’être ajouté à l’étape 4.2.3) est de 50-150 µL. s’assurer que tous les Samb sont lavés dans le tampon supplémentaire. Tampon d’élution est utilisé au lieu de clivage tampon non contrôlé dans les cas d’échantillons de contrôle (C) de substrat. Pour une étude de l’inhibition, l’inhibiteur de choix est recommandé d’ajouter à cette étape. Type d’étude Volume de la mémoire tampon de réaction (µL) S-dépendante des mesures (Fig 4) 68 µL de tampon de clivage Mesures de temps (fig. 5 a) 68 µL de tampon de clivage Étude de l’inhibition (Fig 5 b) Stock de 67,3 µL de tampon de clivage + inhibiteur de 0.7 µL solution * étude de dépendance à l’égard de pH (Fig 6) Clivage de 69,5 µL tampon ** Tableau 5 : Volume de tampon de réaction dans les études démontrées. * L’amprénavir a été résolu en diméthylsulfoxyde ; les solutions mères amprénavir (allant de 1 nM à des concentrations de 1 µM) ont été appliquées pour l’étude de l’inhibiteur (voir Figure 5 b). ** Le pH de la mémoire tampon de clivage appliquées varie de pH 6.0-8,5. Fermer les couvercles des tubes. Maintenant, les échantillons sont prêts pour le dosage.Remarque : Les échantillons peuvent être conservés à 4 ° C pendant 24 h, mais le stockage ne s’applique que si la solution SAMB a été utilisée immédiatement après la préparation (voir étape 4.1.3.2). Initiation des réactions protéolytiques Préparer la solution d’enzyme protéolytique selon les besoins expérimentaux.Remarque : Il est recommandé d’utiliser un tampon de clivage pour dissoudre ou diluer l’enzyme. Protocoles de purification de HIV-114 et TEV PRs18 ont été publiés précédemment. La valeur de la thermoshaker taux d’agitation (600 tr/min) et température d’incubation (tableau 6). Type d’étude Température d’incubation (° C) S-dépendante des mesures (Fig 4) 37 Mesures de temps (fig. 5 a) 37 Étude de l’inhibition (Fig 5 b) 37 étude de dépendance à l’égard de pH (Fig 6) 30 Tableau 6 : les températures d’Incubation appliquées dans l’étude de différents types. Pour le VIH-1 PR, 37 ° C est recommandée, alors que 30 ° C est recommandé pour le TEV PR. Ajouter la solution d’enzyme pour les échantillons de réaction pour l’initialisation des réactions protéolytiques.Remarque : Dans le cas des exemples C et substrat blanc (B), ajouter clivage buffer (tampon enzymatique) et élution, respectivement. Le volume est calculé selon les besoins individuels et expérimentales (tableau 7). Pour tubes de 2 mL, le volume final conseillé du mélange réactionnel (le volume de la mémoire tampon de réaction ajoutée à l’étape 4.1.4.5 + le volume de la solution pour être ajouté à cette étape) est de 50-150 µL. Type d’étude Volume de l’enzyme solution/enzyme / l’élution de la mémoire tampon tampon (µL) S-dépendante des mesures (Fig 4) 2 Mesures de temps (fig. 5 a) 2 Étude de l’inhibition (Fig 5 b) 2 étude de dépendance à l’égard de pH (Fig 6) 0,5 Tableau 7 : Volume du tampon tampon/élution solution/enzyme enzyme ajouté lors de l’initialisation de l’essai des échantillons dans le cas des études démontrées. Attiser les perles soigneusement en déplaçant doucement les tubes et placer les tubes immédiatement dans le thermoshaker déjà secouer.NOTE : Résiliation manuelle échantillon (voir la section 4.3) prend plus de temps que l’initiation ; par conséquent, un retard enregistré d’au moins 2 min est recommandé entre les initiations des réactions. Incuber les échantillons selon le protocole expérimental (tableau 8). Type d’étude D’incubation temps (min) Mesures axées sur le S (fig. 4 a) 7 Mesures axées sur le S (fig. 4 b) 120 Mesures de temps (fig. 5 a) 0-2,5-5 – 10 – 15 – 20 Étude de l’inhibition (Fig 5 b) 10 étude de dépendance à l’égard de pH (Fig 6) 60 Tableau 8 : Temps d’Incubation appliqués à l’essai des échantillons dans les différentes mesures. Termination des réactions protéolytiques Prendre l’échantillon de l’agitateur, 30 s avant la fin de l’incubation et faire tourner rapidement. Placer le tube sur le CPP, laissez reposer pendant 15 s, et déplacer légèrement le MPC en arrière. Ouvrez le couvercle et transférer le surnageant soigneusement sur une plaque ou un nouveau tube.Remarque : Ne pas toucher les billes concentrés avec l’embout de la pipette. Le liquide surnageant collecté des échantillons de C et R avec un degré élevé de clivage peut-être présenter une fluorescence visible avec ou même sans l’aide d’un DRBT. Détection par fluorescence Transférer 2 x 30 µL de surnageants échantillon séparé dans une microplaque de moitié-zone noire. Mesurer la fluorescence en utilisant les filtres appropriés d’excitation et d’émission.Remarque : Mesurer la fluorescence de base du tampon de clivage et tampon d’élution, aussi bien. Nécessité de combinaisons filtre à choisir basée sur la protéine fluorescente mesurée (tableau 9). Protéine fluorescente Filtres d’excitation (nm) Filtres d’émission (nm) mTurqiouse2 355/40 460/25 mEYFP 544/15 590/10 mApple 544/15 590/10 Tableau 9 : Filtres d’Excitation et d’émission utilisés pour détecter les différentes protéines fluorescentes. CalibrationNOTE : Pour générer des courbes d’étalonnage à l’étape 4.6.1, les valeurs d’intensité de fluorescence du clivage – ou d’élution-tampon-résolu des substrats purifiées, à différentes concentrations besoin à mesurer. Purifier les substrats fluorescents.Remarque : Pour la purification, Samb substrat blancs (B) des échantillons d’après que l’essai de la protéase peut-être être collecté ou un nouveau SAMB suspension peut aussi être préparée (voir les sections 4.1.1 et 4.1.2). Placer un tube avec Samb en suspension dans 1 mL de tampon de clivage (2-10 % ; v/v) à la MPC et collecter les billes magnétiques en retournant le MPC dans toutes les directions. Ouvrir le tube et retirer le tampon de clivage, le tube et le couvercle. Enlever le tube du CPP et ajouter 400-600 µL de tampon d’élution de la Samb. Tournez lentement le tube fermé avec une coiffe à température ambiante pendant 5 min. Placer le tube sur la MPC et collecter les perles en retournant le MPC. Retirez le surnageant contenant du substrat fluorescent intact purifié (éluat) et transférez-le dans un nouveau tube de microcentrifuge basse–la liaison aux protéines.NOTE : Éluat montre une fluorescence visible avec ou même sans utiliser un DRBT. Procéder à l’échange de la mémoire tampon parallèle à l’aide de deux dispositifs d’ultrafiltration 0,5 mL 10K. Mesurer le volume de la moitié de l’éluat préparé (200-300 µL) dans chaque unité d’ultrafiltration. Après à chaque étape de centrifugation, diluer l’éluat concentré dans le premier et les deuxième dispositifs ultrafiltration par élution buffer et clivage, respectivement. Après la récupération, ajuster les échantillons concentrés résolus dans les tampons différents sur le même volume, entre 120-200 µL.NOTE : Maintenant la teneur en protéines du substrat tampon-résolu clivage est identique au substrat résolu-tampon d’élution ; par conséquent, il n’est pas nécessaire de déterminer la teneur de celui-ci à l’étape 4.5.3, en protéines si la méthode utilisée pour mesurer la concentration de protéines interfère avec l’EDTA. Déterminer la teneur en protéines des substrats dissous soit dans un tampon d’élution ou clivage en mesurant l’absorbance à 280 nm.Remarque : Autres méthodes (par exemple, Bradford bicinchoninic acide (BCA) essais ou) peuvent également servir à mesurer la concentration de protéines, mais des interférences possibles avec l’EDTA (présent dans la mémoire tampon d’élution) ou avec l’absorbance du substrat fluorescent doivent être considéré. La teneur en protéines initiale de la solution de substrat à appliquer à l’étape 4.5.4 est recommandée d’être entre 0,4 et 2,0 mg/mL afin de générer un étalonnage courbe dans une gamme appropriée. Voir le tableau 10 pour les coefficients d’extinction. Substrat Poids moléculaire(Da) Coefficient d’extinction(Cm-1 M-1, à 280 nm mesurés dans l’eau) Son6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 72101.7 96845 Son6- MBP-KARVL * AEAM-mTurquoise2 72042.7 95355 Son6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP 72367.1 94325 Son6- MBP-VSQNY * PIVQ-mApple 72145.9 105200 Tableau 10 : poids moléculaires et les coefficients d’extinction des substrats différents recombinant fusion fluorescent protein. Préparer une dilution en série double au moins huit étapes, tant de l’élution – les solutions de substrat clivage-tampon-résolu, à l’aide d’élution ou tampon de clivage pour la dilution, respectivement. Transférer 30 µL de chaque dilution point à une microplaque de moitié-zone noire. Mesurer la fluorescence avec un fluorimètre, à l’aide du paramètre est appliqué à l’étape 4.4.2.Remarque : Mesurer la fluorescence base du clivage et la mémoire tampon d’élution. Évaluation de l’essai Tracer les courbes d’étalonnage. Calculer la concentration (en mM) des solutions substrat purifiée (utilisé à l’étape 4.5.4), basée sur la teneur en protéines déterminée à l’étape 4.5.3. Corriger les valeurs d’intensité de fluorescence relative (RFU) les points de dilution en série par les valeurs fondamentales de la RFU de la mémoire tampon de dilution appliquée (le tampon de clivage ou la mémoire tampon d’élution). Tracer les valeurs corrigées de la RFU contre la concentration molaire des substrats purifiées clivage – ou d’élution-tampon-résolu et effectuer une régression linéaire (force de l’ordonnée à l’origine à zéro).NOTE : Une valeur élevée de2 R (˃0.97) indique une bonne corrélation linéaire entre la fluorescence et la concentration de la protéine fluorescente. Dans ce cas, la pente de la courbe de régression peut servir à évaluer la concentration des composants dosage dans la gamme examinée lors des étapes 4.6.2 et 4.6.3. Distribution de point les erreurs et les données expérimentale peut-être influer sur la fiabilité de l’étalonnage ; ainsi, une évaluation graphique peut être effectuée à l’aide du zoom en graphiques (comme illustré à la Figure 3), afin de vérifier si R2 et les valeurs de pente sont influencées par les données. Calculer la quantité de produit de clivage fluorescent C-terminale dans les échantillons de réaction. Corrigez les valeurs de la RFU de chaque échantillon R avec les valeurs de la RFU de l’échantillon B correspondant. Calculer la concentration de produit de clivage (en mM) dans les échantillons de réaction en divisant le corrigé valeurs RFU par la pente de l’étalonnage de clivage-tampon-base courbe (voir étape 4.6.1.3). Calculer la concentration de substrat appliquée dans les échantillons de réaction. Corrigez les valeurs de la RFU de l’échantillon C avec la valeur de la RFU de la mémoire tampon d’élution de base. Calculer la concentration du substrat éluée (en mM) dans le cas de l’exemple C en divisant leur corrigé valeurs RFU par la pente de l’étalonnage d’élution-tampon-base courbe (voir étape 4.6.1.3). Déterminer la concentration du substrat (en mM) de la solution mère de SAMB, utilisée pour la création de l’essai des échantillons à l’étape 4.1.4.2, basé sur l’équation suivante :Ici, cSAMB est la concentration molaire de la solution mère de SAMB, préparée à la section 4.1.3 ; cC est la concentration molaire du substrat éluée dans l’échantillon C calculé à l’étape 4.6.3.3 ; Vr est le volume du mélange réactionnel créé par l’ajout du buffer de réaction à l’étape 4.1.4.5 et l’enzyme à l’étape 4.2.3. ; et VSAMB est le volume de la solution de l’échantillon C (étape 4.1.4.2) SAMB. Calculer la concentration molaire des substrats dans chaque échantillon de R basée sur la concentration molaire de la SAMB solution mère (en mM) selon le volume (en µL) mesurée dans chaque tube à essais réaction au palier 4.1.4.2. Exécuter le traitement de données.Remarque : L’analyse des données dépend de l’objectif de l’expérience. La vidéo montre un exemple pour le traitement des données d’une étude cinétique de substrat dépendant sur le VIH-1 PR à l’aide de son6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrat. Les valeurs de la vitesse initiale sont calculés à partir de fragments de clivage C-terminal et sont tracées contre la concentration du substrat appliquée. Les paramètres cinétiques sont déterminés par une analyse de régression non linéaire de Michaelis-Menten. Recyclage des billes magnétiquesNOTE : Après avoir effectué un essai, les perles magnétiques d’agarose peuvent être collectées et recyclées. Recueillir les billes magnétiques utilisés avec le MPC et éliminer le surnageant. Laver les billes avec 1,8 mL des tampons suivants, dans l’ordre indiqué : tampons de régénération A (0,05 % Tween 20, 0,5 M NaOH), tampon de régénération B (0,05 % Tween 20), tampon de régénération C (0,05 % de Tween 20, 100 mM EDTA, pH 8), tampon B de la régénération, la régénération tampon D ( 0,05 % de Tween 20, 100 mM NiSO4, pH 8), buffer B de la régénération et la régénération E (0,5 % de Tween 20, 30 % éthanol, pH 7).Remarque : Pour la procédure de nettoyage, consultez l’étape 4.1.1.4. Stocker les perles recyclées dans un tampon de régénération E à 4 ° C. 5. analyse de la PAGE Préparation des échantillonsRemarque : Après avoir effectué le test de billes magnétiques dotés de Ni-NTA, les surnageants de dosage peuvent être analysés par PAGE. Dans ce cas, ignorez les étapes 5.1.1 et 5.1.2. Cependant, il est également possible d’analyser la solution purifiée de substrats fluorescents et/ou de leurs fragments de clivage après digestion solution avec la protéase d’intérêt. Dans ce cas, continuer le protocole avec étape 5.1.1. Préparer la solution de substrat fluorescent purifiée selon étape 4.5.1. Effectuer la digestion en solution. L’échange tampon d’élution avec tampon de clivage dans le dispositif de l’ultrafiltration de 0,5 mL 10K et l’aliquote les échantillons pour être digéré dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL.Remarque : pour l’analyse de PAGE, nous aliquotés 68 µL de chaque substrat, mais le nombre de tubes d’échantillons et le volume de solution de substrat d’être aliquotés peut être optimisée selon le protocole expérimental individuel. Ajouter la solution enzymatique aux échantillons.Remarque : Pour l’analyse de PAGE, nous avons appliqué 2 µL de VIH-1 PR, préparé comme indiqué par Bozóki et coll.14, mais le volume peut être optimisé selon le protocole expérimental individuel. Il est recommandé d’utiliser le tampon de clivage à dissoudre ou diluer l’enzyme. Incuber les échantillons selon le protocole expérimental.Remarque : Pour l’analyse de PAGE, nous avons incubé le mélange réactionnel pendant 45 min à 37 ° C, mais le temps d’incubation et la température doivent être définis selon le protocole expérimental. Mettre fin à la réaction en effectuant l’étape 5.1.3. Préparation des échantillons pour la PAGE.Remarque : Les échantillons contenant du substrat fluorescent peuvent être préparés pour la PAGE par un non dénaturant ou par une méthode de dénaturation. Pour l’utilisation des conditions non dénaturantes ou dénaturation, suivez l’étape 5.1.3.1 ou 5.1.3.2, respectivement. Préparer un échantillon nondenatured : mélanger 30 µL de l’échantillon avec 6 µL de 6 x tampon de chargement d’échantillon non dénaturant (300 mM Tris, 20 % de glycérol, 0.05 % bromophénol bleu, pH 6,8). Préparer un échantillon dénaturé : mélanger 30 µL de l’échantillon avec 6 µL de 6 x dénaturation tampon échantillon-chargement (300 mM Tris, 20 % de glycérol, 0.05 %, 100 mM bleu de bromophénol 12 % SDS, β-mercaptoéthanol, pH 6,8) et chauffer les échantillons à 95 ° C pendant 10 min. Analyse de SDS-PAGERemarque : En option, si seulement les échantillons de nondenatured (document établi en étape 5.1.3.1) doivent être analysés, une PAGE native aussi est possible. Dans ce cas, ignorez la section 5.3. Préparer un gel SDS-polyacrylamide (gel de concentration d’utilisation 14 % séparant et 4 %) et remplissez le réservoir avec le tampon d’électrophorèse (2,5 mM Tris, glycine 19,2 mM, SDS de 0,01 %). Ajouter les échantillons (préparés à l’étape 5.1.3.1 ou 5.1.3.2) sur les puits d’un gel de polyacrylamide et effectuer l’électrophorèse à 120 V tension. Retirez la cassette de gel du module en cours d’exécution et placer le gel dans une cuve de lavage.Remarque : Nondenatured échantillons sont déjà visibles dans le gel, même à l’oeil nu ou avec un DRBT. Détection de protéines fluorescentes et renaturation en gelNOTE : Pour détecter les protéines fluorescentes dans les échantillons dénaturés (préparés à l’étape 5.1.3.2) sur la DRBT, SDS doit être emportés par le gel, partiellement renaturaliser les protéines. Ajouter environ 100 mL d’eau distillée au gel et de rincer le gel au moins pendant 30 min.Remarque : Pour améliorer l’élimination du SDS, remplacez l’eau toutes les 10 min, ou rincer jusqu’à 60 min. Visualiser les protéines fluorescentes en utilisant un DRBT, ou par imagerie UV. Coloration de Coomassie conventionnelle du gel Souillez le gel avec le colorant bleu de Coomassie brillant bleu pour visualiser les protéines fluorescentes.