Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Be&#225;ta Boz&#243;ki; J&#225;nos  Andr&#225;s M&#243;ty&#225;n; M&#225;ri&#243; Miczi; L&#237;via  Di&#225;na Gazda; J&#243;zsef T&#337;zs&#233;r

doi:10.3791/58824

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochemistry

Gebruik van recombinante Fusion eiwitten in een fluorescerende Protease Assay Platform en hun In-gel renaturatie

Published: January 16, 2019

doi:

10.3791/58824

Beáta Bozóki*^1,2, János András Mótyán*¹, Márió Miczi¹, Lívia Diána Gazda¹, József Tőzsér¹

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine,University of Debrecen, ²Biotechnology Research Department,Gedeon Richter Plc

Summary

Hier presenteren we de gedetailleerde procedure van een onlangs ontwikkelde protease assay platform met behulp van N-terminal hexahistidine/maltose-bindend-proteïne en fluorescente proteïne-gesmolten recombinante substraten gekoppeld aan het oppervlak van nikkel-nitrilotriacetic zure magnetische agarose kralen. Een latere in-gel-analyse van de monsters van de assay gescheiden door elektroforese van het gel van natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide is ook gepresenteerd.

Abstract

Proteasen zijn intensief bestudeerde enzymen als gevolg van hun essentiële rol in verschillende biologische trajecten van levende organismen en pathogenese; zij zijn dus belangrijk drug targets. We hebben een magnetische agarose-kraal-gebaseerde assay platform ontwikkeld voor het onderzoek van proteolytic activiteit, die is gebaseerd op het gebruik van recombinante fusion eiwit substraten. Om aan te tonen het gebruik van dit systeem assay, wordt een protocol gepresenteerd op het voorbeeld van humaan immunodeficiëntie virustype 1 (HIV-1) protease. Het geïntroduceerde assay-platform kan efficiënt worden gebruikt in de Biochemische karakterisering van proteasen, met inbegrip van enzym activiteit metingen in mutagenese, kinetic, remming of specificiteit studies, en het mogelijk geschikt voor high-throughput substraat screening of kan worden aangepast aan andere Proteolytische enzymen.

In deze bepaling-systeem, de toegepaste substraten bevatten N-terminal hexahistidine (zijn₆) en maltose-bindende eiwit (MBP) tags, decollete sites over tabak etch virus (TEV) en HIV-1 proteasen en een fluorescente proteïne C-terminal. De substraten kunnen worden efficiënt geproduceerd in Escherichia coli cellen en gemakkelijk gezuiverd met behulp van nikkel (Ni) – chelate – gecoate kralen. Tijdens de test leidt het Proteolytische splijten van substraten kraal-ingeschrevenen tot de vrijlating van fluorescerende decollete fragmenten, die kan worden gemeten door fluorimetrie. Bovendien kunnen decollete reacties worden geanalyseerd door natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-pagina). Een protocol voor de renaturatie in-gel van assay componenten wordt ook beschreven, zoals gedeeltelijke renaturatie van fluorescente proteïnen in staat hun detectie op basis van het molecuulgewicht en fluorescentie stelt.

Introduction

Proteolytische enzymen behoren tot de meest intensief onderzochte enzym groepen vanwege hun belang in de metabolische banen en industriële toepassingen, evenals. Hun sleutelrol in virale ziekten, de regulering van bloed stremmen, kanker, en cardiovasculaire en neurodegeneratieve ziekten maakt proteasen prominente doelstellingen op het gebied van Geneesmiddelenontwikkeling. De gedetailleerde karakterisering van substraat specificiteit en profileren van de Inhibitor van de omwenteling van het protease (PR) van belang is dus cruciaal en wordt bij voorkeur uitgevoerd door snelle kosten-efficiënte en robuuste biochemische tests¹^,²^, ³.

Tegenwoordig, de overgrote meerderheid van in vitro protease tests toegepast op het gebied van drugontdekking voor samengestelde profielen zijn homogene, fluorescerend peptide gebaseerde, en high-throughput screening (HTS)-compatibele platforms⁴. Bovendien, gelabelde peptiden zijn niet alleen geschikt voor bibliotheek screening, maar ze bieden ook geweldige hulpmiddelen voor de bepaling van enzym kinetische parameters op de geselecteerde substraten. In andere gevallen, wanneer etikettering van het substraat niet mogelijk is, kunnen de scheiding gebaseerde tests een mogelijke oplossing om te beoordelen van de kinetische eigenschappen van Proteolytische reacties³bepalen.

In het algemeen, in vitro protease testen zijn gebaseerd op het gebruik van twee soorten substraat: korte peptides of hele eiwitten. In die gevallen, waar de splitsing van korte peptide reeksen reflecteren de splitsingsproducten eigenschappen voldoende, gelden de volgende standaard benaderingen: (i) onderzoek van substraten van de standaard eiwitten zoals geoxideerde insuline B-keten, (ii) testen verkrijgbare substraten voor andere proteasen, (iii) synthetische en fluorescently geëtiketteerde peptide bibliotheken gemaakt door combinatoriële chemie of (iv) screenen met behulp van genetische methoden, bijvoorbeeld de biologische weergeven technologieën⁵^, ⁶. Naast de conventionele indeling, andere nieuwe platforms zijn ook beschikbaar voor substraat generatie (bijvoorbeeld de vorming van Proteoom afkomstige peptide bibliotheken⁷ of speciale subtypen van genetische methoden, zoals de recombinante fusie op basis van eiwitten substraten⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²).

Alle bovengenoemde substraat typen en testen hebben hun eigen voordelen en beperkingen, en de ontwikkeling van assay formaten combineren en/of verbetering van de voordelen van de bekende platformen is nog steeds in de vraag. Hier beschrijven we een protocol voor een scheiding gebaseerde fluorescerende protease-assay, die gebruik maakt van recombinante substraten. Deze fusie-eiwitten bestaan uit zijn₆ en MBP tags gesmolten tot een controle breukzijde van TEV PR, die wordt gevolgd door de opeenvolging van de ondergrond van belang die rechtstreeks is verbonden met een C-terminal fluorescente proteïne (FP) (figuur 1A). Het klonen van een DNA-sequentie codeert voor een breukzijde van belang in het ‘klonen ‘cassette kan worden uitgevoerd door een enkele afbinding reactie in de plasmide van expressie, die heeft zijn gelineariseerde eerder door beperkingsendonucleases.

Figuur 1: Beginsel van de fluorescerende protease-assay. (A) de schematische weergave van een fluorescerende substraat en haar decolleté door humaan immunodeficiëntie virustype 1 (HIV-1) protease wordt weergegeven. De pijl geeft de positie van de splitsing binnen de matrix/Eiwitmantel decollete site volgorde van HIV-1 protease (VSQNY * PIVQ). (B) de fluorescerende ondergronden kunnen worden gebruikt voor het analyseren van enzym reacties door de Ni-NTA magnetische-kraal-gebaseerde bepaling en polyacrylamide gelelektroforese, evenals, in het workflow diagram wordt weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Hoewel Proteolytische testen met behulp van soortgelijke recombinant eiwit substraten-met een tag affiniteit, een Proteolytische breukzijde en een fluorescente proteïne-have al beschreven⁸^,⁹^,¹⁰, het systeem gepresenteerd Hier voornemens is te integreren en te verbeteren op de voordelen van deze methoden. Een belangrijk verschil is dat de fusie-eiwit substraten in dit assay-platform zijn uitgerust met MBP te verbeteren eiwit oplosbaarheid¹³ en bevatten de breukzijde van een besturingselement voor TEV PRs. Voorts bevatten de substraten nieuwe generatie TL eiwitten, die zijn zeer stabiel en hebben een monomere vorm om te voorkomen dat substraat aggregatie. Naast de eerder gepubliceerde toepassing van mTurquoise2 – en mApple-gesmolten formulieren¹⁴laten hier ook we resultaten gegeven door het gebruik van recombinante substraat met een monomeer verbeterd fluorescerende label geel fluorescerende eiwit (mEYFP). Hierbij we aantonen dat de verenigbaarheid van het systeem met andere fluorescente proteïnen en sommige algemene soorten resultaten die kunnen worden verkregen door de protease-assay vertegenwoordigen.

De recombinante fusie-eiwitten zijn uitgedrukt in E. coli BL21(DE3) cellen en worden gebruikt als drager voor de assay in een nikkel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA)-magnetische-agarose-kraal-ingeschrevenen vorm bekleed. De C-terminal splitsingsproducten zijn bevrijd van het oppervlak van de parel in het supernatant op splitsing door de protease van belang. Na de scheiding van de bovendrijvende substantie (met het enzym en de splitsingsproducten) van de magnetische kralen, kan de fluorescentie worden gemeten om de eigenschappen van de splitsing van het enzym te bepalen. In tegenstelling tot de eerder beschreven methoden, zijn in het systeem hier, voorgesteld de bedragen van substraat en C-terminal DISSOCIATIEPRODUCTEN daarvan uniek gekwantificeerd op basis van een gedetailleerde substraat kalibratieprocedure. De assay-systeem kan worden ondersteund door een analyse van de SDS-pagina van de assay monsters; een latere tl in-gel visualisatie kan onmiddellijk na de elektroforese of na de in-gel-renaturatie van de nondenatured en gedenatureerde fluorescerende onderdelen, respectievelijk¹⁴worden toegepast.

De flexibiliteit en de structuur van de ‘klonen cassette’ toestaan een tijd – en kosten-efficiënte invoeging van een breed scala van sequenties in de constructie en, dus, bevordert de generatie van substraat bibliotheken. Aangezien alle assay stappen automatisering en HTS-compatibel met zijn kunnen het systeem vooral aantrekkelijk voor, bijvoorbeeld, protease specificiteit metingen en mutagenese studies, of het kan ook worden effectief gebruikt voor industriële protease inhibitor screening en/of antivirale Geneesmiddelenontwikkeling, als goed.

Enzym kinetische parameters (k_kat, K_m) kunnen worden bepaald door de ontwikkelde scheiding gebaseerde bepaling; het kan dus geschikt individuele enzym kinetische metingen, zoals het tijdsverloop, afhankelijk van de ondergrond en remming studies uit te voeren. Dit bewijst dat de fusie van recombinante eiwitten substraten goede alternatieven voor de vaak gebruikte synthetische oligopeptide substraten bieden, en vanwege hun hoge gelijkenis met de polyprotein substraten, zij vertegenwoordigen de natuurlijk voorkomende enzym-substraat-interacties nauwkeuriger.

Protocol

1. generatie van de expressie substraat-codering plasmiden De pDest zijn6- MBP-FP expressie plasmide Linearize door beperkingsendonucleases PacI en NheI. Zie voor de generatie van pDest-zijn6- MBP-FP, Bozóki et al.14. Voeg 1.500-2.000 µg pDest-zijn6- MBP-FP expressie plasmide, 2 µL van PacI en NheI beperkingsendonucleases, 10 µL van 10 x buffer (Zie Tabel of Materials), en nuclease-gratis water (NFW) 100 µL in een microcentrifuge buis. Incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C gedurende 1 uur. Voeg 20 µL van 6 x DNA paars laden kleurstof om het reactiemengsel en scheiden de splitsingsproducten door elektroforese, met behulp van 1% agarose gel. Een 1 kB DNA-ladder als standaard toepassen. Spoel de gel gedurende 15 min. in 20 mL TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM azijnzuur, 1 mM EDTA, pH 8,5) met 20 µL van SYBR groene oplossing en accijnzen van de band van de gelineariseerde plasmide uit de agarose gel, scherp gereedschap.Opmerking: Tijdens het verlichten van de gel door een donker-lezing blauwe transilluminator (DRBT), de gelineariseerde pDest-zijn6- MBP-FP plasmide wordt weergegeven als een discrete en heldere band bij ongeveer 7-8 kB. Het plasmide gelineariseerde expressie van het gel-segment zuiveren met behulp van een gel extractie kit volgens de instructies van de fabrikant. De volgorde van het substraat in het gelineariseerde pDest-zijn6- MBP-FP expressie plasmide invoegen. Ontharden de voorwaarts (FWD) en de omgekeerde (REV) E. coli codon-geoptimaliseerde oligonucleotide inleidingen codering voor de substraat opeenvolging van belang.Opmerking: De ontharde inleidingen zal worden geflankeerd door de samenhangende uiteinden overeenkomt met PacI en NheI beperking endonuclease decollete sites (Figuur 2). Mix 150 ng van gelineariseerde expressie plasmide met 200 ng van FWD en 200 ng van REV oligonucleotide inleidingen in een 0,2 mL polymerase-kettingreactie (PCR) buis en pas het volume aan 17 µL door NFW toe te voegen. Laat het mengsel bij 65 ° C gedurende 2 min en, vervolgens, bij 4 ° C gedurende ten minste 2 minuten inwerken. Het inbrengen van de ontharde inleidingen in de gelineariseerde plasmide afbinding uitvoeren. 2 µL van T4 ligase buffer (10 x) en 1 µL van T4 ligase toevoegen aan het mengsel met de gelineariseerde plasmide en de ontharde inleidingen. Incubeer de afbinding mengsel bij 16 ° C voor 16 h. Figuur 2 : Oligonucleotide inleidingen codering voor een Proteolytische decolleté site volgorde. Voorwaartse en omgekeerde inleidingen coderen de VSQNY * PIVQ decollete site opeenvolging van HIV-1 PR. Na gloeien de complementaire oligonucleotide inleidingen, bevat de korte double-stranded DNA sticky ends, overeenkomt met die van beperkingsendonucleases PacI en NheI. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Transformeren 100 µL BL21(DE3) bevoegde cellen door 5 µL van afbinding mengsel en de verspreiding van de cellen op lysogenie Bouillon (LB) agar platen met ampicilline.Opmerking: De fluorescerende eiwitten worden in hetzelfde open lezing frame met de N-terminale fusion tags pas na een succesvolle afbinding. Een paar dagen na de transformatie, zal de koloniën (met het expressie-plasmide codering voor de ingevoegde breukzijde van belang) tonen zichtbaar fluorescentie met, of zelfs zonder gebruik te maken van een DRBT. Bereiden van glycerol voorraad van de afgebeelde kolonies. Een aparte kolonie wassen in een 50 mL centrifugebuis met 5 µL van LB medium met ampicilline (bij een eindconcentratie van 100 µg/mL). Het incuberen bij 37 ° C gedurende 8 uur terwijl het voortdurend schudden van 220 toeren per minuut; oogst de cellen vervolgens door centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zachtjes opschorten van de cellen in 1 mL van 80% glycerol-oplossing (verdund met water) en voeg 500 µL van 10 mM MgCl2 oplossing aan de schorsing. Spoel de suspensie tot een bevriezing koker en opslaan van de voorraden bij 70 ° C. Controleer de volgorde van de gegenereerde plasmide of door DNA sequentiebepaling. Voeg toe 10 µL van de voorraad van de glycerol (bereid in stap 1.7) tot 5 mL LB medium dat 100 µg/mL ampicilline in een centrifugebuis 50 mL. Incubeer de schorsing bij 37 ° C gedurende 16 uur terwijl het voortdurend schudden van 220 toeren per minuut; vervolgens het oogsten van de cellen door centrifugeren bij 2.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Isolaat de plasmide expressie uit de pellet van de cel door de miniprep van een plasmide kit (Zie Tabel van materialen) volgens instructies van de fabrikant, en gebruiken het gezuiverde plasmide DNA sequencing.Opmerking: voor het rangschikken, 5′-GATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAG-3′ (in voorwaartse richting) en 5′-GCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGC-3′ (reverse) oligonucleotide primers mogen worden gebruikt. 2. weergave van de fluorescerende ondergronden De starter cultuur voor te bereiden. Voeg toe 10 µL van de voorraad van de glycerol (bereid in stap 1.7) tot 5 mL LB medium dat 100 µg/mL ampicilline in een centrifugebuis 50 mL. Incubeer de schorsing bij 37 ° C gedurende 15 h terwijl het voortdurend schudden van 220 toeren per minuut. 50 mL verse LB medium dat 100 µg/mL ampicilline in een conische kolf van 500 mL steriele overbrengen in de bacteriecultuur (5 mL). Groeien de cellen bij 37 ° C tot een extinctie van 0,6-0,8 bij een 600 nm golflengte, terwijl het voortdurend schudden van 220 toeren per minuut.Opmerking: Indien een tetracycline behandeling worden toegepast bij stap 2.5, het is niet aanbevolen om de cellen groeien tot een extinctie van meer dan 0,6 op 600 nm. Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) aan de uiteindelijke concentratie van 1 mM voor het opwekken van eiwit expressie toevoegen. Als de behandeling van een tetracycline niet wordt toegepast, Incubeer de cultuur gedurende 3 uur bij 37 ° C terwijl het voortdurend schudden bij 220 t/min en blijven het protocol met stap 2.6. Als een tetracycline-behandeling wordt toegepast, blijven het protocol met stappen 2.5.1-2.5.3.Opmerking: Sommige FPs geproduceerd door E. coli cellen een langere rijpingstijd kan hebben (zie vorige werk)16,17; in deze gevallen kan de eiwit-vertaling worden optioneel gearresteerd door de behandeling van tetracycline, teneinde de fluorescerende opbrengst van het substraat oplossing. Incubeer de celsuspensie gedurende 2 uur bij 37 ° C terwijl het voortdurend schudden van 220 toeren per minuut; vervolgens voegt u een tetracycline-oplossing (bij een eindconcentratie van 200 µg/mL). Incubeer de celcultuur volgens de rijpingstijd van de fluorescente proteïne van keuze bij 37 ° C, terwijl het voortdurend schudden van 220 toeren per minuut. Breng 2 x 25 mL van de cultuur te reinigen van 50 mL centrifuge buizen en oogsten van de cellen door centrifugeren bij 4000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en opslaan van de bacteriële cel pellets bij-70 ° C gedurende ten minste 1 uur.Opmerking: Cellen met de geuite fluorescerende ondergronden tonen zichtbaar fluorescentie met, of zelfs zonder gebruik te maken van een DRBT. 3. cel verstoring Plaats de bevroren cel pellet op ijs en laat het ontdooien 15 min. Voeg 2 mL lysis-buffermengsel (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazool 0,05% Tween 20, pH 8) tot de pellet en opschorten van de cellen. Voeg 10 µL van vers bereide phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF) protease inhibitor oplossing (8,7 mg/mL, opgelost in ethanol) tot de schorsing. Voeg 2 mg lysozyme en 20 eenheden van DNase tot schorsing en schorten. Incubeer de opschorting op ijs voor 15 min, en vortex het af en toe. Breng 2 x 1 mL van de opschorting 1,5 mL microcentrifuge buizen en bewerk ultrasone trillingen ten de schorsingen voor 3 min, in rondes van 10 s van ultrasoonapparaat en 5 s van de rust. Centrifugeer de buizen bij 10.000 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur; vervolgens het fluorescerende supernatant (gewiste bacteriële cel lysate) zorgvuldig verwijderen van elke buis en overbrengen naar de nieuwe microcentrifuge buizen.Opmerking: Gewiste lysates met de fluorescerende substraat Toon zichtbaar fluorescentie met, of zelfs zonder gebruik te maken van een DRBT en kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal 2 weken. NIET het invriezen. Gewiste lysates kunnen rechtstreeks voor de bereiding van de monsters in de protease-assay (zie punt 4.1) worden gebruikt of ook kan worden gebruikt voor de zuivering van het substraat (zie stap 4.5.1). 4. Ni-NTA magnetische-gebaseerde kraal protease assay Opmerking: Als gevolg van de flexibiliteit van het platform van de bepaling, het kan worden geoptimaliseerd voor vele verschillende types van studies. Om deze reden en vanwege het verschil in het percentage van de activiteit van de enzymen van keuze, sommige van de parameters van de assay (waar het wordt aangeduid) kan niet worden expliciet beschreven maar moet worden geoptimaliseerd om de individuele doelen en de proefopzet. Als richtsnoer, worden de parameters van sommige soorten studies aangeduid op de specifieke stappen. Bereiding van de monsters Generatie van substraat-ingeschrevenen magnetische kralen Plaats een gesloten 2 lage–binding aan eiwitten (Zie Tabel van materialen) microcentrifuge tube mL bevatten nieuwe of gerecycled (zie punt 4.7) Ni-NTA magnetische agarose kralen in een magnetische deeltjes concentrator (MPC).Opmerking: Het bedrag van de toegepaste kraal schorsing moet worden ingesteld op basis van de proefopzet. Bij elk experiment gebruikten we 1 mL van de oplossing van de magnetische kraal (5%, v/v). Kralen kunnen vasthouden aan de muur en/of in het deksel van de buis van de microcentrifuge; Daarom zet de MPC ondersteboven in alle richtingen om ervoor te zorgen dat alle van de parels zijn verzameld. Verwijder het supernatant en verwerp het. Het wassen van de kralen door lysis-buffermengsel. 1.8 mL lysisbuffermengsel aan de kralen toevoegen en verwijderen van de gesloten buis uit de MPC. Schorten de kralen in de buis door schudden en/of de buizen draaien ondersteboven totdat het monster volledig homogeen is. Plaats de buis terug in de MPC en zet hem ondersteboven te verzamelen van de kralen. Open de tube en de vloeistof wordt weggeworpen. 1.0-1.8 mL van de gewiste lysate (bereid in stap 3.7) aan de kralen toevoegen en verwijderen van de buis van de MPC. Draai de gesloten buis ondersteboven totdat de kralen volledig homogeen zijn en langzaam draai de buis door een rotator bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Plaats het in de MPC en verwijderen van de gewiste cel lysate uit de kralen en de deksel.Opmerking: De gewiste cel lysate kan worden verwijderd of opgeslagen voor verder gebruik (Zie de opmerking na stap 3.7). Voeg 1% Tween-20 (pH 7) aan de substraat-ingeschrevenen magnetische kralen (SAMBs).Opmerking: SAMBs Toon zichtbaar fluorescentie met, of zelfs zonder gebruik te maken van een DRBT. Wassen van de SAMBs Plaats de buis met de SAMB schorsing in de MPC en verwijder het supernatant. Wassen van de SAMBs 3 x met elke buffer: i) 1.8 mL 1% Tween-20 (pH 7); II) 1.8 mL wassen buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 5 mM imidazool, 0,05% Tween 20, pH 7); III) 1.8 mL decollete buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7).Opmerking: Zie voor de procedure wassen stap 4.1.1.4. De splijting buffer kan worden gewijzigd volgens de experimentele behoeften, maar het is aanbevolen om de handleiding van de Ni-NTA magnetische kralen naar compatibiliteit controleren. Bereiding van de stockoplossing SAMB Een decolleté buffer aan de gewassen SAMBs maken van een stamoplossing SAMB toevoegen.Opmerking: Na de toevoeging van de buffer, niet schudden of draai de buis ondersteboven. Het volume van de buffer decollete hangt af van de individuele proefopzet en moet worden berekend op basis van het aantal magnetische kralen (zie stap 4.1.1.1) en op de volumes om te worden gebruikt in stap 4.1.4.2. Voor 2 mL tubes, het toegepaste volume tot 1.900 µL is (Zie tabel 1). De aanbevolen magnetische kraal dichtheid van de stockoplossing SAMB is 2-10% (v/v). Studie soort Volume van decollete buffer (µL) S-afhankelijke metingen (Fig 4) 1600 Tijdsverloop metingen (Fig 5A) 1600 Remming studie (Fig 5B) 1900 pH afhankelijkheid studie (Fig 6) 1400 Tabel 1: Omvang van de buffer van de decolleté gebruikt voor het bereiden van de stockoplossing SAMB, in de verschillende soorten metingen. Verwijder de gesloten buis uit de MPC. De stockoplossing SAMB onmiddellijk gebruik of bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal 24 uur. Generatie van de monsters van de bepaling met behulp van de stockoplossing SAMBOpmerking: De details van dit deel van de bepaling zijn sterk afhankelijk van de individuele proefopzet (voorbeeld in tabel 2u typen ziet). Voorbeeld type Notities Reactie monster (R) -gebruikt voor de beoordeling van de eigenschappen van het decolleté-bevat zowel het enzym en het substraat in decollete buffer Substraat blancomonster (B) -gebruikt voor de beoordeling van spontane substraat dissociatie (zie stap 4.6.2)-bevat alleen het substraat in decollete buffer Substraat controlemonster (C) -voor hydrological substraat concentratie (zie stap 4.6.3)-bevat alleen het substraat in elutie buffer Tabel 2: Monster soorten de Ni-NTA protease magnetische-kraal-gebaseerde bepaling. 2 mL van laag-proteïne-bindende microcentrifuge buizen voorbereiden op de test monsters.Opmerking: Andere laag eiwitgehalte bindend van plastic waren kan ook worden gebruikt. Gebruik ronde – of platte onderkant buizen te waarborgen van het vrije verkeer van SAMBs. Zie het aanbevolen aantal buisjes in tabel 3. Studie soort R B C S-afhankelijke metingen (Fig 4) 5 5 2 Tijdsverloop metingen (Fig 5A) 6 6 2 Remming studie (Fig 5B) 7 7 1 pH afhankelijkheid studie (Fig 6) 5 5 1 Tabel 3: Aantal vereiste 2 mL microcentrifuge buizen voor elk type van het monster in de aangetoonde studies. Opschorten van de stockoplossing SAMB tot homogeniteit en het bedrag van substraat te analyseren in de reacties onmiddellijk in de steekproef flesjes. De aanbevolen volume is 25-300 µL, maar het is om te worden ingesteld op basis van de individuele proefopzet (tabel 4).Opmerking: Controleer als alle SAMBs in de bodem van de buizen zijn gemeten. SAMBs kan vasthouden aan de wand van de buis, die de resultaten van de bepaling kan verstoren. Als verschillende volumes gaan sequentieel worden gemeten, start aliquoting met het hoogste volume en probeer om te minimaliseren van de verandering van de pipetten en/of de uiteinden van de pipet. Studie soort R B C S-afhankelijke metingen (Fig 4) 25 – 50 – 100 – 150-250 25 – 50 – 100 – 150-250 25 Tijdsverloop metingen (Fig 5A) 25 25 25 Remming studie (Fig 5B) 120 120 120 pH afhankelijkheid studie (Fig 6) 100 100 100 Tabel 4: Volume van de oplossing SAMB gemeten in de steekproef flesjes van elk monster type in de aangetoonde studies. Plaats de buizen van de steekproef met de aliquoted SAMB schorsing in de MPC en licht heen en weer bewegen de MPC. Zorgvuldig de bovendrijvende vloeistof verwijderen uit de SAMBs en verwerpen. De buizen uit de MPC verwijderen en toevoegen van de berekende hoeveelheid reactie buffer (decollete of elutie buffer [100 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 7]) zorgvuldig aan de SAMBs.Opmerking: Berekenen van het buffervolume volgens de individuele proefopzet (tabel 5). Voor 2 mL tubes is het aanbevolen eindvolume van het reactiemengsel (het volume van de reactie buffer te worden toegevoegd in deze stap + het volume van de oplossing te worden toegevoegd in stap 4.2.3) 50-150 µL. ervoor te zorgen dat alle van de SAMBs worden gewassen in de toegevoegde buffer. Elutie buffer wordt gebruikt in plaats van splitsing buffer in de gevallen van substraat controlemonsters (C). Voor de studie van een remming, wordt de Inhibitor van de omwenteling van keuze aanbevolen om bij deze stap worden toegevoegd. Studie soort Volume van de reactie buffer (µL) S-afhankelijke metingen (Fig 4) 68 µL decollete buffer Tijdsverloop metingen (Fig 5A) 68 µL decollete buffer Remming studie (Fig 5B) 67.3 µL decollete buffer + 0,7 µL-remmer stock oplossing * pH afhankelijkheid studie (Fig 6) 69,5 µL decollete buffer ** Tabel 5: omvang van de buffer van de reactie in de aangetoonde studies. * Amprenavir werd opgelost in dimethylsulfoxide; stamoplossingen van de amprenavir (variërend van 1 nM tot 1 µM concentraties) werden toegepast voor remmende studie (Zie figuur 5B). ** De pH van de buffer van de toegepaste decollete varieerden van pH 6.0-8.5. Sluit de deksels van de buizen. De monsters zijn nu klaar voor de bepaling.Opmerking: De monsters kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal 24 h, maar de opslag is alleen van toepassing als de stockoplossing SAMB werd onmiddellijk na de bereiding gebruikt (zie stap 4.1.3.2). Inleiding van de Proteolytische reacties Bereid de Proteolytische enzymen oplossing volgens de experimentele behoeften.Opmerking: Het wordt aanbevolen met een decolleté buffer te ontbinden en/of verdunnen van het enzym. Protocollen voor de zuivering van HIV-1-14 en TEV PRs18 zijn eerder gepubliceerd. Instellen van de thermoshaker agitatie tarief (600 rpm) en incubatietemperatuur (tabel 6). Studie soort Incubatietemperatuur (° C) S-afhankelijke metingen (Fig 4) 37 Tijdsverloop metingen (Fig 5A) 37 Remming studie (Fig 5B) 37 pH afhankelijkheid studie (Fig 6) 30 Tabel 6: incubatie temperaturen toegepast in verschillende typen. Voor HIV-1 PR, wordt 37 ° C aanbevolen, terwijl 30 ° C wordt aanbevolen voor TEV PR. De enzym-oplossing aan de reactie monsters voor het initialiseren van Proteolytische Reacties toevoegen.Opmerking: In het geval van substraat leeg (B) en C monsters, voeg decollete buffer (buffer enzym) en elutie buffer, respectievelijk. Het volume moet worden berekend op basis van de individuele experimentele behoeften (tabel 7). Voor 2 mL tubes is het aanbevolen eindvolume van het reactiemengsel (het volume van de buffer van de reactie toegevoegd in stap 4.1.4.5 + het volume van de oplossing te worden toegevoegd in deze stap) 50-150 µL. Studie soort Volume van het enzym oplossing/enzym buffer/elutie buffer (µL) S-afhankelijke metingen (Fig 4) 2 Tijdsverloop metingen (Fig 5A) 2 Remming studie (Fig 5B) 2 pH afhankelijkheid studie (Fig 6) 0,5 Tabel 7: Volume van de enzym oplossing/enzym buffer/elutie buffer toegevoegd tijdens de initialisatie van de monsters van de bepaling in het geval van de aangetoonde studies. Wakkeren de kralen zorgvuldig door de buizen voorzichtig te verplaatsen, en plaats de buizen onmiddellijk in de al schudden thermoshaker.Opmerking: Handmatige monster beëindiging (zie punt 4.3) duurt langer dan de inleiding; Vandaar, is een geregistreerde vertraging van ten minste 2 min. Aanbevolen tussen de reacties inwijdingen. Incubeer de monsters volgens de proefopzet (tabel 8). Studie soort Incubatie tijd (min) S-afhankelijke metingen (Fig 4A) 7 S-afhankelijke metingen (Fig 4B) 120 Tijdsverloop metingen (Fig 5A) 0 – 2.5 – 5 – 10 – 15 – 20 Remming studie (Fig 5B) 10 pH afhankelijkheid studie (Fig 6) 60 Tabel 8: Incubatie keer toegepast op de monsters van de bepaling in de verschillende metingen. Terminatie van de Proteolytische reacties Het monster uit de shaker, 30 s voorafgaande aan het eind van de incubatie, en draai het onmiddellijk. Plaats de buis op de MPC, laat het staan voor 15 s, en iets heen en weer bewegen de MPC. Open het deksel en het supernatant zorgvuldig overbrengen naar een plaat of een nieuwe buis.Opmerking: Raak niet de geconcentreerde kralen met het uiteinde van de pipet. Het verzamelde supernatant van C monsters en R monsters met een hoge mate van decolleté kan zichtbaar fluorescentie met of zelfs zonder het gebruiken van een DRBT Toon. Fluorescerende detectie 2 x 30 µL van het supernatant gescheiden monster overbrengen in een zwarte microplate half-gebied. Het meten van de fluorescentie met behulp van de geschikte filters voor excitatie en emissie.Opmerking: Meet de fundamentele fluorescentie van het decolleté buffer en de elutie buffer, evenals. Filter combinaties moeten worden gekozen op basis van de gemeten fluorescente proteïne (tabel 9). Fluorescent proteïne Excitatie filters (nm) Emissie filters (nm) mTurqiouse2 355/40 460/25 mEYFP 544/15 590/10 mApple 544/15 590/10 Tabel 9: Excitatie en emissie filters die worden gebruikt om op te sporen van verschillende fluorescente proteïnen. KalibratieOpmerking: Voor het genereren van de kalibratiekrommen in stap 4.6.1, fluorescentie intensiteitswaarden van splitsingsproducten – of elutie-buffer-opgelost gezuiverde substraten in verschillende concentraties moeten worden gemeten. Zuiveren de fluorescerende ondergronden.Opmerking: Voor de zuivering, SAMBs van het substraat (B) blancomonsters nadat de protease-bepaling kan worden verzameld, of een nieuwe SAMB schorsing kan ook bereid worden (zie onder de punten 4.1.1 en 4.1.2). Plaats een buis met SAMBs geschorst in 1 mL decollete buffer (2-10%; v/v) aan de MPC en verzamelen de magnetische kralen door te draaien aan de MPC ondersteboven in elke richting. Open de tube en de buffer decolleté, zowel van de buis en het deksel te verwijderen. De buis van de MPC verwijderen en toevoegen van 400-600 µL van elutie buffer aan de SAMBs. Langzaam draaien de gesloten buis met een rotator bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Plaats de buis op de MPC en verzamelen de kralen door te draaien aan de MPC ondersteboven. Verwijder het supernatant met het gezuiverde intact fluorescerende substraat (eluaat) en overbrengen naar een nieuwe laag-proteïne-bindende microcentrifuge buis.Opmerking: Eluaat toont duidelijk zichtbaar fluorescentie met, of zelfs zonder gebruik te maken van een DRBT. Het uitvoeren van parallelle buffer uitwisseling met behulp van twee 0,5 mL 10K ultrafiltratie apparaten. Meet de helft van de volume van het bereide eluaat (200-300 µL) in elk apparaat ultrafiltratie. Na bij elke stap van centrifugeren, Verdun het geconcentreerde eluaat in de eerste en de tweede ultrafiltratie apparaten door elutie buffer en buffer decollete, respectievelijk. Pas na het herstel, de geconcentreerde monsters in de verschillende buffers op hetzelfde volume, tussen de 120-200 µL opgelost.Opmerking: Nu het eiwitgehalte van het decolleté buffer-opgelost substraat is identiek aan de elutie buffer-opgelost substraat; Daarom is het niet nodig om te bepalen van de inhoud van de laatstgenoemde bij stap 4.5.3, proteïne als de methode die wordt gebruikt voor het meten van de eiwitconcentratie met EDTA interfereert. Bepalen het eiwitgehalte van de substraten ontbonden in elutie of decolleté buffer door het meten van de absorptie bij 280 nm.Opmerking: Andere methoden (bijvoorbeeld Bradford of bicinchoninic zuur (BCA) testen) kunnen ook worden gebruikt voor het meten van de eiwitconcentratie, maar mogelijke storingen met EDTA (aanwezig in de elutie buffer) of met de absorptie van het fluorescerende substraat moet worden beschouwd. Het eerste eiwitgehalte van het substraat oplossing moeten worden toegepast in stap 4.5.4 wordt aanbevolen te worden tussen 0,4-2.0 mg/mL om te genereren een kalibratie curve in een passend aanbod. Zie tabel 10 voor uitsterven coëfficiënten. Substraat Moleculair gewicht(Da) Uitsterven coëfficiënt(M-1 cm-1, op 280 nm gemeten in water) Zijn6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 72101.7 96845 Zijn6- MBP-KARVL * AEAM-mTurquoise2 72042.7 95355 Zijn6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP 72367.1 94325 Zijn6- MBP-VSQNY * PIVQ-mApple 72145.9 105200 Tabel 10: molecuulgewicht en de coëfficiënten van het uitsterven van de verschillende recombinante fluorescerende fusie-eiwit substraten. Maak een tweeledig seriële verdunning in ten minste acht stappen, zowel vanuit de elutie – de splitsingsproducten-buffer-opgelost substraat oplossingen, met behulp van elutie of decolleté buffer voor de verdunning, respectievelijk. 30 µL van elk punt verdunning overbrengen in een zwarte microplate half-gebied. Meten van de fluorescentie met een fluorimeter, met behulp van de instelling toegepast in stap 4.4.2.Opmerking: Meet de fundamentele fluorescentie van zowel het splijten en de elutie buffer. Evaluatie van de bepaling De kalibratiekrommen worden uitgezet. Bereken de concentratie (in mM) van de oplossingen van de gezuiverde substraat (gebruikt in stap 4.5.4), op basis van het eiwit inhoud bepaald in stap 4.5.3. Corrigeer de relatieve fluorescentie intensiteitswaarden (RFU) voor de seriële verdunning punten door de fundamentele waarden van de RFU van de toegepaste verdunning buffer (de buffer decollete of de elutie-buffer). Uitzetten van de gecorrigeerde waarden van de RFU tegen de molaire concentratie van het decollete – of elutie-buffer-opgelost gezuiverde substraten en het uitvoeren van een lineaire regressie (kracht het snijpunt op nul).Opmerking: Een hoge R2 waarde (˃0.97) geeft een goede lineaire correlatie tussen de fluorescentie en de concentratie van de fluorescente proteïne. In dit geval kan de richtingscoëfficiënt van de regressielijn worden gebruikt ter beoordeling van de concentratie van de bestanddelen van de bepaling in het onderzochte bereik in stappen 4.6.2 en 4.6.3. Experimentele fouten en gegevens punt distributie van invloed kan zijn op de betrouwbaarheid van de kalibratie; Dus, een grafische evaluatie kan worden uitgevoerd met behulp van zoom-in grafieken (zoals in afbeelding 3), teneinde na te gaan of R2 en de helling waarden worden beïnvloed door de gegevens. Bereken de hoeveelheid C-terminal fluorescerende decollete product in de reactie monsters. Corrigeer de RFU waarden van elk monster R met de RFU waarden van de corresponderende B-monster. Bereken de splitsingsproducten product concentratie (in mM) in de reactie monsters door te delen de gecorrigeerde RFU waarden door de helling van de splitsingsproducten buffer-gebaseerde kalibratie curve (zie stap 4.6.1.3). Bereken de toegepaste substraat-concentratie in de monsters van de reactie. Corrigeer de waarden van de RFU van het C-monster met de RFU waarde van de fundamentele elutie buffer. Bereken de concentratie van het eluted substraat (in mM) in het supernatant van het C-monster door te delen hun gecorrigeerde RFU waarden door de helling van de elutie buffer-gebaseerde kalibratie curve (zie stap 4.6.1.3). Bepaal de concentratie van de ondergrond (in mM) van de stockoplossing van SAMB, gebruikt voor het maken van de assay monsters in stap 4.1.4.2, op basis van de volgende vergelijking:CSAMB is hier de molaire concentratie van de stockoplossing van SAMB, voorbereid op een punt 4.1.3; cC is de molaire concentratie van het eluted substraat in het C-monster berekend bij stap 4.6.3.3; Vr = het volume van het reactiemengsel gemaakt door de toevoeging van de buffer van de reactie in stap 4.1.4.5 en de enzym-buffer in stap 4.2.3.; en VSAMB is het volume van de stockoplossing SAMB in de steekproef C (stap 4.1.4.2). Bereken de molaire concentratie van de substraten in elk R monster gebaseerd op de molaire concentratie van de SAMB stockoplossing (in mM) volgens het volume (in µL) gemeten in elk monster reactiebuis bij stap 4.1.4.2. Uitvoeren van gegevensverwerking.Opmerking: De data-analyse is afhankelijk van het doel van het experiment. De video toont een voorbeeld voor de verwerking van een substraat-afhankelijke kinetische studie over HIV-1 PR met zijn6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substraat. De beginsnelheid waarden worden berekend op basis van het aantal C-terminal decollete fragmenten en worden uitgezet tegen de concentratie van de toegepaste substraat. De kinetische parameters worden bepaald door een niet-lineaire regressie-analyse van Michaelis-Menten. Recycling van de magnetische kralenOpmerking: Na het uitvoeren van een test, de magnetische agarose-kralen kunnen worden verzameld en gerecycleerd. Verzamelen van de gebruikte magnetische kralen met de MPC en verwijder het supernatant. Wassen van de kralen met 1.8 mL van de volgende buffers, in de gegeven volgorde: regeneratie buffer A (0,05% Tween-20, 0,5 M NaOH), regeneratie buffer B (0,05% Tween-20), regeneratie buffer C (0,05% Tween-20, 100 mM EDTA, pH 8), regeneratie buffer B, regeneratie buffer D () 0,05% Tween 20, 100 mM NiSO4, pH 8), regeneratie buffer B en regeneratie buffer E (0.5% Tween 20, 30% ethanol, pH 7).Opmerking: Zie voor de procedure wassen stap 4.1.1.4. Opslaan van de gerecycleerde kralen in regeneratie buffer E bij 4 ° C. 5. pagina-analyse Bereiding van de monstersOpmerking: Na het uitvoeren van de Ni-NTA magnetische-kraal-gebaseerde bepaling, de assay supernatant kunnen worden geanalyseerd door pagina. In dit geval, slaat u stap 5.1.1 en 5.1.2. Het is echter ook mogelijk om te analyseren de gezuiverde fluorescerende ondergronden oplossing en/of de fragmenten van hun decolleté na de spijsvertering-oplossing met de protease van belang. In dit geval blijven het protocol met stap 5.1.1. Bereid de oplossing van de gezuiverde fluorescerende substraat volgens stap 4.5.1. Uitvoeren in-oplossing spijsvertering. Wisselen elutie buffer met decollete buffer in de 0,5 mL 10K ultrafiltratie apparaat en aliquot de monsters te worden verteerd in 1,5 mL microcentrifuge buizen.Opmerking: voor de pagina-analyse, we aliquoted 68 µL van elke ondergrond, maar het aantal monster buisjes en de hoeveelheid substraat oplossing aliquoted volgens de individuele proefopzet kan worden geoptimaliseerd. De enzym-oplossing toevoegen aan de monsters.Opmerking: Voor de pagina-analyse, pasten we 2 µL van HIV-1 PR, bereid zoals beschreven door Bozóki et al.14, maar het volume kan worden geoptimaliseerd volgens de individuele proefopzet. Het is aanbevolen om gebruik decollete buffer te ontbinden en/of verdunnen van het enzym. Incubeer de monsters volgens de proefopzet.Opmerking: Voor de pagina-analyse, wij het reactiemengsel gedurende 45 minuten bij 37 ° C, maar de incubatietijd geïncubeerd en temperatuur moeten worden ingesteld volgens de proefopzet. De reactie beëindigen door het uitvoeren van stap 5.1.3. Het monster voorbereiden door pagina.Opmerking: De TL-substraat-bevattende monsters kunnen worden voorbereid voor de pagina door een nondenaturing of een denatureren methode. Voor het gebruik van nondenaturing of denatureren voorwaarden, volg stap 5.1.3.1 of 5.1.3.2, respectievelijk. Een nondenatured monster te bereiden: Meng 30 µL van het monster met 6 µL van 6 x nondenaturing monster-laden buffer (300 mM Tris, 20% glycerol, 0.05% bromophenol blauw, pH 6.8). Gedenatureerde eenmonstervan bereiden: Meng 30 µL van het monster met 6 µL van 6 x denatureren monster-laden buffer (300 mM Tris, 0.05% bromophenol blauw, 12% SDS, 100 mM β-mercaptoethanol, 20% glycerol, pH 6.8), en warmte van de monsters bij 95 ° C gedurende 10 min. SDS-pagina analyseOpmerking: Optioneel, als alleen nondenatured (bereid in stap 5.1.3.1) monsters worden geanalyseerd moeten, een inheemse pagina kan ook worden uitgevoerd. In dit geval slaat u punt 5.3. Bereiden van een SDS-polyacrylamide-gel (gebruik 14% scheiden en 4% stapelen gel) en vul de tank met elektroforese buffer (2.5 mM Tris, 19,2 mM glycine, 0,01% SDS). Breng de monsters (bereid in stap 5.1.3.1 of 5.1.3.2) in de putjes van een polyacrylamide-gel en uitvoeren van elektroforese bij 120 V spanning. Verwijderen van de gel-cassette uit de lopende module en plaats de gel in een tank wassen.Opmerking: Nondenatured monsters zijn al zichtbaar in de gel, zelfs met het blote oog of met een DRBT. In-gel renaturatie en opsporing van fluorescente proteïnenOpmerking: Om te ontdekken de fluorescente proteïnen in gedenatureerde monsters (bereid in stap 5.1.3.2) op de DRBT, SDS moet worden weggespoeld uit de gel, tot gedeeltelijk renature de eiwitten. Voeg ~ 100 mL gedestilleerd water aan de gel en spoel de gel ten minste 30 min.Opmerking: Ter verbetering van de SDS-verwijdering, vervanging van het water elke 10 min, of tot 60 min. spoelen. Visualiseer de fluorescente proteïnen met behulp van een DRBT, of door UV imaging. Conventionele Coomassie kleuring van de gel Vlek de gel met Coomassie briljante blauwe kleurstof te visualiseren nonfluorescent eiwitten.

Representative Results

Figuur 1A blijkt de schematische structuur van een representatieve fluorescerende recombinant eiwit substraat die kan worden verwerkt door HIV-1 PR op de volgorde van de site specifieke decollete. Figuur 1B vertegenwoordigt de substraat-productie en hun mogelijke toepassingen in protease testen, inclusief Ni-NTA magnetische-kraal-gebaseerde bepaling en/of pagina. Voor het verkrijgen van betrouwbare gegevens door fluorimetrie, is een kalibratieprocedure vereist om te bepalen welke hoeveelheden TL substraten en DISSOCIATIEPRODUCTEN daarvan. Hiervoor de intensiteitswaarden van de fluorescentie van de verschillende ondergronden in de verschillende buffer voorwaarden moeten worden gemeten en moeten worden gecorreleerd met hun concentraties in het getest concentratiebereik (Figuur 3). De waarden van de helling van de kalibratiekrommen kunnen worden toegepast om te bepalen van de bedragen van substraten en DISSOCIATIEPRODUCTEN daarvan in de assay monsters. De hellingen van de kalibratiekrommen zijn onafhankelijk van het decolleté site sequenties ingevoegd in de substraten (tabel 11) en potentieel kunnen worden gebruikt voor een serie van substraten gesmolten tot dezelfde soort fluorescente proteïne. Zoom-in grafieken worden weergegeven voor alle lineaire regressies, voor een vergroting van de lagere concentratie bereiken evenals (Figuur 3). Het is belangrijk op te merken dat de kalibratie zorgvuldig worden uitgevoerd moet, omdat een goede verdeling van de gegevenspunten vereist voor een betrouwbare kalibratie wordt. Om deze reden, wordt tweeledig seriële verdunning toegepast ter voorbereiding van de monsters voor kalibratie, omdat de R-waarde van2 geeft een goede correlatie tussen de concentratie van fluorescente proteïne en fluorescentie alleen als een voldoende aantal gegevenspunten zijn gebruikt ter dekking van het hele concentratiebereik. Bovendien experimentele fouten kunnen sterk van invloed zijn op de nauwkeurigheid van de kalibratie; Dus, een grafische evaluatie van de regressielijnen kan ook nodig zijn. Een verscheidenheid van enzymatische metingen kan worden uitgevoerd door de protease-assay, met inbegrip van een onderzoek naar het effect van de concentratie van het substraat op reactie snelheid (figuur 4A). Door middel van niet-lineaire regressie, kunnen de gegevens worden gebruikt om te bepalen van enzym kinetische parameters (bijvoorbeeld vmax en Km). Een schorsing onvoldoende kraal en dispersie en de beëindiging van een ongepaste reactie kunnen veroorzaken suboptimaal resultaten (figuur 4B), die niet geschikt zijn voor de berekening van betrouwbare enzym kinetische waarden. Een afhankelijkheid van de formatie van het product op tijd kan worden bepaald door de bepaling (figuur 5A) (bijvoorbeeld tijdens het optimaliseren van de parameters van de reactie decolleté). Enzymactiviteit in aanwezigheid van een inhibitor van de omwenteling kan ook worden onderzocht (figuur 5B) voor de bepaling van de concentratie van de actieve enzym en remmende-constante. Met behulp van dezelfde methode, kunnen effecten van andere remmers ook worden gescreend door de bepaling. De protease-bepaling is handig bij het onderzoeken van de effecten van de pH op enzymactiviteit, evenals. Figuur 6A vertegenwoordigt de afhankelijkheid van de enzymactiviteit van de pH door het voorbeeld van TEV PR, die een brede optimale pH bereik (pH 6-9 heeft). Als de afhankelijkheid van de pH van de enzymactiviteit wordt bestudeerd (of enzymen hebben een zure pH optimaal moeten worden gemeten), is het noodzakelijk te overwegen dat de binding van de affiniteit van recombinante substraten voor de kralen beperkt met een licht zure pH worden kan. Een verhoogde dissociatie van de substraten uit de kralen (figuur 6B) kan leiden tot een vervorming van de resultaten van de test. Om te overwegen de spontane substraat dissociatie van de parels, moeten de waarde die is gemeten voor reactie monsters worden gecorrigeerd door degenen onder B monsters. Figuur 7 laat zien dat de nondenatured fluorescerende eiwitten kunnen worden onderscheiden in de gel op basis van hun kleuren, met behulp van blauw licht transillumination (figuur 7A). Als de bepaling van het molecuulgewicht van substraten/decollete fragmenten nodig is, kan denaturerende omstandigheden ook worden gebruikt voor de bereiding van de monsters, omdat fluorescente proteïnen kunnen gedeeltelijk renatured in de gel, en kunnen worden gedetecteerd door UV belichting (Figuur 7B) of door Coomassie kleuring (Figuur 7 c). Als de R-monsters worden geanalyseerd, zijn alleen de C-terminal splitsingsproducten zichtbaar (Figuur 7 c), terwijl de N-terminale decollete fragmenten en de uncleaved substraten verbonden met de kralen blijven. Af en toe, eiwitten kunnen gedeeltelijk worden gedenatureerd ondanks het gebruik van nondenaturing voorwaarden (Figuur 7 c), en terwijl de nondenatured eiwitten meer overvloedig zijn, gedenatureerde formulieren zijn ook in het monster aantoonbaar. Dit verschijnsel heeft geen invloed op de opsporing van Proteolytische splijten, maar moet worden beschouwd in het geval van kwantitatieve densitometrie van nondenatured monsters. Hoewel de gedetailleerde beschrijving wordt weergegeven alleen voor een 2 mL-buis-gebaseerde assay, kan de bepaling worden aangepast voor een 96-wells-plaat-gebaseerd systeem (Figuur 8), dat al met succes in ons laboratorium getest is (niet afgebeeld). De 96-wells-plaat aangepast formaat is volledig compatibel met de fluorimetrische en elektroforetische analyses, alsook, en de verkregen gegevens kunnen ook worden geëvalueerd op basis van de in dit artikel beschreven methoden. Figuur 3 : Kalibratiekrommen. Representatieve substraat kalibratiekrommen worden gedemonstreerd met het voorbeeld van twee recombinante substraten gesmolten op verschillende C-terminal fluorescerende Labels: (A en B) zijn6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 en (C en D ) Zijn6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP. Zoom-in cijfers staan ook voor de lineaire regressie van gegevenspunten in de 0-0.005 mM substraat concentratiebereik. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4 : Bepaling van de kinetische parameters enzym. Substraat-afhankelijke kinetische metingen werden uitgevoerd door HIV-1 PR (op een actieve eindconcentratie van 41,2 nM). De beginsnelheid waarden werden uitgezet tegen de concentratie van het substraat en een Michaelis-Menten niet-lineaire regressie-analyse werd uitgevoerd. De foutbalken vertegenwoordigen SD (n = 2). (A) A representatieve optimaal resultaat wordt weergegeven met het voorbeeld van zijn6- MBP-VSQNY * PIVQ-mApple fusion eiwit substraat. (B) een representatieve suboptimaal resultaat blijkt ook voor de zijn6- MBP-KARVL * AEAM-mTurquoise2 substraat, waar het vaststellen van de juiste substraat concentraties problematisch vanwege een onvoldoende homogenisering van de stockoplossing SAMB was , terwijl relatief hoge fouten werden veroorzaakt door onjuiste reactie opzegging. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 5 :-Tijdsverloop en remmende studie. (A) Zijn 6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP gekloofd recombinante fusion eiwit substraat (bij een eindconcentratie van 0.00326 mM) werd door HIV-1 PR (op een actieve eindconcentratie van 41,2 nM), en de vrijlating van fluorescerende PIVQ-mEYFP Proteolytische fragmenten werd gemeten aan een tijdsverloop analyses uit te voeren. De metingen werden uitgevoerd bij vijf verschillende tijdstippen. De foutbalken vertegenwoordigen SD (n = 2). (B) zijn6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP werd gebruikt als substraat (bij 0.0015 mM) om te bepalen van het remmende effect van amprenavir op de activiteit van HIV-1 PR (met een totale concentratie van 163,8 nM). Door het uitzetten van de gegevens, de helft maximale remmende concentratie (IC50) kan worden geëvalueerd en de concentratie van de actieve enzym (een actieve eindconcentratie van 41,2 nM) van het toegepaste HIV-1 PR kan ook worden berekend op basis van de remming curve. De foutbalken vertegenwoordigen SD (n = 3). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 6 : Bestuderen van afhankelijkheid van de enzymactiviteit en spontane substraat dissociatie op pH. (A) het zijn6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substraat (in 0.033 mM) werd gebruikt voor het meten van de enzymactiviteit van TEV PR (op een totale eindconcentratie van 91.42 nM) in decollete buffer ingesteld op een verschillende pH, tussen het bereik van 6,5-8,5. De foutbalken vertegenwoordigen SD (n = 2). De uitgezette gegevens al eerder gepubliceerd14. (B) op basis van de waarden van de relatieve intensiteit van de fluorescentie van het substraat blancomonsters, de spontane dissociatie van het zijn6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substraat (0.033 mM) van de magnetische kralen werd bestudeerd door middel van splijting buffer met een verschillende pH tussen 6.0-8.5. De uitgezette gegevens al eerder gepubliceerd14. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 7 : Opsporen van eiwitten in de gel door verschillende methoden. (A) Uncleaved en fusion HIV-1 PR-verteerd eiwit substraten na nondenaturing monstervoorbereiding waren gevisualiseerd door blauw licht transillumination na SDS-pagina. De splijting reactie werd uitgevoerd door vertering-oplossing. (B) onmiddellijk na de pagina alleen nondenatured eiwitten kon worden opgespoord in de gel door UV belichting, terwijl na de verwijdering van SDS, de eerder gedenatureerde fluorescente proteïnen werd gedeeltelijk renatured en aantoonbaar. De monsters werden bereid uit het supernatant van de Ni-NTA magnetische-kraal-gebaseerde bepaling. (C) Coomassie kleuring kan ook worden gebruikt voor de detectie van eiwit, na de renaturatie in-gel. De SDS-heden in de gel-mei veroorzaken de gedeeltelijke denaturatie van de inheemse proteïne, maar in native monsters, de nondenatured vormen meer overvloedig zijn. De monsters werden bereid uit het supernatant van de Ni-NTA magnetische-kraal-gebaseerde bepaling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 8 : 96-wells plaat gebaseerde aanpassing van het platform assay. (A) de bepaling kan worden uitgevoerd, niet alleen in 2 mL tubes, maar in de wells van een 96-wells-plaat, evenals. Hier laten we zien de schematische weergave voor de toepassing van de bepaling te bestuderen van de specificiteit van een fictieve protease met behulp van een reeks van fluorescerende ondergronden, dat eventueel wild-type (wt) of gemuteerde (mut-1 aan mut-4) decolleté site sequenties. Voor de behandeling van de magnetische kralen, is een 96-Wells compatibel magnetische deeltjes concentrator (MPC) in de experimenten moeten worden gebruikt. Alle aangegeven volumes zijn gerelateerd aan een enkel putje. Om te vergelijken de efficiëntie van de splitsing van de verschillende substraten, kan substraat conversie worden beoordeeld vanuit het percentage substraat-blanco-gecorrigeerd RFU waarden van de reactie monsters, gezien de RFU substraat-blanco-gecorrigeerde waarden van de verwante substraat controlemonsters als 100. (B) na de fluorimetrie, de gescheiden supernatant van de bepaling die monsters kunnen ook worden geanalyseerd door de pagina en de fluorescente proteïne componenten kan worden geanalyseerd rechtstreeks of na gel-renaturatie in geval van nondenaturing en denatureren monster voorbereiding, respectievelijk. De drie verschillende assay monster typen zijn ook geïllustreerd in elke figuur: C = substraat control, B = substraat leeg, en R = reactie. Substraat controlemonsters in elutie buffer, terwijl het substraat leeg en de reactie monsters zijn in decollete buffer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Buffer Fluorescent proteïne AVK % van skipistes (%) Elutie mTurquoise2 6.04 Decolleté 9.11 Elutie mApple 10.92 Decolleté 12.68 Tabel 11: coëfficiënt van afwijkingswaarden (AVK %) van de hellingen van de kalibratiekrommen substraat. Om te testen of de fluorescentie van de recombinante eiwitten substraten afhankelijk van de ingevoegde breukzijde is, werden kalibraties uitgevoerd door reeks mApple – en mTurquoise2-gesmolten substraten (zes varianten voor elk, met verschillende breukzijde sequenties van HIV-1 protease), beide in elutie en decolleté buffers. Vonden wij dat CV % waarden van de hellingen tot 15% in alle gevallen, wat inhoudt dat een enkele substraat kalibratie kan worden gebruikt voor de evaluatie van de verschillende metingen uitgevoerd door substraat varianten met dezelfde fluorescerende tag.

Discussion

Als gevolg van de intensieve industriële en academische onderzoeken van Proteolytische enzymen en de constante vraag naar snelle en betaalbare HTS-compatibele protease assay platformen dienovereenkomstig, hebben we ontwikkeld, een magnetische-gebaseerde kraal fluorescerende protease assay. De bepaling is gebaseerd op het gebruik van recombinante fusie-eiwitten die nieuwe alternatieven voor de wijd gebruikte synthetische peptide substraten kunnen.

In de ontwikkelde assay-indeling, worden de fusie-eiwit substraten geïmmobiliseerd op de oppervlakken van magnetische agarose Ni-chelaat-coated kralen. De bijlage van het substraat wordt verzorgd door de N-terminal zijn₆ affiniteit tag van het fusie-eiwit, dat rechtstreeks aan een MBP tag om te vergemakkelijken de vouwen en verhogen de oplosbaarheid in water van het substraat¹³is gesmolten. De MBP wordt gevolgd door splijten sites van TEV PR en een protease van belang. De voormalige kan dienen als de breukzijde van een besturingselement in de assay, terwijl de laatstgenoemde kan worden verwerkt door de protease worden onderzocht. De breukzijde is verwisselbaar; een korte dsDNA reeks codering voor de breukzijde van belang kan worden ingevoegd in de flexibele ‘klonen cassette’ van de expressie plasmide afbinding. De fusie van recombinante eiwitten bevatten een zeer stabiele, monomere fluorescent proteïne-tag op de C-terminal, waarmee de opsporing van het eindpunt van de enzym-bevrijd, fluorescerend C-terminal splitsingsproducten vrijgegeven bij de Proteolytische splitsingsproducten ( Figuur 1A). De gezuiverde fluorescerende intact substraten opgelost in verschillende buffers worden ook gebruikt voor de kalibratie te beoordelen van de molaire concentratie van substraten en DISSOCIATIEPRODUCTEN daarvan. Bovendien, na fluorimetrie, kunnen de assay componenten worden geanalyseerd door SDS-PAGE, evenals. Beide native (nondenatured) en gedenatureerde fluorescerende eiwitten kunnen worden gevisualiseerd in de gel, onmiddellijk na de elektroforese of volgende in-gel renaturatie, respectievelijk. Deze extra procedure-in combinatie met een conventionele Coomassie briljant blauw kleuring-mei worden efficiënt gebruikt voor de verificatie van de resultaten van de test (figuur 1B).

De assay-procedure bestaat uit eenvoudige, gemakkelijk-aan-uit te voeren stappen in een laag-volume-indeling die volledig aangepast aan een automatische hoog-productie-omgeving worden kunnen. Zelfstandig uit te voeren de test handmatig of met een automatiseringssysteem, de volgende onderdelen van de test worden echter beschouwd als doorslaggevend en speciale aandacht nodig hebben tijdens het uitvoeren van de procedure. i) homogeniteit van de magnetische kraal oplossing. Een homogeen magnetisch kraal oplossing moet gebruikt worden tijdens de test, zowel in de reiniging en wassen stappen. Met name afhankelijk de betrouwbaarheid van protease tests sterk van goed aliquoting de voorraadoplossingen van substraat-ingeschrevenen magnetische kraal (SAMB). Teneinde de doeltreffendheid van de schorsing en de dispersie, is het aanbevolen om in te stellen van de kraal concentratie tussen 2% en 10% (v/v). Tijdens de bereiding van de monsters, het gebruik van buffers aangevuld met nonionic wasmiddel (zoals Triton X-100 of tween-20) maximaal 2% ook de naleving van de magnetische kralen van kunststof oppervlakken kan afnemen. De hechting van de parels aan de muren van monster flesjes kan worden vermeden als de kraal schorsingen zorgvuldig worden toegepast op de bodems van de flesjes in plaats van op de wanden van de buizen van de steekproef. De homogeniteit van de magnetische kralen tijdens de enzymatische reactie is ook essentieel en kan worden gewaarborgd door voortdurend schudden van de monsters bij 600 omwentelingen per minuut tijdens de incubatie. Kralen zijn goed verspreid in afgeronde of platbodem plastic waren, terwijl het gebruik van V-bodem flesjes wordt niet aanbevolen. Een suboptimaal resultaat veroorzaakt door onjuiste kraal homogenisering wordt weergegeven in figuur 4B. II) beëindiging van monsters van de reactie. Een ander voordeel van de methode is dat de enzymatische reactie kan worden beëindigd zonder het gebruik van denaturatie warmtebehandeling of een potentieel storende chemische agentia¹⁵. De beëindiging kan eenvoudig door het scheiden van de magnetische kralen van het reactiemengsel, met behulp van een conventionele magnetische deeltjes concentrator worden uitgevoerd. Terwijl de verwijderde reactie buffer het actieve enzym en de gegenereerde fluorescerende splitsingsproducten van C-terminal bevat, blijven de uncleaved substraten verbonden met de kralen. Als gevolg van de aanwezigheid van het actieve enzym in de buffer van de reactie moet de procedure van de scheiding zorgvuldig worden uitgevoerd voor betrouwbare eindpunt detectie. Vóór het plaatsen van de steekproef flesjes in de concentrator, is het raadzaam toe te passen van een korte draai centrifugeren. Na het plaatsen van de buizen in de concentrator, verstrekken ten minste 15 s voor de kralen te verzamelen. Lichte beweging van het scheidingsteken heen-en-weer kan het vergemakkelijken van de collectie van de parels. Bedenk dat, tijdens een handmatig uitgevoerd scheiding, de beëindiging meestal langer dan de opening van de reacties duurt. Daarom verdient een circa 2 min geregistreerd vertraging tussen de inwijdingen als het dezelfde incubatietijd moet worden toegepast op alle monsters.

Het principe van de beschreven Proteolytische test is relatief eenvoudig; echter, de veelzijdigheid van het systeem wordt gegarandeerd door de structuur van de flexibele en stabiele ondergrond. De individuele optimalisatie van de test kan worden alleen beperkt door de verenigbaarheid van de parels van affiniteit met de toegepaste voorwaarden, reagentia en additieven. Wij vonden ook in overleg met de fabrikant protocol, dat de binding van de affiniteit van substraten op de Ni-NTA kraal oppervlakken aanzienlijk bij pH ≤ 6,5^{15 verzwakt}. Daarom wordt aanbevolen om het substraat blancomonsters parallel aan de monsters van de reactie van de toepassing, en het tempo van de spontane substraat dissociatie moet worden overwogen bij de beoordeling van de resultaten.

In die gevallen, waar magnetische-kraal-gebaseerde testen kunnen niet worden uitgevoerd als gevolg van het gebruik van componenten van de kraal-onverenigbaar of een lage pH, zijn vertering van de in-oplossing van de gezuiverde recombinante substraten ook toepasbaar. In deze gevallen de reactie mengsels kunnen door elektroforese worden geanalyseerd en de eiwitten kunnen worden gevisualiseerd in de gel op basis van het protocol beschreven. Om te onderzoeken proteolytic activiteit, in-oplossing spijsvertering en in-gel detectie van de eiwitten kunnen ook alternatieve instrumenten van fluorimetrie. Een nieuwigheid van het systeem ontworpen substraat is de toepassing van een in-gel renaturatie stap na de denaturering van SDS-pagina. Terwijl native (nondenatured) TL eiwitten hun fluorescentie tijdens elektroforese behouden, wordt de fluorescerende eigenschap afgeschaft na denaturatie (figuur 7B). Echter kan de fluorescentie van gedenatureerde eiwitten gedeeltelijk worden hersteld door de verwijdering van SDO van de gel. Dus, een scheiding van componenten van de reactie denatureren voorwaarden gebruiken niet alleen de fluorescentie-gebaseerd maar de moleculaire gewicht gebaseerde identificatie mogelijk maakt. Een ander voordeel van de tl in-gel-detectie in vergelijking met de analyse van een gel Coomassie gebeitste is dat de (native of renatured) fluorescente proteïnen in de gel op basis van hun fluorescentie gemakkelijk geïdentificeerd kunnen worden (Zie Figuur 7). Dit kan belangrijk zijn als decollete reacties worden uitgevoerd op monsters met nonfluorescent verontreinigingen of eiwitten zeer gelijkend op het molecuulgewicht van elkaar.

Protease testen gebruiken op dezelfde manier ontworpen substraten zijn al eerder gepubliceerd⁸^,⁹^,¹⁰, en hoewel de breukzijde van belang in die gevallen ook gelegen tussen een affiniteit tag was en een fluorescent proteïne, het systeem van de assay gepresenteerd hier niet alleen herhaalt de beschreven ideeën maar combineert de verschillende voordelen van de vorige platforms en voltooit u hen ook met verdere verbeteringen: i) het gebruik van een MBP fusie partner, ii) de aanwezigheid van een TEV PR controle breukzijde, iii) het gebruik van de nieuw aangelegde monomeer FPs, en iv) de toepassing van een uniek substraat kalibratieprocedure. De bepaling zelf is met name nuttig voor het enzym specificiteit en kinetische studies in een veilige, tijd – en kosten-efficiënte wijze, zonder de noodzaak voor dure instrumentation ontworpen. De methode is bedoeld om een geschikte en betaalbare tool voor zowel industriële en academische onderzoeksdoeleinden. Vanwege de flexibiliteit van het ‘klonen ‘cassette van de expressie plasmide mogelijk het systeem geschikt voor het snelle en goedkope generatie van recombinante substraat bibliotheken. De hierin beschreven test is een mogelijk instrument voor de uitvoering van substraat specificiteit, enzym mutagenese, en remming bestudeert en geven ook een alternatief instrument voor het uitvoeren van de enzymkinetiek. Het platform assay (van de verstoring van de bacteriële cel voor de bepaling van de kinetische parameters) kan worden aangepast aan een HTS en automatisering-gebaseerde omgeving en, potentieel, kan worden toegepast in industriële protease inhibitor screening en/of antivirale geneesmiddelen ontwikkeling. Bovendien, is de aanpassing van de assay voor concurrerende proteolyse ook in de toekomst onder ons laboratorium. In een dergelijke concurrerende assay, twee verschillende substraten-geheugen voor elke bevattende een verschillende breukzijde gesmolten tot een verschillende C-terminal fluorescerende tag-zijn bedoeling te onderzoeken van de voorkeur van de bestudeerde gelijktijdig in dezelfde decollete reactie worden gebruikt enzym voor de gegeven doel sequenties. Bovendien, het gebruik van een 96-wells-plaat aangepast assay formulier (Figuur 8) ook wordt geoptimaliseerd voor mutatie screening met behulp van een reeks van substraten met gemodificeerde decollete site sequenties in geval van cysteïne proteasen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk was gedeeltelijk ondersteund door de GINOP-2.3.2-15-2016-00044 “PHARMPROT teamwork” project en, ook, gefinancierd door het hogeronderwijs institutionele Excellence programma van het ministerie van menselijke capaciteiten in Hongarije, in het kader van de Biotechnologie thematische programma van de Universiteit van Debrecen. De auteurs zijn dankbaar voor de leden van het laboratorium van retrovirale biochemie voor hun wetenschappelijke hulp tijdens de assay ontwikkeling en ook voor hun geduld tijdens het filmen van de bepaling (vooral voor Norbert Kassay, Krisztina Joóné Matúz en Vanda Toldi, die worden weergegeven op de achtergrond van de video). De auteurs ook wil speciale dankzij Gédéon Richter Plc., vooral aan de Dr. Zoltán Urbányi voor het toestaan van Beáta Bozóki van werk in het departement van biochemie en moleculaire biologie als een gastonderzoeker. De auteurs ook wil hun dankbaarheid aan György Zsadányi, Balázs Tőgyi, Balázs Pöstényi en Zoltán Király van de Multimedia- en E-learning Technical Center van de Universiteit van Debrecen voor de professionele hulp in audio en video productie.

Materials

10K Amicon tubes	Merck-Millipore	UFC501096
2-Mercaptoethanol (β-ME)	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	M6250
40% Acrylamide/Bis solution 37.5:1	Bio-Rad	1610148
Acetic acid	Merck	100063
Agarose	SERVA	11404.04
Alpha Imager HP gel documentation system	ProteinSimple
Ammonium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	A3678
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	A9518
Beckman Coulter Allegra X-22 centrifuge	Beckman Coulter	392185
Black half-area plates	Greiner bio-One	675086
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	B0126
CutSmart buffer (10x)	New England Biolabs	B7204S	For plasmid linearization (step 1.1.1)
Dark Reader transilluminator	Clare Chemical Research	DR-45M
DNase I	New England Biolabs	M0303L
Dynamag-2 magnetic particle concentrator	Thermo Fischer Scientific	12321D
Escherichia coli BL21(DE3) competent cells	Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)	C600003
Ethanol	Merc-Millipore	100983
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	798681
Gel Loading Dye, Purple (6X)	New England Biolabs	B7024S
Glycerol	Merck	356350
Glycine	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	G7126
High-Speed Plasmid Mini Kit	GeneAid	PD300
Imidazole	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	56750
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)	AM9464
Jouan CR 412 centrifuge	Jouan	CR412
Labinco LD-76 Rotator	Labinco	7600
Luria-Bertani (LB) broth	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	L3022
Lysozyme	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	L6876
Magnesium chloride	Scharlau	MA0036
MERCK eurolab ultrasonic bath	MERCK	USR54H
Millifuge Eppendorf spin centrifuge	Millipore	CT10
Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell	Bio-Rad
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	T9281
NanoDrop 2000	Thermo Fischer Scientific
NheI-HF restriction endonuclease	New England Biolabs	R3131L
Nickel(II) sulfate (NiSO4)	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	656895
Ni-NTA magnetic agarose beads	Qiagen	36113
Orbital shaker	Biosan	OS-20
PacI restriction endonuclease	New England Biolabs	R0547L
PageBlue Protein Staining Solution	Thermo Fischer Scientific	24620
Phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	P7626
Protein Lobind Micro-centrifuge tubes	Eppendorf	22431102
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28704
Snijders Press-to-Mix shaker	Gemini	34524
Sodium-acetate trihydrate	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	S7670
Sodium-chloride	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	S9888
Sodium-hydroxide	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	S5881
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain	Thermo Fischer Scientific	S7563
T4 DNA ligase	Promega	M180A
Thermo shaker	Biosan	TS-100	with SC-24 accessory block
Tris	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	T1503
Tween 20	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	P2287
WALLAC VICTOR2 1420 multilabel counter	Wallac Oy, Turku, Finland

References

Meldal, M. Smart Combinatorial Assays for the Determination of Protease Activity and Inhibition. Molecular Informatics. 24 (10), 1141-1148 (2005).
Rao, M. B., Tanksale, A. M., Ghatge, M. S., Deshpande, V. V. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (3), 597-635 (1998).
Zhang, G., Sittampalam, G. S., et al. Protease assays. The Assay Guidance Manual. , (2012).
Woelcke, J., Hassiepen, U., Chen, T. Fluorescence-based biochemical assay formats. A Practical Guide to Assay Development and High-Throughput Screening in Drug Discovery. , (2010).
Richardson, P. L. The determination and use of optimized protease substrates in drug discovery and development. Current Pharmaceutical Design. 8 (28), 2559-2581 (2002).
Diamond, S. L. Methods for mapping protease specificity. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 46-51 (2007).
Schilling, O., Overall, C. M. Proteome-derived, database-searchable peptide libraries for identifying protease cleavage sites. Nature Biotechnology. 26 (6), 685-694 (2008).
Askin, S. P., Morin, I., Schaeffer, P. M. Development of a protease activity assay using heat-sensitive Tus-GFP fusion protein substrates. Analytical Biochemistry. 415 (2), 126-133 (2011).
Chaparro-Riggers, J. F., Breves, R., Michels, A., Maurer, K. H., Bornscheuer, U. A GFP based assay for the determination of hydrolytic activity and substrate specificity of subtilisins under washing conditions. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 35, 74-77 (2005).
Patel, D., Frelinger, J., Goudsmit, J., Kim, B. In vitro assay for site-specific proteases using bead-attached GFP substrate. Biotechniques. 31 (5), 1194-1198 (2001).
Branchini, B. R., et al. Sequential bioluminescence resonance energy transfer-fluorescence resonance energy transfer-based ratiometric protease assays with fusion proteins of firefly luciferase and red fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 414 (2), 239-245 (2011).
Zhou, C., Yan, Y., Fang, J., Cheng, B., Fan, J. A new fusion protein platform for quantitatively measuring activity of multiple proteases. Microbial Cell Factories. 13 (1), 44 (2014).
Fox, J. D., Waugh, D. S. Maltose-binding protein as a solubility enhancer. Methods in Molecular Biology. 205, 99-117 (2003).
Bozóki, B., et al. A recombinant fusion protein-based, fluorescent protease assay for high throughput-compatible substrate screening. Analytical Biochemistry. 540-541, 52-63 (2018).
Mótyán, J. A., Miczi, M., Bozóki, B., Tözsér, J. Data supporting Ni-NTA magnetic bead-based fluorescent protease assay using recombinant fusion protein substrates. Data in Brief. 18, 203-208 (2018).
Balleza, E., Kim, J. M., Cluzel, P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nature Methods. 15, 47-51 (2018).
Hebisch, E., Knebel, J., Landsberg, J., Frey, E., Leisner, M. High variation of fluorescence protein maturation times in closely related Escherichia coli strains. PLoS One. 8, e75991 (2013).
Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering, Design and Selection. 14, 993-1000 (2001).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Bozóki, B., Mótyán, J. A., Miczi, M., Gazda, L. D., Tőzsér, J. Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation. J. Vis. Exp. (143), e58824, doi:10.3791/58824 (2019).

Automatically Generated