استخدام البروتينات الانصهار المؤتلف في منصة فحص حوزتي فلورسنت وما ريناتوريشن في جل
Summary
وهنا، نقدم الإجراءات المفصلة من منصة الفحص حوزتي وضعت مؤخرا الاستفادة من الطرفي ن هيكساهيستيديني/مالتوس-ملزمة البروتين ونيون ركائز المؤتلف تنصهر البروتين تعلق على سطح النيكل-نيتروتراياكتيك حمض [اغروس] المغناطيسي الخرز. ويرد أيضا تحليل العينات المقايسة مفصولة بالصوديوم دوديسيل كبريتات-polyacrylamide هلام التفريد في جل لاحقة.
Abstract
البروتياز هي الإنزيمات دراسة مكثفة بسبب أدوارها الأساسية في عدة مسارات البيولوجي للكائنات الحية والمرضية؛ ولذلك، فأهداف هامة من المخدرات. قمنا بتطوير منصة المغناطيسي [اغروس]–حبة–على أساس مقايسة لتحقيق نشاط بروتيوليتيك، التي تستند إلى استخدام ركائز البروتين الانصهار المؤتلف. من أجل التدليل على استخدام هذا النظام المقايسة، يرد بروتوكول على سبيل مثال نوع فيروس نقص المناعة البشرية 1 (فيروس نقص المناعة البشرية-1) البروتياز. منصة عرض المقايسة يمكن الاستفادة من كفاءة في توصيف البيوكيميائية من البروتياز، بما في ذلك قياس نشاط الإنزيم في الطفرات، الحركية أو إعاقة أو الدراسات النوعية، وأنها قد تكون مناسبة للفائق فحص الركيزة أو يمكن أن تتكيف مع سائر الإنزيمات بروتيوليتيك.
في هذا النظام المقايسة، ركائز التطبيقية تحتوي على الطرفي ن هيكساهيستيديني (له6) وعلامات البروتين (MBP) ملزمة مالتوس، مواقع الانقسام للتبغ أحفر البروتياز فيروس نقص المناعة البشرية-1، الفيروس (الإجمالية) وبروتين فلوري ج–المحطة طرفية. يمكن أن تنتج كفاءة في خلايا الإشريكيّة القولونية ركائز وتنقيتها بسهولة باستخدام الخرز المطلي-تشيلاتي-نيكل (ني). أثناء الفحص، والانقسام بروتيوليتيك من ركائز تعلق حبة يؤدي إلى الإفراج عن شظايا الانقسام الفلورسنت، والتي يمكن أن تقاس فلوريميتري. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحليل ردود فعل الانقسام بالصوديوم دوديسيل كبريتات-polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة). كما يتم وصف بروتوكول ريناتوريشن في جل مكونات المقايسة، كما ريناتوريشن الجزئي للبروتينات الفلورية يمكن الكشف عنها على أساس الوزن الجزيئي والأسفار.
Introduction
الإنزيمات proteolytic ينتمون إلى المجموعات الإنزيم الأكثر كثافة التحقيق نظراً لأهميتها في الأيضية والتطبيقات الصناعية، كذلك. دورهم الرئيسي في الأمراض الفيروسية، وتنظيم تخثر، سرطان الدم والقلب والأوعية الدموية وأمراض الأعصاب يجعل البروتياز أهداف بارزة في مجال اكتشاف الأدوية. ولذلك، وصف مفصل لخصوصية الركيزة ومثبط توصيفها حوزتي (PR) من اهتمام محوري ويفضل أن يؤديها فحوصات الكيمياء الحيوية سريعة وفعالة من حيث التكلفة، وقوى1،2، 3.
في الوقت الحاضر، هي الغالبية العظمى من فحوصات في المختبر حوزتي المطبقة في مجال اكتشاف الأدوية للتنميط مجمع متجانسة، فلوري المستندة إلى الببتيد، والفائق الفحص (HTS)-منصات متوافقة4. وعلاوة على ذلك، الببتيدات المسمى ليست مناسبة لفحص المكتبة فقط، ولكن كما أنها توفر أدوات عظيمة لتحديد الإنزيم معلمات الحركية على ركائز المحدد. وفي حالات أخرى، حيث وضع العلامات من الركازة من غير الممكن، فحوصات المستندة إلى الفصل قد توفر حلاً ممكناً لتقييم الخصائص الحركية لردود الفعل proteolytic3.
عموما، تستند حوزتي في المختبر فحوصات على استخدام نوعين من الركازة: قصيرة الببتيدات أو بروتينات كاملة. وتطبق في هذه الحالات، حيث الانقسام وتسلسلات ببتيد قصيرة تعكس خصائص الانقسام بما فيه الكفاية، بالأساليب القياسية التالية: (ط) دراسة ركازات البروتين القياسية مثل الأنسولين المؤكسد ب-سلسلة، (ثانيا) اختبار ركائز المتاحة تجارياً من البروتياز الأخرى، (ثالثا) فحص مكتبات الببتيد الاصطناعية والمسمى فلوريسسينتلي تم إنشاؤها بواسطة الكيمياء التوافيقيه، أو (رابعا) باستخدام الطرق الوراثية، على سبيل المثال، البيولوجية عرض تكنولوجيات5، 6. بالإضافة إلى التصنيف التقليدي، منصات رواية أخرى متاحة أيضا لتوليد الركازة (مثلاً، تشكيل المستمدة من البروتين الببتيد المكتبات7 أو الأنواع الفرعية الخاصة الأساليب الوراثية، مثل الانصهار المؤتلف ركائز أساس البروتين8،9،10،،من1112).
جميع الأنواع المذكورة أعلاه الركيزة وفحوصات المزايا والقيود الخاصة بها، ووضع مقايسة صيغ الجمع و/أو تحسين مزايا المنصات المعروفة لا تزال في الطلب. هنا يمكننا وصف بروتوكول مقايسة المستندة إلى فصل مبطلات فلورسنت، الذي يستخدم ركائز المؤتلف. تتكون هذه البروتينات الانصهار6 والعلامات MBP تنصهر إلى موقع انقسام وتحكم العلاقات العامة الإجمالية، التي تبعتها تسلسل الركيزة للفائدة التي ترتبط ارتباطاً مباشرا بروتين ج-طرفية فلورسنت (FP) (الشكل 1A). يمكن أن يؤديها استنساخ تسلسل الحمض النووي الترميز لموقع انقسام من الفائدة في الكاسيت ‘الاستنساخ’ بفعل عملية ربط واحدة إلى بلازميد التعبير، التي قد تم خطيا مسبقاً بتقييد اندونوكليسيس.
رقم 1: مبدأ المقايسة حوزتي الفلورسنت. يظهر البروتياز (A) التمثيل التخطيطي من الركازة فلورسنت والانقسام حسب النوع 1 من فيروس نقص المناعة البشرية (فيروس نقص المناعة البشرية-1). يشير السهم إلى موقف الانقسام داخل تسلسل الموقع الانقسام مصفوفة/قفيصه حوزتي فيروس نقص المناعة البشرية-1 (فسقني * بيفق). (ب) فلوري ركائز يمكن استخدامها لتحليل التفاعلات إنزيم المقايسة المغناطيسي على أساس حبة ني-الإدارة الوطنية للسياحة، وجل polyacrylamide التفريد، كذلك، كما هو مبين في الرسم التخطيطي لسير العمل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
على الرغم من أن فحوصات proteolytic استخدام البروتين المؤتلف مماثلة الركازات المحتوية على علامة تقارب وموقع انقسام proteolytic فلورسنت بروتين يكون الفعل قد وصف9،،من810، والنظام قدم هنا وتعتزم دمج وتحسين المزايا لهذه الأساليب. فارق هام أن ركائز البروتين الانصهار في هذا المنبر الإنزيم مجهزة MBP تعزيز القابلية للذوبان بروتين13 وتحتوي على موقع انقسام والسيطرة للحد من الفقر TEV. وعلاوة على ذلك، تحتوي ركائز البروتينات الفلورية الجيل الجديد، وهي مستقرة جداً وقد شكل أحادي لمنع التراكم الركازة. بالإضافة إلى تطبيق أشكال mTurquoise2 و mApple تنصهر14المنشورة سابقا، هنا نعرض أيضا تعزيز النتائج نظراً لاستخدام الركيزة التوليفية التي تحتوي على أحادي علامة نيون بروتين فلوري الصفراء (مييفب). بموجب هذا إثبات توافق النظام مع غيرها من البروتينات الفلورية، وتمثل بعض الأنواع العامة للنتائج التي يمكن اكتسابها من خلال فحص البروتياز.
يتم التعبير عنها في الخلايا BL21(DE3) كولاي البروتينات الانصهار المؤتلف وتستخدم كركائز للانزيم في حمض نيكل-نيتروتراياكتيك (ني-الإدارة الوطنية للسياحة)-المغلفة المغناطيسي [اغروس]-حبة-المرفقة بالنموذج. منتجات الانقسام الطرفي ج حررتها حوزتي الفائدة من سطح حبة إلى المادة طافية على الانقسام. بعد فصل المادة طافية (التي تحتوي على الإنزيم ومنتجات الانقسام) عن الخرز المغناطيسية، يمكن أن تقاس الأسفار لتحديد خصائص الإنزيم الانقسام. على النقيض من الأساليب الموصوفة سابقا، في منظومة المقدمة هنا، مبالغ الركيزة ومنتجات الانقسام الطرفي ج فريد كمياً استناداً إلى إجراء معايرة الركازة مفصلة. يمكن أن تدعم نظام مقايسة الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحليل عينات الفحص؛ يمكن تطبيق مجموعة مرئيات في جل فلورسنت لاحقة فورا بعد التفريد أو بعد ريناتوريشن في جل مكونات الفلورسنت نونديناتوريد والتشويه والتحريف، على التوالي14.
المرونة والهيكل للكاسيت ‘الاستنساخ’ تسمح إدراج كفاءة من حيث وقت وتكاليف من مجموعة متنوعة واسعة من التسلسلات في بنية، وهكذا، يعزز توليد مكتبات الركيزة. نظراً لجميع خطوات الفحص الآلي و HTS-متوافق مع، النظام يمكن أن تكون جاذبية خاصة، على سبيل المثال، مبطلات خصوصية القياسات والدراسات الطفرات، أو أنها قد أيضا فعالية ستستخدم لفحص مثبطات البروتياز الصناعية و/أو تطوير العقاقير المضادة للفيروسات، كذلك.
يمكن تحديد معلمات الحركية إنزيم (كالقط، كم) بواسطة المقايسة القائم على الفصل بين البلدان المتقدمة النمو؛ لذلك، قد يكون مناسباً لإجراء قياسات حركية إنزيم الفردية، مثل دراسات الوقت بالطبع، وتعتمد على الركيزة، وتثبيط. وهذا يثبت أن ركائز البروتين الانصهار المؤتلف توفير بدائل جيدة لركائز أوليجوبيبتيدي الاصطناعية المستخدمة في كثير من الأحيان، ونظرا للتشابه عالية على ركائز بوليبروتين، وهي تمثل تحدث بشكل طبيعي التفاعلات إنزيم-الركيزة أكثر دقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
بسبب التحقيقات المكثفة الصناعية والأكاديمية للإنزيمات بروتيوليتيك والطلب المستمر على منصات المقايسة حوزتي المتوافقة مع HTS سريعة وبأسعار معقولة تبعاً لذلك، قمنا بتطوير حوزتي فلورسنت المستندة إلى حبة المغناطيسي المقايسة. التحليل يستند إلى استخدام الانصهار المؤتلف البروتينات التي يمكن أن تكون بدائل مبتكرة لركائز الببتيد الاصطناعية تستخدم على نطاق واسع.
في تنسيق التحليل المتقدمة، هي معطلة ركائز البروتين الانصهار إلى أسطح حبات شيﻻت المغلفة ني [اغروس] مغنطيسية. المرفق الركازة توفرها N–المحطة الطرفية له علامة تقارب6 من البروتين الانصهار، الذي هو تنصهر فيها مباشرة إلى علامة MBP بغية تيسير قابلة للطي وتحسين قابلية الذوبان في الماء من الركازة13. MBP متبوعاً حوزتي من الفائدة ومواقع الانقسام TEV العلاقات العامة. السابقة قد تخدم كموقع انقسام وتحكم في الفحص، بينما هذا الأخير يمكن معالجته بواسطة مبطلات التحقيق. موقع الانقسام وقابلة للتبادل؛ يمكن إدراج تسلسل دسدنا قصيرة الترميز لموقع الانقسام من الفائدة في مرنة ‘كاسيت الاستنساخ’ من بلازميد التعبير بربط. تحتوي على بروتينات الانصهار المؤتلف علامة البروتينات فلورية العالية مستقرة وأحادي في ج-المحطة، التي تمكن من كشف نقطة نهاية الانقسام ج-الطرفية إنزيم المحررة، فلورسنت المنتجات الإفراج عنها عند الانقسام بروتيوليتيك ( الشكل 1A). ركائز سليمة الفلورسنت المنقي حلها في مخازن مختلفة تستخدم أيضا للمعايرة لتقييم تركيزات المولى من ركائز ومنتجات الانقسام. وبالإضافة إلى ذلك، بعد فلوريميتري، مكونات الإنزيم يمكن تحليلها بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة، كذلك. كلا أصلي (نونديناتوريد) والبروتينات الفلورية التشويه والتحريف يمكن تصور في الهلام، مباشرة بعد التفريد أو بعد اللاحقة في جل ريناتوريشن، على التوالي. هذا إضافية في الإجراء مع تقليدية “أخذ الأزرق الرائعة” تلطيخ-قد يكون يمكن استخدام التركيبة كفاءة لتحقق نتائج الفحص (الشكل 1B).
إجراء المقايسة يتكون من خطوات بسيطة وسهلة لتنفيذ في تنسيق صغيرة الحجم التي قد تكون مناسبة تماما لبيئة تلقائي الفائق. ومع ذلك، بشكل مستقل من القيام التحليل أما يدوياً أو باستخدام نظام التشغيل الآلي للمكاتب، الأجزاء التالية من الفحص تعتبر أمرا حاسما، وتحتاج إلى عناية خاصة أثناء تنفيذ الإجراء. ط) التجانس الحل حبة المغناطيسي. يجب أن تستخدم حلاً حبة مغناطيسية متجانساً في جميع أنحاء المقايسة، سواء في تنقية وغسل الخطوات. خاصة، بقوة موثوقية فحوصات حوزتي يعتمد على اليقوتينج بشكل صحيح الحلول الأسهم المرفقة بالركيزة حبة المغناطيسي (سامب). من أجل زيادة فعالية تعليق والتشتت، يوصي بتعيين تركيز حبة بين 2% و 10% (v/v). أثناء إعداد نموذج، الاستخدام المخازن المؤقتة وتستكمل مع المنظفات النطاق (مثل X-100 تريتون أو 20 توين) يصل إلى 2% قد ينخفض أيضا انضمام الخرز المغناطيسية على الأسطح البلاستيكية. يمكن تجنبها من الخرز التمسك بجدران قنينات العينات إذا طبقت المعلقات حبة بعناية لقيعان قنينة بدلاً من على جدران أنابيب العينة. تجانس الخرز المغناطيسي أثناء عملية التفاعل الأنزيمي أمر بالغ الأهمية أيضا، ويمكن ضمان استمرار اهتزاز العينات 600 لفة في الدقيقة أثناء الحضانة. حبات متناثرة بشكل صحيح في تقريب أو مغلوطاً والمنتجات البلاستيكية، بينما لا ينصح باستخدام قارورة الخامس-السفلي. يمثل نتيجة الأمثل الناجمة عن حبة غير لائق التجانس في الشكل 4B. ثانيا) إنهاء عينات رد فعل. وهناك ميزة أخرى للأسلوب أن رد الفعل الأنزيمي يمكن أن تنتهي دون استخدام المعالجة الحرارية تمسخ أو أي عوامل كيميائية يحتمل أن تدخل15. يمكن أن يتم الإنهاء ببساطة عن طريق فصل الخرز المغناطيسي من رد فعل المخلوط باستخدام مركز جسيمات مغناطيسية تقليدية. بينما يحتوي المخزن المؤقت إزالة رد فعل الإنزيم النشط والمنتجات الانقسام الفلورسنت ج–المحطة الطرفية التي تم إنشاؤها، ركائز أونكليفيد لا تزال تعلق الخرز. نظراً لوجود إنزيم نشط في المخزن المؤقت لرد الفعل، يحتاج الإجراء الفاصل الذي سيتم تنفيذه بعناية للكشف عن نقطة النهاية موثوق بها. قبل وضع قنينات العينات إلى مركزات، يوصي بأن تطبق الطرد المركزي تدور قصيرة. بعد وضع الأنابيب في مركزات، توفر على الأقل 15 ثانية الخرز التي سيتم جمعها. قد تسهل حركة طفيفة في الفاصل ذهابا وإيابا جمع الخرز. يرجى النظر، أثناء فصل يدوياً المؤداة، الإنهاء عادة ما يستغرق وقتاً أطول من الشروع في ردود الفعل. ولذلك ينصح تأخير حوالي 2 دقيقة مسجلة بين المبدئية إذا نفس الوقت الحضانة يجب أن تطبق على جميع العينات.
مبدأ المقايسة proteolytic وصف بسيط نسبيا؛ ومع ذلك، براعة النظام مكفول بموجب هيكل الركازة مرنة ومستقرة. قد تكون محدودة الأمثل المقايسة الفردية إلا بتوافق الخرز تقارب مع الشروط المطبقة، الكواشف والمواد المضافة. الاتفاق مع البروتوكول الشركة المصنعة على، كما وجدنا أن ملزمة تقارب من ركائز للسطوح حبة ني-جاتا يضعف إلى حد كبير على درجة الحموضة ≤ 6.515. لذلك، من المستحسن تطبيق الركازة عينات فارغة موازية للعينات رد فعل، ويتطلب معدل تفكك الركازة العفوية التي سينظر فيها خلال تقييم النتائج.
في تلك الحالات، حيث لا يمكن إجراء فحوصات المستندة إلى حبة المغناطيسي بسبب استخدام مكونات حبة-متوافق أو درجة حموضة منخفضة، يمكن أيضا تطبيق الهضم في حل من ركائز المؤتلف المنقي. وفي هذه الحالات، يمكن تحليل الخلائط رد فعل بالتفريد، ويمكن تصور البروتينات في جل استناداً إلى البروتوكول بوصفه. للتحقيق في نشاط proteolytic، الهضم في الحل والكشف في جل من البروتينات قد يكون أيضا أدوات بديلة من فلوريميتري. بدعة نظام الركيزة مصممة هو تطبيق خطوة ريناتوريشن في جل بعد يشوه صفحة الحزب الديمقراطي الصربي. بينما البروتينات الفلورية (نونديناتوريد) الأصلية الاحتفاظ بهم الأسفار أثناء التفريد، هو إلغاء الملكية الفلورسنت عند تمسخ (الشكل 7). ومع ذلك، يمكن استرداد الأسفار البروتينات التشويه والتحريف جزئيا بإزالة مخزونات النشر الاستراتيجي من الجل. وهكذا، يجعل فصل بين مكونات رد الفعل باستخدام شروط يشوه القائم على الأسفار، بل تحديد أساس الوزن الجزيئي ممكن. ميزة أخرى للكشف في جل الفلورسنت مقارنة لتحليل هلام الملطخة بأخذ أن البروتينات الفلورية (أصلية أو ريناتوريد) يمكن تحديدها بسهولة في جل استناداً إلى هذه الأسفار (انظر الشكل 7). قد يكون هذا مهم إذا كان يتم تنفيذ الانقسام وردود الفعل في العينات المحتوية على ملوثات نونفلوريسسينت أو بروتينات عالية تشبه الأوزان الجزيئية لبعضها البعض.
فحوصات حوزتي استخدام ركائز مصممة على نحو مماثل قد تم بالفعل سبق نشرة9،،من810، وعلى الرغم من أن الموقع الانقسام والاهتمام بالحالات التي كانت تقع بين علامة تقارب أيضا الفلورسنت البروتين، منظومة التحليل المقدم هنا ليس فقط تكرار الأفكار التي توصف ولكن يجمع بين مزايا مختلفة من المنصات السابقة وأيضا يكمل لهم مع إدخال مزيد من التحسينات: ط) الاستفادة من شريك الانصهار MBP، ثانيا) وجود العلاقات العامة TEV التحكم الانقسام وموقع، ثالثا) استخدام FPs أحادي هندسيا حديثا، ورابعاً) تطبيق إجراء المعايرة الركازة فريدة من نوعها. المقايسة نفسها خاصة صممت لتكون مفيدة لأنزيم خصوصية والدراسات الحركية في آمنة وطريقة فعالة من حيث الوقت والتكاليف، دون الحاجة إلى أجهزة باهظة الثمن. الأسلوب الذي يهدف إلى أن يكون أداة ملائمة وميسورة التكلفة لأغراض البحوث الصناعية والأكاديمية على حد سواء. نظراً لمرونة الكاسيت ‘الاستنساخ’ من بلازميد التعبير، قد يكون النظام مناسب لتوليد سريعة وغير مكلفة لمكتبات الركازة المؤتلف. الفحص الموصوفة هنا أداة مجدية لتنفيذ الركيزة خصوصية، إنزيم الطفرات، وتثبيط الدراسات وأيضا، أن توفر أداة بديلة لأداء حركية إنزيم. منصة الفحص (من اضطراب الخلايا البكتيرية في تحديد معالم الحركية) يمكن أن تتكيف مع بيئة المستندة إلى HTS والتشغيل الآلي للمكاتب، ويحتمل أن تكون، قد تطبق في فحص مثبطات البروتياز الصناعية و/أو العقاقير المضادة للفيروسات التنمية. وباﻹضافة إلى ذلك، تكييف المقايسة ل proteolysis التنافسية أيضا في المستقبل نطاق المختبر. في هذه مقايسة تنافسية، اثنين مختلفة كل ركائز المحتوية على موقع انقسام مختلفة تنصهر فيها مختلفة ج-طرفية فلورسنت علامة-هي يقصد بها لاستخدامها في وقت واحد في نفس الانقسام ورد الفعل للتحقيق في تفضيل درس إنزيم لمتواليات هدف معين. وعلاوة على ذلك، استخدام نموذج المقايسة تكييف لوحة 96-جيدا (الشكل 8) هو أيضا يجري الأمثل لفحص الطفرات باستخدام سلسلة من ركائز مع الانقسام وتعديل تسلسل الموقع في حالة البروتياز سيستين.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها المشروع “فريق فارمبروت” جنوب-2-3-2-15-2016-00044 جزئيا، وأيضا، بتمويل من “برنامج التميز المؤسسي في التعليم العالي” من الوزارة من القدرات البشرية في هنغاريا، في إطار برنامج التكنولوجيا الحيوية المواضيعية من جامعة ديبريسين. الكتاب ممتنون للأعضاء في “مختبر الكيمياء للفيروسات الرجعية” للمساعدة العلمية أثناء وضع المقايسة وأيضا على صبرهم خلال تصوير الفحص (خاصة على نوربرت كاساي، “كريستينا” Joóné Matúz وتولدي فاندا، منظمة الصحة العالمية هي التي تظهر في خلفية الفيديو). الكتاب أيضا أود أن أقول الخاص بفضل جيديون ريختر Plc.، لا سيما أن الدكتور زولتان Urbányi للسماح بعمل Beáta Bozóki في قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية كباحث ضيف. الكتاب تود أيضا أن يمدد امتنانهم جيورجي Zsadányi، Tőgyi بلازس، Pöstényi بلازس و Király زولتان من الوسائط المتعددة ومركز التعلم التقني لجامعة ديبريسين للمساعدة الفنية في الصوت والفيديو الإنتاج.
Materials
| 10K Amicon tubes | Merck-Millipore | UFC501096 | |
| 2-Mercaptoethanol (β-ME) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | M6250 | |
| 40% Acrylamide/Bis solution 37.5:1 | Bio-Rad | 1610148 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | |
| Agarose | SERVA | 11404.04 | |
| Alpha Imager HP gel documentation system | ProteinSimple | ||
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | A3678 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | A9518 | |
| Beckman Coulter Allegra X-22 centrifuge | Beckman Coulter | 392185 | |
| Black half-area plates | Greiner bio-One | 675086 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | B0126 | |
| CutSmart buffer (10x) | New England Biolabs | B7204S | For plasmid linearization (step 1.1.1) |
| Dark Reader transilluminator | Clare Chemical Research | DR-45M | |
| DNase I | New England Biolabs | M0303L | |
| Dynamag-2 magnetic particle concentrator | Thermo Fischer Scientific | 12321D | |
| Escherichia coli BL21(DE3) competent cells | Thermo Fischer Scientific (Invitrogen) | C600003 | |
| Ethanol | Merc-Millipore | 100983 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | 798681 | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glycerol | Merck | 356350 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | G7126 | |
| High-Speed Plasmid Mini Kit | GeneAid | PD300 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | 56750 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fischer Scientific (Invitrogen) | AM9464 | |
| Jouan CR 412 centrifuge | Jouan | CR412 | |
| Labinco LD-76 Rotator | Labinco | 7600 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | L3022 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | L6876 | |
| Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
| MERCK eurolab ultrasonic bath | MERCK | USR54H | |
| Millifuge Eppendorf spin centrifuge | Millipore | CT10 | |
| Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell | Bio-Rad | ||
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | T9281 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fischer Scientific | ||
| NheI-HF restriction endonuclease | New England Biolabs | R3131L | |
| Nickel(II) sulfate (NiSO4) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | 656895 | |
| Ni-NTA magnetic agarose beads | Qiagen | 36113 | |
| Orbital shaker | Biosan | OS-20 | |
| PacI restriction endonuclease | New England Biolabs | R0547L | |
| PageBlue Protein Staining Solution | Thermo Fischer Scientific | 24620 | |
| Phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | P7626 | |
| Protein Lobind Micro-centrifuge tubes | Eppendorf | 22431102 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| Snijders Press-to-Mix shaker | Gemini | 34524 | |
| Sodium-acetate trihydrate | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | S7670 | |
| Sodium-chloride | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | S9888 | |
| Sodium-hydroxide | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | S5881 | |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Thermo Fischer Scientific | S7563 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M180A | |
| Thermo shaker | Biosan | TS-100 | with SC-24 accessory block |
| Tris | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | T1503 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | P2287 | |
| WALLAC VICTOR2 1420 multilabel counter | Wallac Oy, Turku, Finland |
References
- Meldal, M. Smart Combinatorial Assays for the Determination of Protease Activity and Inhibition. Molecular Informatics. 24 (10), 1141-1148 (2005).
- Rao, M. B., Tanksale, A. M., Ghatge, M. S., Deshpande, V. V. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (3), 597-635 (1998).
- Zhang, G., Sittampalam, G. S., et al. Protease assays. The Assay Guidance Manual. , (2012).
- Woelcke, J., Hassiepen, U., Chen, T. Fluorescence-based biochemical assay formats. A Practical Guide to Assay Development and High-Throughput Screening in Drug Discovery. , (2010).
- Richardson, P. L. The determination and use of optimized protease substrates in drug discovery and development. Current Pharmaceutical Design. 8 (28), 2559-2581 (2002).
- Diamond, S. L. Methods for mapping protease specificity. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 46-51 (2007).
- Schilling, O., Overall, C. M. Proteome-derived, database-searchable peptide libraries for identifying protease cleavage sites. Nature Biotechnology. 26 (6), 685-694 (2008).
- Askin, S. P., Morin, I., Schaeffer, P. M. Development of a protease activity assay using heat-sensitive Tus-GFP fusion protein substrates. Analytical Biochemistry. 415 (2), 126-133 (2011).
- Chaparro-Riggers, J. F., Breves, R., Michels, A., Maurer, K. H., Bornscheuer, U. A GFP based assay for the determination of hydrolytic activity and substrate specificity of subtilisins under washing conditions. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 35, 74-77 (2005).
- Patel, D., Frelinger, J., Goudsmit, J., Kim, B. In vitro assay for site-specific proteases using bead-attached GFP substrate. Biotechniques. 31 (5), 1194-1198 (2001).
- Branchini, B. R., et al. Sequential bioluminescence resonance energy transfer-fluorescence resonance energy transfer-based ratiometric protease assays with fusion proteins of firefly luciferase and red fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 414 (2), 239-245 (2011).
- Zhou, C., Yan, Y., Fang, J., Cheng, B., Fan, J. A new fusion protein platform for quantitatively measuring activity of multiple proteases. Microbial Cell Factories. 13 (1), 44 (2014).
- Fox, J. D., Waugh, D. S. Maltose-binding protein as a solubility enhancer. Methods in Molecular Biology. 205, 99-117 (2003).
- Bozóki, B., et al. A recombinant fusion protein-based, fluorescent protease assay for high throughput-compatible substrate screening. Analytical Biochemistry. 540-541, 52-63 (2018).
- Mótyán, J. A., Miczi, M., Bozóki, B., Tözsér, J. Data supporting Ni-NTA magnetic bead-based fluorescent protease assay using recombinant fusion protein substrates. Data in Brief. 18, 203-208 (2018).
- Balleza, E., Kim, J. M., Cluzel, P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nature Methods. 15, 47-51 (2018).
- Hebisch, E., Knebel, J., Landsberg, J., Frey, E., Leisner, M. High variation of fluorescence protein maturation times in closely related Escherichia coli strains. PLoS One. 8, e75991 (2013).
- Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering, Design and Selection. 14, 993-1000 (2001).
