בידוד ואפיון של האדם נגזר הטבור בתאי גזע Mesenchymal של לידה מוקדמת ותינוקות המונח
Summary
חבל הטבור אנושי (UC) ניתן להשיג במהלך תקופת הלידה כתוצאה מונח לידה מוקדמת, ולאחר postterm משלוח. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את בידוד ואפיון של UC-derived בתאי גזע mesenchymal (UC-MSCs) מן העוברים/תינוקות בגיל 19-40 שבועות של הריון.
Abstract
גזע mesenchymal (MSCs) יש הפוטנציאל הטיפולי ניכרת ולמשוך עניין גובר בתחום הביו-רפואי. MSCs הן במקור מבודדים מ מח עצם (מוניטור) ואז שנרכשה מן הרקמות כולל רקמת שומן, synovium, עור, שיניים זולה של תוספות בעובר השיליה, כגון דם טבורי (UCB), ושל חבל הטבור (UC). MSCs הם אוכלוסיה הטרוגנית תא עם יכולת הדבקות (1) פלסטיק בתנאים סטנדרטיים תרבות, סמן (2) משטח הביטוי של CD73+/CD90+/CD105+/CD45 /CD34––/CD14 /CD19– פנוטיפים /HLA-DR– –, בידול trilineage (3) לתוך adipocytes, osteocytes, chondrocytes, כיום שהוגדרו על-ידי האגודה הבינלאומית עבור טיפול הסלולר (ISCT). אמנם המקור הנפוצה ביותר של MSCs מוניטור, העיקרון החודרני של מוניטור השאיפה מגביל אתית הנגישות שלה. יכולת התפשטות ובידול של MSCs המתקבל מוניטור בדרך כלל ירידה של גיל התורם. לעומת זאת, העובר MSCs המתקבל UC יש יתרונות כגון התפשטות נמרצת וקיבולת בידול. אין שום חשש מוסרי UC דגימה, בדרך כלל נחשב פסולת רפואית. UC האנושי מתחיל לפתח עם המשך צמיחה של חלל מי השפיר 4-8 שבועות של הריון, ממשיך לגדול עד שהגיע 50-60 ס מ אורך, וזה יכול להיות מבודדת במהלך תקופת משלוח כל יילוד. כדי לזכות בתובנה הפתופיזיולוגיה של מחלות עיקשות, השתמשנו UC-derived MSCs (UC-MSCs) מן התינוקות הנולדים בגילאים שונים הריונית. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את בידוד ואפיון של UC-MSCs מן העוברים/תינוקות בגיל 19-40 שבועות של הריון.
Introduction
גזע mesenchymal (MSCs) במקור מבודדים, מאופיין של מח העצם (מוניטור)1,2 אבל ניתן להשיג ממגוון רחב של רקמות לרבות רקמת שומן, synovium, עור, שיניים זולה תוספות עוברית 3. MSCs מזוהים אוכלוסיה הטרוגנית התא יכול להתרבות, להבדיל לתוך adipocytes, osteocytes ו- chondrocytes. בנוסף, MSCs להחזיק את היכולת להעביר אל אתרי הפציעה, לדכא, לווסת את תגובות מערכת החיסון, ו לשפץ ולתקן פציעה. כיום, MSCs ממקורות שונים משכו עניין הולך וגובר כמקור לטיפול תא נגד מספר מחלות עיקשות, לרבות שתל – מול – מארח מחלות, אוטם מוחי4,5 .
אמנם המקור הכי מאופיין היטב של MSCs מוניטור, invasiveness של מוניטור השאיפה מגביל אתית הנגישות שלה. יכולת התפשטות ובידול של MSCs המתקבל מוניטור בדרך כלל ירידה של גיל התורם. לעומת זאת, העובר MSCs המתקבל עוברית תוספות כגון שליה, דם טבורי (UCB), ואת חבל הטבור (UC) יש יתרונות כולל פחות אתית חששות לגבי התפשטות מדגם וחזק ובידול קיבולת6 , 7. בין תוספות בעובר זה יימחקו בדרך כלל כאל פסולת רפואית, UCB, UC נחשבים איבר בעובר, בעוד השליה נחשב fetomaternal. בנוסף, השליה ו- UCB צריכים להיות שנדגמו, שנאספו ברגע המדויק של היילוד משלוח, ואילו השליה, UC ניתן לאסוף ולהשתמש מעובד לאחר הלידה היילוד. בהתאם לכך, UC הוא מקור MSC מבטיח תא טיפול8,9.
UC האנושי מתחיל לפתח עם הרחבה הדרגתית של חלל מי השפיר 4-8 שבועות של ההיריון, ממשיך לגדול עד 50-60 ס מ אורך, ניתן לבודד במהלך כל תקופת היילוד משלוח10. כדי לזכות בתובנה הפתופיזיולוגיה של מחלות עיקשות, אנו משתמשים UC-derived MSCs (UC-MSCs) מן התינוקות הנולדים הריונית בגילאים שונים11,12. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לבודד ולאפיין UC-MSCs מן העוברים/תינוקות בגיל 19-40 שבועות של הריון.
Protocol
Representative Results
Discussion
MSCs ניתן לבודד מתוך מגוון של רקמות, הטרוגניות אוכלוסיית תאים שעושים אקספרס לא כל הסמנים פנוטיפי אותו. כאן, אנחנו המתוארים פרוטוקול מנחה דיסקציה של ה-UC ואוסף מתינוקות לידה מוקדמת והמונח ומאפשרת בידוד והתרבות של UC-MSCs. בעקבות פרוטוקול זה, יש בהצלחה בודדנו UC-MSCs העומדים של קריטריונים ISCT<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי Grants-in-Aid עבור Scientific Research (C) (להעניק מספר: 25461644), מדענים צעירים (B) (להעניק מספרים: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) של JSPS KAKENHI.
Materials
| 50mL plastic tube | AS One Coporation, Osaka, Japan | Violamo 1-3500-22 | |
| 12-well plate | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3815-012 | |
| 60mm dish | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3010-060 | |
| Cell strainer (100 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2360 | |
| Cell strainer (70 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2350 | |
| Alpha MEM | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 135-15175 | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 172012 | |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific, waltham, MA | OPTI-MEM Gibco 31985-070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Gibco 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 209-16941 | |
| PBS | Takara BIO, Shiga,Japan | T900 | |
| Purified enzyme blends | Roche, Mannheim, Germany | Liberase DH Research Grade 05401054001 | |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347497 | Lot: 3220644, RRID: AB_400312 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 340364 | Lot: 3198741, RRID: AB_400018 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555822 | Lot: 3079912, RRID: AB_396151 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555483 | Lot: 2300520, RRID: AB_395875 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 550257 | Lot: 3057778, RRID: AB_393561 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555596 | Lot: 3128616, RRID: AB_395970 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 560839 | Lot: 4339624, RRID: AB_2033932 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347367 | Lot: 3219843, RRID: AB_400293 |
| PE-conjugated mouse IgG1 k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555749 | Lot: 3046675, RRID: AB_396091 |
| PE-conjugated mouse IgG2a k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555574 | Lot: 3035934, RRID: AB_395953 |
| PE-conjugated mouse IgG2b k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555743 | Lot: 3098896, RRID: AB_396086 |
| Viability dye | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | Fixable Viability Stain 450 562247 | |
| Blocking reagent | Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan | Block Ace UKB80 | |
| FCM | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSAria III Cell Sorter | |
| FCM software | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSDiva | |
| Adipogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01 | |
| Osteogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01 | |
| Chondrogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01 | |
| Formaldehyde | Polyscience, Warrigton, PA | 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | O0625 | |
| Arizarin Red S | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5533 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 198161 | |
| Microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-X700 |
References
- Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
- Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
- Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).
- Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
- Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton’s jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).
- Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
- Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton’s Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).
- Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).
- Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).
- Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. , 8749751 (2017).
- Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
- Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).
- Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
- Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).
- Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).
