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Composição e análise da distribuição de Bioaerossóis sob diferentes condições ambientais

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58795
, , , , , ,
1Academy of Military Medical Sciences, 2Chinese Academy of Agricultural Sciences, 3The Experimental High School Attached to Beijing Normal University

Summary

Compreender a composição biológica das partículas ambientais é importante para o estudo de seus impactos significativos na saúde humana e a doença se espalhou. Aqui, usamos três tipos de métodos de amostragem de bioaerosol e uma análise biológica de micróbios no ar para melhor explorar comunidades microbianas no ar sob diferentes condições ambientais.

Abstract

Variáveis microorganismos na matéria particulada (MP) sob diferentes condições ambientais podem ter um impacto significativo sobre a saúde humana. Neste estudo, descrevemos um protocolo para múltiplas análises das composições em ambiente PM. cinco experimentos biológicas são apresentadas: (1) PM número de monitoramento usando um contador de partículas do laser; (2) PM coleção usando um amostrador de aerossol ciclônica; (3) PM coleção usando um amostrador de grandes volumes de ar com filtros; (4) coleção de micróbios viáveis pelo amostrador de Andersen seis fases; e (5) detecção de composição biológica da PM ambiental por bactérias 16SrDNA e sequenciamento de região ITS fúngico. Nós selecionamos dias nebulosos e uma fazenda de gado como dois exemplos típicos da aplicação do presente protocolo. Neste estudo, nestes dois métodos de amostragem, classificador de aerossóis ciclônica e amostrador de filtro, mostrou eficiência de amostragem diferentes. O amostrador de aerossol ciclônica muito melhor desempenho em termos de recolha de bactérias, enquanto esses dois métodos mostraram a mesma eficiência na coleta de fungos. Amostradores de filtro podem trabalhar sob condições de baixa temperatura enquanto amostradores ciclônica aerossol possuem uma limitação de amostragem para a temperatura. Um sampler impactante sólido, tais como um amostrador de Andersen seis fases, pode ser usado para amostra Bioaerossóis diretamente no meio de cultura, o que aumenta a taxa de sobrevivência de microorganismos viáveis. No entanto, esse método principalmente se baseia na cultura enquanto mais de 99% dos micróbios não podem ser cultivadas. DNA extraído de bactérias viáveis recolhidas pelo amostrador de Andersen seis fases e amostras coletadas pelo amostrador de aerossol ciclônica e amostrador de filtro foram detectados por 16S rDNA de bacteriana e fúngico sequenciamento de região ITS . Todos os métodos acima podem ter ampla aplicação em muitos campos de estudo, como monitoramento ambiental e detecção de vírus transmitido. Nesses resultados, podemos concluir que esses métodos podem ser usados em diferentes condições e podem ajudar outros pesquisadores a explorar ainda mais os impactos na saúde de Bioaerossóis ambiental.

Introduction

Em ambientes naturais, vários tipos de microorganismos existem em Bioaerossóis, incluindo fungos, bactérias, vírus e outros microorganismos1. Microorganismos no ar, que podem ser emitidos por algumas actividades humanas, tais como operações de alimentação animais em fazendas de gado, são os conteúdos importantes do ambiente atmosférico2. Estes microorganismos podem não apenas desempenham papéis importantes no ambiente atmosférico, mas também ter um impacto significativo na saúde humana e a propagação de doenças.

Como uma importante forma de propagação de doenças, aerossóis microbianas têm atraído grande atenção em todo o mundo. Em estudos recentes, muitas doenças humanas foram encontradas para ser associados com a composição complexa de matéria particulada ambiental (MP) em locais diferentes, tais como fábricas químicas, fazendas de gado e cidades smoggy3,4. A composição biológica do PM pode contribuir para algumas doenças respiratórias e cardiovasculares em seres humanos expostos a PM5. Regiões diferentes do corpo, tais como a mucosa, pele, aparelho digestivo e do trato respiratório, podem ser alvos potenciais de micróbios anexados ao PM6,7. Um risco aumentado de câncer de pulmão pode ser causado por exposição prolongada a PM2.58.

Bactérias no ar são vistoriadas em vários locais em vários países ao redor do mundo, inclusive em estações de metrô, hospitais veterinários, matadouros, compostagem, curtumes, facilidades para processamento de leite, minas de carvão, clínicas odontológicas e ambientes internos9,10,11,12,13,14,15,16,17, gerando um grande número de relatórios sobre aerossóis biológicos. Lugares movimentados associado com campi, gado, fazendas e cidades grandes durante dias nebulosos são três condições públicas particularmente importantes para os quais precisamos explorar as conexões entre saúde humana e os efeitos potenciais da exposição de PM. Além disso, durante os dias de inverno nas cidades do norte da China, altos valores de PM2.5 podem afetar a saúde humana. Apesar de PM2.5 pode gerar efeitos tóxicos, visando as superfícies respiratórias e dissolver-se no sangue18, ainda não está claro se e como os micróbios anexados ao PM2.5 potencialmente poderiam afectar a saúde humana19 ,20. Explorações pecuárias são uma das principais fontes de PM e microbianas aerossóis no ar. O grande número de agentes patogénicos, tais como o vírus da gripe e Brucella melitensis, que são transportados por aerossóis nos campos em torno de explorações pecuárias é fatores importantes, causando doenças respiratórias em gado e aves domésticas, trabalhadores.

Neste estudo, nós exploramos vários tipos de análises de Bioaerossóis, incluindo a coleção de bioaerosol monitoramento, número de PM e análise da composição biológica. Amostras de ar foram recolhidas por um sampler de aerossol ciclônica, um amostrador de grandes volumes de ar com filtros e um amostrador de seis fases de Andersen. Em seguida, as amostras coletadas por esses três amostradores foram analisadas por análise biológica, incluindo bacteriana 16S rDNA e fúngico sequenciamento de ITS para determinar suas composições biológicas. Aqui, nós mostramos resultados representativos de bioaerosol amostras recolhidas durante dias nebulosos de Beijing e de fazendas de gado, indicando que a Bioaerossóis podem ter grandes impactos na saúde humana e animal. A comparação entre o líquido e o filtro, métodos de amostragem também foram exploradas neste estudo baseia-se principalmente dados de DNA 16S e sequenciamento de ITS fúngico.

Protocol

1. PM número monitoramento Usar uma partícula laser aerotransportado contador (ver Tabela de materiais) para determinar o número total de PM. Recolha o PM pela porta de amostragem de ar no topo do contador de partículas a laser aerotransportado.Nota: Este contador de partículas é um equipamento de automação e pode trabalhar de forma independente quando o programa, incluindo o tempo de amostragem, intervalo, tempos de coleta, etc. foi definido na sua tela de toque. Equipe o instrumento com um sensor para monitorar a temperatura e umidade relativa. Medir e registrar dados de temperatura e umidade relativa do ar simultaneamente cada 5 min. No total, medir e registrar 6 classes de tamanho de partícula diferente (0.3-0.5 μm, 0,5-0,7 μm, 0,7-2,5 μm, 2,5-5 μm, 5-10 μm e > 10 μm) simultaneamente a cada 5 min. medir 4 outras classes de tamanho de partícula (0.3-0.5 μm, 0,5-1 μm, 1-3 μm e ≥ 3 μm). Coletar as amostras de ar, embora o buraco de amostragem no topo do amostrador e usar os módulos de teste dentro do amostrador para medir o tamanho de partícula de cada PM. Em seguida, os dados são armazenados automaticamente. Todos os processos acima pode ser executada automaticamente após os parâmetros relativos, incluindo o tempo de amostragem e contando gama, são definidas, embora o mini toque displayer do contador de partículas a laser aerotransportado.Nota: Este contador de partículas é um equipamento de automação e tem módulos de teste que contam o número de PM de classes de tamanho de partícula diferente. Para avaliar o erro-padrão experimental, certifique-se de que as classes de tamanho de partículas diferentes são contadas com pelo menos 15 repetições. Certifique-se que as leituras são armazenadas na memória interna do instrumento e posteriormente analisadas. Certifique-se de que a análise dos dados primários inclui concentração número de PM, o teste ANOVA e o percentual de PM em cada classe de tamanho. Por exemplo, como mostrado na figura 1A, as concentrações de número de PM em dezembro (237.6 partículas/cm3) foram significativamente maiores do que aqueles em outubro (média: 110.2 partículas/cm3) (ANOVA; P-Value < 0,05). A figura 1B mostra que o número de partículas menores que 3 μm representaram mais de 99% do número total. Use o contador de partículas a laser para monitorar as concentrações de número de PM e armazenar os dados automaticamente. Use um disco flash USB para exportar dados no computador e executar o teste ANOVA. 2. PM coleção por aerossol ciclônica Samplers Execute o PM de amostragem em uma área aberta sem qualquer grande nas proximidades de fontes de poluição em ∼2 m acima do solo. Grave a posição do site da amostragem. Por exemplo, o campus do Instituto de tecnologia de Pequim é o seguinte: 39 ° 57′ 51,0 ” N; 116 ° 19′ 38,5 ” E. Use um sampler ciclônica aerossol para recolher amostras de ar. Use um fluxo de amostrador de 323 L/min e um tempo de coleção de 6 h.Nota: A taxa de fluxo do amostrador é fixo e não pode ser alterada. A hora da coleta é controlada pela cronometragem manual, como há apenas um botão de Iniciar e parar este amostrador. Usar água estéril para lavar o interior do sampler de aerossol ciclônica 3 vezes antes da coleta e usar a função de limpeza automática 3 vezes pressionando continuamente o botão recolher 3 vezes. Pressione o botão recolher para iniciar a amostragem e pressione o botão da bomba de amostragem de parar. Colocar o amostrador em uma prateleira ou andar sem ninguém para segurá-lo no lugar. Preserve todas as amostras no escuro a-20 º C até as análises subsequentes. 3. PM coleção por filtros Execute o PM de amostragem em uma área aberta sem qualquer grande nas proximidades de fontes de poluição em ∼2 m acima do solo. Grave a posição do site da amostragem. Por exemplo, o campus do Instituto de tecnologia de Pequim é a seguinte: 39 ° 57′ 51,0 ” N; 116 ° 19′ 38,5 ” E. Coletar as amostras de PM na 20,32 × 25,4 cm2 filtros, (veja Tabela de materiais) usando um amostrador de grande volume de ar (consulte a Tabela de materiais) a uma taxa de fluxo de 1.000 L/min. definir o tempo de coleção e taxa de fluxo por autoprogramação relativa. Preserve os filtros amostrados tudo no escuro a-20 º C até as análises subsequentes. 4. análise da composição biológica Para análise da composição biológica, usar cada amostra líquida da amostra amostrador ou filtro ciclônica aerossol para extração de DNA por uma extração de DNA multi-fonte Kit (veja a Tabela de materiais) de acordo com os protocolos do fabricante. Para amostras do amostrador de grandes volumes de ar com filtros, use 1/8 de cada amostra de filtro para extração de DNA. Coloque o filtro em um tubo de 50 mL com a amostra frente para dentro e a parte traseira virada para a parede do tubo. Adicione 10 contas nos sites de central para o lado do filtro contendo a amostra. Vórtice o tubo durante 15 minutos à temperatura ambiente. Pipete o líquido no tubo em um tubo de centrífuga de 50ml limpo para continuar o processo de extração de DNA. Extrai o DNA da amostra pelos processos da seguinte maneira. Centrifugar a amostra de bactérias a 2.000 x g por 5 min, retire o sobrenadante e suspender as bactérias em 2 mL de tampão de PBS estéril. Recolher a suspensão de bactérias em um tubo de centrífuga de 2ml e centrifugar a 2.000 x g por 5 min descartar o sobrenadante. Adicione 350 μL de tampão de PBS estéril contendo as bactérias suspensas para a solução. Adicionar 0,8 mL de RNase A. Adicionar 150 μL de tampão CL e 8 μL de proteinase K e misture imediatamente pelo vórtice tremendo por 1 min. Após a centrifugação breve a 1.000 x g, durante 30 s (sem resíduos na parede), coloque o tubo de centrífugo em água de 56 ° C por 10 min. Adicione 350 μL de tampão PD e mistura por 30 s e, em seguida, centrifugar por 10 min a 12.000 x g. Coloque o tubo de preparação de DNA em um tubo de centrífuga de 2 mL e transfira a mistura feita na etapa 4.2.6 para o tubo de preparação. Centrifugar por 1 min a 12.000 x g. Descartar o filtrado, colocar de volta o conteúdo do tubo preparação no tubo de centrífuga original de 2 mL e adicionar 50 μL de tampão W1. Centrifugue a mistura por 1 min a 12.000 x g. Descartar o filtrado, colocar de volta o conteúdo do tubo preparação no tubo de centrífuga original de 2 mL e adicionar 700 μL de tampão W2. Centrifugue a mistura para 1 min a 12.000 x g.. Repita este passo para lavar novamente com 700 μL de tampão W2. Descarte o líquido waste e colocar de volta o conteúdo do tubo preparação no tubo de centrífuga 2 mL original. Centrifugue a mistura por 1 min a 12.000 x g. Coloque o conteúdo do tubo de preparação do DNA no outro tubo de centrífuga limpa 1,5 mL e adicionar 100 μL de eluente ou deionizada para o meio da membrana no tubo de preparação (água desionizada ou eluente foi aquecida a 65 ° C). Deixe a mistura repousar à temperatura ambiente por 1 min e centrifugar a mistura por 1 min a 12.000 x g. Realize a reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (Q-RT-PCR) para quantificar a abundância relativa de bactérias e fungos sobre os filtros de amostragem. Use as primeiras demão da seguinte maneira: para bacteriana 16S rDNA, 515F (5′-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3′) e 806R (5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′); e para os fungos ITS, ITS1 (5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′) e ITS1 (5′-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3′). Executar os ensaios de Q-RT-PCR em um sistema de PCR em tempo real (ver Tabela de materiais). Condição de RT-PCR: predegeneration, 95 ° C, 10 min; degeneração, 95 ° C, 15 s; recoze e extensão, 60 ° C, 1 min; 40 ciclos de degeneração para recozer e extensão. Para a análise de estrutura de comunidade bacteriana e fúngica, amplifica a região V1 – V3 o bacteriana 16S rDNA e região ITS do operon rRNA fúngicas por PCR. Usar os primers da seguinte maneira: para bactérias, V1-9F (5 ‘-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG ACG AGT TTG ATC MTG GCT CAG-3 ‘) e 541R-V3 (5 ‘-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-barcode-ACW TTA CCG CGG CTG CTG G-3 ‘); e para fungos, ITS-3F (5′-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG CAC ATC GAT GAA GAA CGC AGC-3′) e ITS-4R (5′-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-barcode-GCT CCT CCG CTT ATT GAT ATG C-3’). Certifique-se de que a mistura de 20 μL de PCRs incluído 2 µ l de dNTPs 2,5 mM, 4 μL de 5 × FastPfu Buffer, 0,8 μL de cada primer (5 μM), 0,4 μL de Polymerase de FastPfu e 10 ng de DNA de modelo (consulte a Tabela de materiais). Use o programa PCR como segue: 94 ° C por 5 min; seguido por 10 ciclos de 94 ° C por 30 s, 55-60 ° C durante 45 s e 72 ° C por 90 s; 20 ciclos de 94 ° C por 30 s, 55 ° C por 45 s e 72 ° C por 90 s; e uma extensão final a 72 ° C por 5 min. Realize a purificação de DNA, quantificação de DNA e pyrosequencing conforme descrito em um anterior estudo 21. 5. Bioaerosol amostragem e cultivo Use um amostrador de seis fases de Andersen padrão internacional (consulte a Tabela de materiais) para amostra viáveis no ar bactérias e fungos, com um caudal de 28,3 L/min. Use um tempo de amostragem de 35 min. colocar a placa de cultura em cada estágio do sampler. Suficientemente desinfecte o sampler com 75% de álcool etílico após cada amostragem.Nota: A taxa de fluxo do amostrador é fixo e o tempo de coleção é controlado pelo tempo de manutenção manual. Estágios de amostra os seis com o sampler de seis fases de Andersen, que é definido pelo diâmetro aerodinâmico das partículas no ar, incluindo estágio VI (0,65 – 1.1 μm), fase V (1.1 – 2.1 μm), estágio IV (2.1 – 3.3 μm), fase III (3.3 – 4.7 μm), fase II (4.7 – 7,0 μm) e fase I (≥7.0 μm). Recolher as partículas bacterianas e depositar na placa de cultura em cada estágio contendo ágar de caseína-soja Digest (ver Tabela de materiais). Há um recipiente com muitas entradas de ar na parte superior em cada etapa do amostrador. Cultura da coleção de bactérias no ar as placas a 37 ° C por 24-48 h; em seguida, conte os números de colônia de bactérias sobre o prato da amostra para cada fase. Para evitar que as partículas coletadas pelo sampler de seis fases de Andersen de sobreposição, corrigi o número de colônias em cada nível de amostrador pela seguinte fórmula:onde Pr: Corrigido o número de colônias em cada nível,N: número de furos do sampler em todos os níveis (400), de amostragem er: a contagem real das colônias. Calcule a unidade de colónias por m3 de ar da seguinte forma:onde c: concentração (UFC/m3),N1-N6: corrigido número de colônias em cada nível,T: tempo (min), de amostragem eF: fluxo taxa de amostragem (28,3 L/min). Use métodos de etapas 5.1 – 5.3 para estudar o bioaerosol em fazenda de gado, incluindo quatro tipos de pocilgas.Nota: Encontra-se a fazenda de gado em Changchun, China. A posição central de 2 m acima do solo em cada pocilga foi selecionada como amostragem localização.) Após a cultura de bactérias, trate todas as colônias nas placas conforme descrito nas etapas 6.1 – 6.2. 6. identificação de bactérias viáveis Depois de 48 h ou 72 horas de cultivo, coloque as bactérias em um tubo de centrífuga de 2 mL. Extrair o DNA destas bactérias ou fungos por meio de uma extração de DNA multi-fonte Kit (veja a Tabela de materiais). O processo de extração de DNA é descrito na seção 4.2. Use 200 μL extração de DNA para sequenciação de 16S rDNA . Use os mesmos processos, conforme descrito em etapas 4.2, 4.3 e 4.4, na análise da composição biológica.

Representative Results

Neste estudo, foram realizadas uma avaliação da distribuição geral PM e uma análise detalhada da Bioaerossóis em uma fazenda de gado leiteiro de setembro a dezembro. Muitos fatores ambientais contribuem para a distribuição de partículas de aerossol. Estudamos as distribuições de tamanho e concentração de PM em uma casa de vaca, usando um contador de partículas laser ETI. Como mostrado na figura 1A, a concentração de partículas de aerossol foi maior em dezembro e menor em outubro, o que pode ser causado por mudanças na temperatura e na umidade (tabela 1). A concentração de partículas de aerossol inalável (0.3-3.0 µm) foram responsáveis por mais de 99% da concentração total de partículas (figura 1B), e as partículas neste intervalo poderiam atingem o trato respiratório profundo, causando sérios riscos para os seres humanos e animais. Análise da composição biológica das amostras pode ser realizada por extração de DNA, bacteriana 16SrDNA e sequenciamento de região ITS fúngico em vez de cultura de microorganismo. Da análise de bioaerosol amostras coletadas usando um amostrador ciclônica aerossol ou um amostrador de grandes volumes de ar com filtros biológica, preliminarmente podemos comparar a eficiência destes dois métodos em coleta de bactérias e fungos. Figura 2 mostrou os resultados da análise de bioaerosol amostras recolhidas durante dias nebulosos Beijing no campus do Instituto de tecnologia de Pequim, em 20 de dezembro de 2016. Para a coleção de bactérias, os resultados indicaram que o sampler de aerossol ciclônica recolhidos muitos géneros mais do que o amostrador de grandes volumes de ar com filtros (Figura 2A). Para a coleção de fungos, estes amostradores mostraram coleção igual eficiência e quase as mesmas abundâncias de género (Figura 2B). Os resultados apresentados na Figura 2, fomos capazes de medir a eficiência de coleta diferentes destes dois métodos para bactérias e fungos. Para a coleção de bactérias, o amostrador de aerossol ciclônica executada muito melhor do que o alto volume de ar amostrador com filtros porque as amostras da antiga mostraram uma maior abundância de género (Figura 2A). No entanto, a análise de fungos sequenciamento dos dois exemplos de métodos de amostragem diferentes mostrou estruturas comunitárias quase idênticos (Figura 2B). Nós estudamos no ar bactérias viáveis por meio de um amostrador de seis fases de Andersen. Como mostrado na Figura 3, os números de colônia de bactérias viáveis para as partículas-VI do palco foi reduzido. Fase I partículas (partículas tamanho > 8.2 µm) teve os maiores números de colônias de bactérias viáveis. O percentual de fase I colônias em quatro tipos diferentes de pocilgas, incluindo casa de casa, grávida de porca em lactação, casa engorda e desmame foi 33%, 30%, 26% e 34%, respectivamente. A porcentagem de colônias de fase II em quatro tipos diferentes de pocilgas foi de 20%, 22%, 19% e 20% respectivamente. A porcentagem de colônias de fase III em quatro tipos diferentes de pocilgas foi de 18%, 18%, 18% e 19% respectivamente. A porcentagem de colônias de estágio IV em quatro tipos diferentes de pocilgas foi 17%, 16%, 16% e 16% respectivamente. A porcentagem de colônias de V fase em quatro tipos diferentes de pocilgas foi 10%, 10%, 14% e 6% respectivamente. Partículas de fase VI (tamanho da partícula < 1.0 µm) tinham os piores números de colônias de bactérias viáveis. A porcentagem de colônias de VI estágio em quatro tipos diferentes de pocilgas foi de 3%, 5%, 6% e 5%, respectivamente. As amostras de ar foram coletadas em quatro tipos diferentes de pocilgas usando um amostrador de seis fases de Andersen e então cultivadas sob condições apropriadas. O DNA do inteiro-genoma das bactérias viáveis coletadas em cada estágio de partícula foi extraído e detectado por 16S rDNA de bacteriana e fúngico sequenciamento de região ITS . Um total de 91 158 espécies de bactérias foram identificadas nas bactérias viáveis em pocilgas. As estruturas de comunidade de bactérias viáveis em quatro tipos diferentes de pocilgas, incluindo casa, grávida de parição semeiam casa, casa engorda e desmame são mostrados na Figura 4 com dados de palco eu à fase VI. O conteúdo de diferentes gêneros bacterianos predominantes não é o mesmo entre diferentes pocilgas. Figura 1: A distribuição de tamanho e concentração de PM em quatro diferentes meses. (A) Boxplot da PM número durante o período de estudo. Cada boxplot inclui o máximo, mínimo, mediana, dois quartis e valor anormal do banco de dados. (B) mapas de distribuição de tamanho médio de PM. Havia oitenta vacas na casa de setembro a dezembro. A porcentagem de PM (≥ 3 µm) em quatro meses (setembro, outubro, novembro e dezembro) foi 0.005 e 0,005, 0,002 0,002, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: análise biológica de bioaerosol amostras coletadas por dois amostradores. (A) e (B) Mostrar as abundâncias de gêneros de fungos ou bactérias em amostras de bioaerosol obtidas com métodos diferentes de coleção. Amostrador de ar humidificado-parede representa o sampler de aerossol ciclônica. Filtros de quartzo representa o amostrador de grandes volumes de ar com filtros. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: média de mapas de distribuição hierárquica de bactérias viáveis em quatro tipos de pocilgas. Os quatro tipos de pocilgas são casa de casa, grávida de porca em lactação, engorda casa e casa de desmame. S1 a S6 representam as fases de seis partículas (I a VI) coletadas pelo sampler de seis fases de Andersen. Os estágios foram definidos pelos diâmetros aerodinâmicos das partículas no ar, incluindo a fase VI (0.65-1.1 µm), fase V (1.1-2.1 µm), estágio IV (2.1-3.3 µm), fase III (3.3-4,7 µm), fase II (4.7-7,0 µm) e fase I (7,0 µm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: estruturas de comunidade bacteriana com diferentes abundâncias nas amostras de ar. As amostras de ar foram coletadas em quatro tipos diferentes de pocilgas usando um amostrador de seis fases de Andersen e então cultivadas sob condições apropriadas. O DNA do inteiro-genoma das bactérias viáveis em cada estágio de partículas recolhida pelo amostrador de seis fases a Andersen foi extraído e detectado pelo sequenciamento bacteriana 16S rDNA . Os números de 1 a 6 em cada tipo de chiqueiro representam estágios da partícula I a VI medido pelo sampler de seis fases de Andersen. O texto no lado direito inclui o nome do género para cada bactéria. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Neste estudo, nós fornecemos alguns resultados representativos que foram obtidos durante dias nebulosos e em fazendas de gado. Os resultados de bioaerosol amostras colhidas durante dias nebulosos de Beijing facilitaram uma melhor compreensão das composições biológicas da composição biológica da PM sem PM presente durante dias nebulosos de Beijing. Os resultados de amostras colhidas em explorações pecuárias também fornecerá dados básicos para comprovação de ar ambiental em pocilgas e uma fundamentação teórica e suporte técnico para a reprodução saudável e segura produção nas fazendas de gado. Muitos fatores ambientais, como temperatura, umidade e velocidade do vento, podem contribuir para a distribuição de partículas de aerossol na casa de vaca (Figura 1). Estudos anteriores revelaram que a PM em explorações pecuárias principalmente provém as forragens, fezes, peles e penas, que podem estar relacionada com as atividades de animais. Os fatores ambientais podem afetar não só atividades animais, mas também a agregação e difusão da PM em uma casa de vaca relativamente fechados. Portanto, podemos detectar diferentes concentrações e distribuições de tamanho de PM em quatro meses diferentes. Além disso, a condição sanitária, alimentando o método e a actividade animal foram diferentes entre os quatro tipos de pocilgas, que também podem afetar a estrutura da comunidade de bactérias viáveis no ar (Figura 4).

No entanto, neste estudo, principalmente enfocamos os métodos disponíveis que podemos usar para estudar a composição e a distribuição de Bioaerossóis sob diferentes condições ambientais. Comparado com outras amostras microbianas, aqueles de microorganismos no ar têm concentrações muito baixas e são misturados com um grande número de impurezas, tais como partículas de poeira inorgânicas, que introduzem certas dificuldades durante a coleta e detecção de Esses microorganismos21. Portanto, métodos adequados de recolha e de detecção devem ser selecionados para aerosóis microbianos. A coleta de amostras de aerossol microbiana geralmente é executada usando o método de precipitação ou equipamento especializado para coletar os microorganismos no líquido, semi-sólido ou sólido amostragem média22,23,24 . Então, algum tratamento técnico correspondente e testes específicos e análise são posteriormente realizados25. O meio de amostragem deve manter microorganismos intactos para reduzir o erro associado a deteção e a análise de26. No entanto, amostradores de microorganismo aerossol diferentes têm efeitos diferentes sobre a integridade das amostras devido a seus princípios de amostragem diferentes e mídia. As pessoas têm projetado muitos tipos de amostradores de bioaerosol que usam princípios de amostragem diferentes, tais como a impactação inercial, resistência de filtração e precipitação eletrostática27.

Amostradores de impacto pode empurrar PM no ar no meio de amostragem em alta velocidade por meio de equipamento de extração. Existem dois tipos de amostradores de impacto: sólidos e líquidos. Sólido, amostradores de impacto pode ser usado para Bioaerossóis amostra em uma concentração baixa e pode ser quase impermeável ao ar fluir28. Partículas de tamanhos diferentes podem ser preliminarmente selecionadas, e os micróbios podem ser degustados diretamente no meio de cultura, o que aumenta a taxa de sobrevivência de microorganismos viáveis10. Devido ao impacto inercial, partículas de aerossol microbiana facilmente colidem no mesmo local, e colônias podem sobrepor-se facilmente após a cultura. Presentemente, o amostrador de impacto sólido mais comum é o sampler de aerossol microbiana de Andersen-6. Neste estudo, usamos um amostrador de seis fases de Andersen para estudar as bactérias viáveis distribuídas em PM no ar de tamanhos diferentes.

Amostradores de aerossol ciclônica usam ciclones de ar espiral em alta velocidade em um cilindro ou cone. Bioaerosol partículas podem ser separadas do fluxo de ar pela força centrífuga, o que significa que os micróbios podem chocar-se com a parede interna do sampler e então ser coletados pelo buffer de amostragem. Este método é conveniente e pode ser usado para o tempo de amostragem vezes em grande fluxo e operações de amostragem. No entanto, esse método não pode ser implementado em baixas temperaturas porque a operação é dependente de líquido. O amostrador de aerossol ciclônica utilizado neste estudo é um sampler de ciclônica aerosol molhado-parede que pode extrair e transferir patógenos no ar e partículas do ar amostrado em um pequeno volume de água para análise,29.

Os amostradores de filtro podem trabalhar sob condições de baixa temperatura e podem provar a partículas acima de um determinado tamanho. No entanto, eles têm um grande impacto sobre a atividade microbiana e são propensos a danos, que influenciará consideravelmente subsequentes estudos sobre atividade de amostragem. Neste estudo, amostras de bioaerosol de dias nebulosos de Beijing foram coletadas usando um amostrador de grandes volumes de ar com filtros e um sampler de aerossol ciclônica. O objetivo deste experimento foi analisa a composição biológica da PM sem a separação e o cultivo de micróbios no ar. Portanto, esses dois métodos de amostragem foram adequados para este estudo. Para o método de amostrador de aerossol ciclônica, micróbios no ar em baixa concentração podem ser facilmente extraídos para o buffer de execução e então podem ser analisados convenientemente sem o tratamento adicional que é comumente utilizado para amostras de filtro. Neste estudo, nestes dois métodos de amostragem, classificador de aerossóis ciclônica e amostrador de filtro, mostrou eficiência de amostragem diferentes. O tratamento adicional que é comumente utilizado para amostras de filtro, como recuperando o filtro, a amostra é uma das principais diferenças entre esses dois métodos. Além disso, as amostras de ar foram coletadas diretamente no buffer de execução pelo amostrador de aerossol ciclônica enquanto o outro método coletou amostras de filtros. As características de tipo diferente do método de amostragem podem contribuir para essa eficiência de amostragem diferentes. Podemos assumir que o sampler ciclônica aerossol é a melhor escolha para coleção de microorganismo, e esta suposição precisa de mais uma confirmação.

Neste estudo, bacteriana 16S rDNA e sequenciamento de região ITS fúngico foram usados para realizar a análise biológica de Bioaerossóis. Sequenciamento de 16SrDNA é a determinação dos segmentos de 16S rDNA no genoma microbiano30. 16S rDNA amplamente existe em procariontes com alta conservação e especificidade, o que o torna útil para a identificação de espécies microbianas31. Sequenciamento do genoma inteiro requer apenas a extração de DNA genômico e posterior sequenciamento. Além de produzir uma grande quantidade de dados, esse processo também permite uma análise mais abrangente da estrutura da comunidade microbiana. Além disso, metagenômica também pode ser usada neste campo de estudo, fornecendo mais informações no futuro. Handelsman et al proposto pela primeira vez o conceito do metagenome em um livro de 1998 sobre micróbios no solo32. Em estudos posteriores, o conceito do metagenome gradualmente foi aceite, e muita pesquisa foi realizada sobre os micróbios que constam o humano intestino, o oceano e o solo33,34,35. Com o apoio da sequenciação do elevado-throughput de tecnologia, metagenômica desenvolveu-se rapidamente, e que desempenha um papel cada vez mais importante no estudo da deteção do patógeno. Métodos tradicionais de pesquisa microbiana dependem principalmente de cultura para separação e purificação. No entanto, muitos estudos não podem ser executados porque mais de 99% dos micróbios não podem ser cultivadas. Em contraste com os métodos tradicionais, metagenômica pode levar a informação genética de todos os micróbios no ambiente como um todo, sem a necessidade de separar os organismos individuais36. Uma análise detalhada de todos os microorganismos resultantes pode ser realizada diretamente.

Em resumo, este estudo mostrou vários detecção, amostragem e métodos de análise que poderiam ser usados para estudos sobre a composição biológica da PM ambiental, incluindo a PM de monitoramento; PM amostragem por um amostrador de seis fases de Andersen, um amostrador de grandes volumes de ar com filtros ou aerossol ciclônica amostrador; e posterior análise biológica com base no sequenciamento de DNA. Na prática, estes métodos podem ser usados em diferentes condições ambientais, tais como muitos tipos de explorações pecuárias. Nossos protocolos e resultados podem ajudar outros pesquisadores em todo o mundo explorar ainda mais os impactos na saúde de Bioaerossóis fúngicas e bacterianas no ambiente.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Apoio financeiro para este estudo veio a Fundação Nacional de ciências naturais da China (n. º 41775148). Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Materials

airborne laser particle counter TSI Inc, MN, USA model 9306
Andersen six-stage sampler Tisch Inc, USA TE-20-600
AxyPrep multisource DNA Miniprep Kit Axygen, NY, USA AP-MN-MIS-GDNA-50G
FastPfu Polymerase TransGen Inc., Beijing, China AP221-01
High-volume air sampler Beijing HuaRui HeAn Technology Co., Ltd., China HH02-LS120
Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific, USA Applied Biosystems® 7500
Soybean-Casein Digest Agar Becton, Dickinson and company, MD, USA 211043
Tissuquartz filters Pall, NY, USA 7204
Wetted-Wall Air Sampler Research International, Inc. 17161 Beaton Road SE
Monroe, Washington 98272-1034 USA		 SASS 2300
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Wang, Z., Li, J., Qian, L., Liu, L., Qian, J., Lu, B., Guo, Z. Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions. J. Vis. Exp. (143), e58795, doi:10.3791/58795 (2019).
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