組成と異なる環境条件下におけるバイオエアロゾルの分布解析

1. 午後数監視 空中レーザー粒子を使用 (材料の表を参照) をカウンター総時数を決定します。空中レーザー パーティクル カウンターの上に空気のサンプリング ポートで PM を収集します。注: このパーティクル カウンターは、オートメーション機器と、それすることができます独立して作業サンプリング時間、間隔、コレクションの実行時間を含むプログラム、等は、そのタッチ スクリーン上に設定されている場合。 温度と湿度を監視するためのセンサーを計測器を装備します。測定し、同時に 5 分ごとの温度・湿度データを記録します。 合計では、測定し、記録 6 異なるパーティクル サイズ クラス (0.3 0.5 0.5 0.7 μ m 0.7 2.5 μ m μ m、2.5-5 μ m、5-10 μ m、> 10 μ m) 同時に 5 分ごとに測定 4 の他の粒子サイズのクラス (0.3 0.5 μ m、0.5-1 μ m、1-3 μ m と ≥ 3 μ m)。 サンプラーの上にサンプリング穴も空気のサンプルを収集し、サンプラー内のテスト モジュールを使用して、各 PM の粒子サイズを測定します。その後、データは自動的に格納されます。上記すべてのプロセスは相対パラメーターとサンプリング時間と範囲のカウントの後自動的に実行できる、空中レーザー粒子カウンターの表示ミニ タッチ機能」が設定されます。注: このパーティクル カウンターは、オートメーション機器、異なる粒子サイズ クラスの午後の数をカウント テスト モジュールです。 実験誤差を評価するために、異なる粒子サイズ クラスに少なくとも 15 のレプリケーションとカウントされているを確認します。測定値が計測器の内蔵メモリに格納され、その後分析を確認します。 プライマリ ・ データの解析で午後数濃度、分散テスト、午後の割合が各サイズ クラスに含まれることを確認します。たとえば、図 1 aのように、12 月 (237.6 粒子/cm3) で PM 個数濃度だった 10 月のそれらよりも有意に高い (平均: 110.2 粒子/cm3) (分散分析;P-value < 0.05)。図 1 bは、粒子の数は、合計数の 99% 以上を占めている 3 μ m より小さいを示しています。 午後数濃度を監視し、自動的にデータを格納するレーザー パーティクル カウンターを使用します。ANOVA テストを行い、コンピューターでデータをエクスポートするには、USB フラッシュ ディスクを使用します。 2 低気圧性エアロゾルのサンプラーで PM コレクション 午後なしすべての近くの主要なオープン エリアで ∼2 m、地上で汚染源をサンプリングを実行します。 サンプリング サイトの位置を記録します。たとえば、北京工業大学のキャンパスは次: 39 ° 57’51.0 ‘ N。116 ° 19’38.5 ‘ E. 空気のサンプルを収集するために低気圧性エアロゾル サンプラーを使用します。323 L/min のサンプラーの流れと 6 h のコレクションの時間を使用します。注: サンプラー流量固定されて、変更することはできません。コレクションの時間は、このサンプラーにのみを開始および停止ボタンがあるので、手動計時によって制御されます。 滅菌水を使用して、コレクション前に 3 回低気圧性エアロゾル サンプラーの内側を洗浄して 3 回連続 3 回収集ボタンを押すことで自動クリーニング機能を使用します。 サンプリングを開始しサンプリングを停止するポンプのボタンを押して収集ボタンを押します。1 つの場所にそれを保持、棚や床にサンプラーを置きます。 以降の解析まで、-20 ° C で暗闇の中ですべてのサンプルを保持します。 3 フィルターで PM コレクション 午後なしすべての近くの主要なオープン エリアで ∼2 m、地上で汚染源をサンプリングを実行します。 サンプリング サイトの位置を記録します。たとえば、北京工業大学のキャンパスは次のように: 39 ° 57’51.0 ‘ N。116 ° 19’38.5 ‘ E. 大容量空気サンプラーを使用して 20.32 × 25.4 cm2フィルター (材料の表を参照してください) に PM を採取 (材料の表を参照してください) 1,000 L/分の流量で相対自動プログラミング フロー速度と収集時間を設定します。 以降の解析まで、-20 ° C で暗闇の中ですべてのサンプルのフィルターを保持します。 4. 生物学的組成分析 生物学的組成分析、マルチソース DNA 抽出キットによる DNA 抽出の低気圧性エアロゾルのサンプラーやフィルターのサンプルから各液体サンプルを使用 (材料表参照) 製造元のプロトコルによると。 フィルターを使用した大容量の空気サンプラーからサンプル、DNA の抽出の各フィルターのサンプルの 1/8 を使用します。50 mL のチューブに内側に直面するサンプルと管壁の方を向いてバック フィルターを置きます。サンプルを含むフィルターの側に向かって中央のサイトで 10 玉を追加します。 渦管室温で 15 分間。DNA の抽出を続行するクリーン 50 mL 遠心チューブにチューブ内の液体をピペットします。 サンプルからの DNA をプロセスによって次のように抽出します。 5 分 2,000 x g で細菌のサンプルを遠心、上清を除去、2 mL の滅菌 PBS バッファー内の細菌を中断します。 2 mL の遠心管中の細菌懸濁液を収集し、上澄み液を捨てに 5 分間、2,000 × g で遠心分離します。 ソリューションに浮遊菌を含む滅菌 PBS バッファーの 350 μ L を追加します。 Rnase a. 0.8 mL を追加します。 バッファー CL の 150 μ L とプロティナーゼ K の 8 μ L を加えて 1分間振動渦によってすぐにミックスします。30 1,000 x g で簡単なの遠心分離後 s (壁上の残渣) は、56 ° C で 10 分間水に遠心管を入れて。 12,000 × g でバッファー PD と 30 s のミックスし、10 分間遠心する 350 μ L を追加します。 2 mL の遠心管中 DNA 調製チューブを置き、手順 4.2.6 準備チューブに混合物を転送します。その後、12,000 × g で 1 分間遠心します。 濾液を破棄、元の 2 mL の遠心管に準備管の内容を戻すバッファー W1 の 50 μ L を追加します。12,000 × g で 1 分の混合物を遠心分離機します。 濾液を破棄、元の 2 mL の遠心管に準備管の内容を戻すバッファー W2 の 700 μ L を追加します。12,000 x g に 1 分間遠心する混合物は、再びバッファー W2 の 700 μ L での洗浄にこの手順を繰り返します。 廃液を破棄し、元の 2 mL の遠心管に準備管の内容を戻します。12,000 × g で 1 分の混合物を遠心分離機します。 別のきれいな 1.5 mL 遠心チューブに DNA の準備の管の内容を入れ、準備管内膜の中央に溶離液の脱イオン水 100 μ L を追加 (脱イオン水や溶離液は 65 ° C に加熱した)。1 分間室温で放置する混合物を許可し、12,000 × g で 1 分の混合物を遠心分離機します。 量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (Q-RT-PCR) 細菌や菌のサンプリング フィルターの相対的な存在量を定量化するを実行します。 プライマーを使用して、次のように: 細菌16S rdna 塩基515F に (5′-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3′) と 806R (5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′);真菌用ITS, its 1 領 (5′-TCC GTA GGT GAA CCT: gcg-G-3′) および its 1 領 (5′-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC 3’)。 リアルタイム PCR システムの Q-RT-PCR の試金を実行 (材料の表を参照してください)。RT-PCR 条件: predegeneration、95 ° C、10 分;変性、95 ° C、15 s;アニールと拡張子で 60 ° C、1 分。アニール変性と拡張子から 40 のサイクル。 細菌、真菌群集構造解析、細菌の16S rDNAの V1-V3 領域と pcr 法による真菌の rRNA オペロンのITS領域を増幅します。 プライマーを使用して、次のように: 細菌, V1 9F (5 ‘CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG ACG AGT TTG ATC MTG GCT CAG-3 ‘) と V3 541R (5’ CCA TCT 猫 CCC TGC GTG TCT CCG 法 CAG-バーコード-ACW TTA CCG CGG CTG CTG G-3 ‘);菌類、ITS 3F (5′-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG CAC ATC GAT GAA GAA シージーシー AGC-3′) とその 4 r (5′-CCA TCT 猫 CCC TGC GTG TCT CCG 法 CAG-バーコード-GCT CCT CCG CTT ATT GAT ATG C 3’)。 Pcr 法の 20 μ L 混合物に、2.5 mM の dNTPs の 2 μ L、5 × 0.8 μ L 各のプライマー (5 μ M)、FastPfu ポリメラーゼの 0.4 μ L の FastPfu バッファーの 4 μ L が含まれていることを確認し、10 テンプレート DNA の ng (材料の表を参照してください)。 PCR プログラムを使用して、次のように: 94 ° C、5 分。30 94 ° C の 10 サイクルに続いて s、55-60 ° C、45 s、および 90 のための 72 ° C s;20 サイクル 94 ° C の 30 s、55 ° C、45 s および 90 のための 72 ° C s;72 ° C、5 分で最後の拡張。 DNA 精製、DNA の定量化とパイロシークエンス以前研究21に記載を実行します。 5. バイオエアロゾル サンプリングと栽培 国際標準的な 6 段アンダーセンサンプラーを使用 (参照材料表) サンプル浮遊細菌の培養と流量 28.3 L/min 使用 35 分のサンプリング時間で菌をサンプラーの各段階で培養プレートを置きます。各サンプリング後 75% エチルアルコールとサンプラーを十分に消毒します。注: サンプラー流量は固定され、収集時間が手動計時によって制御されます。 浮遊粒子の空気力学的直径によって定義される、アンデルセン 6 段サンプラー サンプル 6 段階を含む VI をステージ (0.65 – 1.1 μ m)、V (1.1-2.1 μ m) のステージ、ステージ IV (2.1 – 3.3 μ m)、ステージ III (3.3-4.7 μ m)、ステージ II (4.7-7.0 μ m)、I 期(≥7.0 μ m)。 細菌粒子を収集し、大豆カゼイン ダイジェスト寒天を含む各段階の培養プレート上に入金 (材料の表を参照してください)。サンプラーの各段階で上の多くの空気取り入れ口が付いている容器があります。 24-48 h; 37 ° C で浮遊細菌のコレクション版を文化します。次に、各ステージのサンプル皿の上の細菌のコロニー数をカウントします。 重複から 6 段アンダーセンサンプラーによって収集された粒子を防ぐためには、次の式によって各サンプラー レベルでコロニー数を修正します。どこ Pr: 各レベルでコロニーの数を修正N: 数のすべてのレベル (400) でサンプラーの穴をサンプリングし、r: 植民地の実際の数。 空気の m3当たりの植民地単位を次のように計算します。場所 c: 濃度 (CFU/m3)N1-N6: 各レベルでコロニー数の修正T: サンプリング時間 (分) とF: サンプリング流量 (28.3 L/分)。 手順 5.1 – 畜産、畜舎の 4 種類を含むバイオエアロゾルを勉強する 5.3 からのメソッドを使用します。注: 家畜ファームは長春、中国であります。各豚舎で地上 2 m の中央の位置に選ばれたサンプリング場所。)細菌の文化後、板の手順 6.1 – 6.2 で説明したようにすべての植民地を扱います。 6. 培養細菌の同定 48 時間、72 時間培養の後、2 mL の遠心管に細菌を配置します。マルチソース DNA 抽出キットを使用して、これらの細菌や真菌の DNA を抽出 (材料の表を参照してください)。DNA 抽出プロセスは、セクション 4.2 で説明です。 16S rdna 塩基配列に 200 μ L の DNA 抽出のサンプルを使用します。手順 4.2、4.3、4.4 生物組成解析.で説明されているように同じプロセスを使用します。