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Environment

Zusammensetzung und Verteilungsanalyse Bioaerosole unter verschiedenen Umweltbedingungen

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58795
, , , , , ,
1Academy of Military Medical Sciences, 2Chinese Academy of Agricultural Sciences, 3The Experimental High School Attached to Beijing Normal University

Summary

Verständnis der biologischen Zusammensetzung der Umwelt Feinstaub ist wichtig für das Studium der seine erheblichen Auswirkungen auf die Gesundheit und Krankheit zu verbreiten. Hier haben wir drei Arten von Bioaerosol Probenahmeverfahren und eine biologische Analyse der Luft Mikroben um in der Luft mikrobielle Gemeinschaften unter verschiedenen Umweltbedingungen besser zu erkunden.

Abstract

Variable Mikroorganismen im Feinstaub (PM) unter verschiedenen Umweltbedingungen können signifikante Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit haben. In dieser Studie beschrieben wir ein Protokoll für mehrere Analysen der biologischen Kompositionen in ökologischen Uhr fünf Experimente präsentiert werden: (1) PM Nummer überwachen mithilfe eines Laser-Partikelzähler; (2) PM-Sammlung mit einem Zyklon Aerosol-Sampler; (3) PM-Sammlung mit einem großvolumigen Luftkeimsammler mit Filter; (4) kultivierbaren Mikroorganismen-Kollektion von der Andersen-sechs-Stufen-Sampler; und (5) Detektion von biologischen Zusammensetzung der Umwelt PM von bakteriellen 16SrDNA und Pilz ITS -Region-Sequenzierung. Wir wählten trübe Tage und ein Tierhaltungsbetrieb als zwei typische Beispiele für die Anwendung in diesem Protokoll. In dieser Studie, diese zwei Probenahmeverfahren, Zyklon Aerosol-Sampler und Filter Sampler zeigten verschiedene Sampling-Effizienz. Der Zyklon Aerosol-Sampler durchgeführt viel besser in Bezug auf Bakterien, zu sammeln, während diese beiden Methoden die gleiche Effizienz beim Pilze sammeln zeigte. Filter-Sampler können unter niedrigen Temperaturen arbeiten, während zyklonal Aerosol Sampler eine Sampling-Beschränkung für die Temperatur haben. Eine solide einwirkenden Sampler wie ein Andersen-sechs-Stufen-Sampler, kann zum Beispiel Bioaerosole direkt in das Kulturmedium erhöht die Überlebensrate der kultivierbaren Mikroorganismen verwendet werden. Allerdings stützt sich diese Methode hauptsächlich auf Kultur während mehr als 99 % der Mikroorganismen kultiviert werden kann nicht. Aus der kultivierbaren Bakterien von der Andersen-sechs-Stufen-Sampler und Proben gesammelt extrahierte DNA von zyklonal Aerosol Sampler gesammelt und Filter Sampler wurden von bakteriellen 16 s rDNA und Pilz ITS -Region-Sequenzierung erkannt. Alle oben genannten Methoden haben breite Anwendung in vielen Bereichen wie etwa der Umweltüberwachung und in der Luft Erregernachweis. Aus diesen Ergebnissen kann man schließen, dass diese Methoden unter verschiedenen Bedingungen eingesetzt werden können und können helfen, andere Forscher, die die gesundheitlichen Auswirkungen der Umwelt Bioaerosole weiter zu erforschen.

Introduction

In natürlichen Umgebungen gibt es verschiedene Arten von Mikroorganismen in Bioaerosolen, einschließlich Pilze, Bakterien, Viren und andere Mikroorganismen1. Luftgetragene Mikroorganismen, die von menschlichen Aktivitäten wie z. B. tierischen Fütterung Vorgänge in tierhaltenden Betriebe abgegeben werden können, sind wichtige Inhalte der atmosphärischen Umgebung2. Diese Mikroorganismen können nicht nur eine wichtige Rolle in der atmosphärischen Umgebung aber auch erhebliche Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit und Krankheiten verbreiten.

Als ein wichtiges Mittel zur Verbreitung von Krankheiten haben mikrobielle Aerosole große Aufmerksamkeit in der ganzen Welt angezogen. In neueren Studien fanden sich viele menschliche Krankheiten der komplexen Zusammensetzung der Umwelt Feinstaub (PM) an verschiedenen Orten, wie z. B. chemische Fabriken, Tierhaltung und versmogte Städte3,4zugeordnet werden. Die biologische Zusammensetzung der PM kann zu einigen Atem- und Herz-Kreislauf-Krankheiten in PM-exponierten Menschen5beitragen. Unterschiedlichen Körperregionen, wie z. B. die Schleimhaut, Haut, Magen-Darm-Trakt und Atemwege, können potenzielle Ziele von Mikroben an PM6,7angefügt werden. Ein erhöhtes Risiko für Lungenkrebs kann durch längere Einwirkung von PM2,58verursacht werden.

Luftkeime wurden befragt, an verschiedenen Standorten in mehreren Ländern auf der ganzen Welt, einschließlich in u-Bahnstationen, Tierkliniken, Schlachthöfe, Kompostierung, Einrichtungen, Gerbereien, Milch-Verarbeitungsanlagen, Kohleminen, Zahnkliniken und indoor-Umgebungen9,10,11,12,13,14,15,16,17, erzeugen eine große Anzahl von Berichten über biologische Aerosole. Überfüllte Orten zugeordnet Campus, Vieh Bauernhöfe und große Städte in trüben Tagen sind drei besonders wichtige öffentliche Bedingungen für die, die wir brauchen, um die Verbindungen zwischen menschlicher Gesundheit und die potenziellen Auswirkungen der PM Exposition zu erkunden. Darüber hinaus können während der Wintertage in den nördlichen Städten Chinas, PM2,5 Höchstwerte die menschliche Gesundheit. Obwohl PM2,5 toxische Wirkungen erzeugen können, indem Sie auf Atemwege Oberflächen und auflösen in Blut18, ist noch nicht klar ob und wie die Mikroben befestigt, PM2,5 menschliche Gesundheit19 beeinträchtigen könnten ,20. Tierhaltung sind eine der Hauptquellen der PM und mikrobielle Aerosole in der Luft. Die große Zahl von Krankheitserregern, wie z. B. Influenza-Virus und Brucella Melitensis, die durch Aerosole in den Feldern rund um Tierhaltung durchgeführt werden sind wichtige Faktoren, die zu Erkrankungen der Atemwege bei Vieh und Geflügel Arbeiter.

In dieser Studie haben wir mehrere Arten von Analysen von Bioaerosolen, einschließlich PM Nummer Überwachung, Bioaerosol-Sammlung und Analyse der biologischen Zusammensetzung erkundet. Luftproben wurden durch einen Zyklon Aerosol-Sampler, ein Großserien-Luft-Sampler mit Filter und einem Andersen-sechs-Stufen-Sampler gesammelt. Dann wurden die Proben von diesen drei Sampler von biologische Analyse einschließlich bakterielle 16 s rDNA und Pilz ITS Sequenzierung zu bestimmen, deren biologische Zusammensetzung analysiert. Hier zeigen wir repräsentative Ergebnisse aus dem Bioaerosol Proben während Beijing trübe Tage und Tierhaltungsbetriebe, die darauf hinweist, dass Bioaerosole große Auswirkungen auf die menschliche und tierische Gesundheit haben könnte. Der Vergleich zwischen Flüssigkeit und Filter Stichprobenverfahren wurden auch in dieser Studie vor allem basierend auf den Daten von 16 DNA und Pilz ITS Sequenzierung untersucht.

Protocol

1. PM Anzahl Überwachung Verwenden Sie ein airborne Laser-Teilchen gegen (siehe Tabelle der Materialien), um die Gesamtzahl von PM zu bestimmen. Sammeln Sie die PM von der Luft-Probenahme-Port auf der Oberseite der airborne Laser Partikelzähler.Hinweis: Diese Partikelzähler ist eine Automatisierung Ausrüstung und es kann unabhängig voneinander arbeiten, wenn das Programm einschließlich Probenahme, Intervall, Abholzeiten, etc. auf dem Touchscreen eingestellt worden ist. Statten Sie das Instrument mit einem Sensor zur Überwachung von Temperatur und Luftfeuchtigkeit. Messung und Aufzeichnung von Temperatur und Relative Luftfeuchtigkeit Daten gleichzeitig alle 5 Minuten. Insgesamt messen und notieren Sie 6 verschiedene Partikelgrößenklassen (0,3-0,5 μm, 0,5-0,7 μm, 0,7 bis 2,5 μm, 2,5-5 μm, 5-10 μm und > 10 μm) gleichzeitig messen alle 5 min. 4 andere Partikelgrößenklassen (0,3-0,5 μm, 0,5-1 μm, 1-3 μm und ≥ 3 μm). Sammeln Sie die Luftproben aber das Probenahme-Loch an der Oberseite der Sampler und verwenden Sie Testmodule innerhalb der Sampler zur Messung der Partikelgröße von jeder Uhr. Dann werden die Daten automatisch gespeichert. Alle oben genannten Prozesse kann automatisch durchgeführt werden, nachdem die relative Parameter, einschließlich Probenahme und Zählbereich, obwohl die Mini Touch Displayer von der airborne Laser Partikelzähler eingestellt sind.Hinweis: Diese Partikelzähler ist eine Automatisierung Ausrüstung und Testmodule, die die Anzahl der PM von verschiedenen Partikelgrößenklassen hat. Um experimentelle Standardfehler zu beurteilen, zu gewährleisten, dass verschiedene Partikelgrößenklassen mit mindestens 15 Wiederholungen gezählt werden. Sicherzustellen Sie, dass Lesungen in den internen Speicher des Gerätes gespeichert und anschließend analysiert. Sicherstellen Sie, dass die Analyse der primären Daten PM Nummer Konzentration, die ANOVA-Test und der Anteil der PM in jeder Größenklasse umfasst. Zum Beispiel, wie in Figur 1Adargestellt, die PM Nummer Konzentrationen im Dezember (237.6 Partikel/cm3) waren deutlich höher als im Oktober (Durchschnitt: 110,2 Partikel/cm3) (ANOVA; P-Value < 0,05). Abbildung 1 b zeigt, dass die Anzahl der Partikel kleiner als 3 μm entfielen mehr als 99 % der Gesamtzahl. Verwenden Sie den Laser Partikelzähler, um die PM Nummer Konzentrationen zu überwachen und die Daten automatisch zu speichern. Verwenden Sie eine USB-Flash-Disk zum Exportieren von Daten in den Computer und den ANOVA-Test durchführen. (2) PM-Kollektion von Zyklon Aerosol-Sampler Führen Sie die PM Probenahme in einem offenen Bereich ohne alle nahe gelegenen großen Verschmutzungsquellen auf ∼2 m über dem Boden. Zeichnen Sie die Position des Standortes Probenahme. Der Campus des Beijing Institute of Technology ist z. B. die folgenden: 39 ° 57′ 51,0 ” N; 116 ° 19′ 38,5 ” E. Verwenden Sie einen Zyklon Aerosol-Sampler, um Luftproben sammeln. Verwenden Sie einen Sampler-Fluss von 323 L/min und einer Sammlung Zeit von 6 h.Hinweis: Der Sampler-Volumenstrom ist fixiert und kann nicht geändert werden. Die Abholzeit wird durch manuelle Zeitmessung gesteuert, da gibt es nur eine Start und Stopp -Taste auf diesem Sampler. Verwenden Sie steriles Wasser, um das Innere der zyklonalen Aerosol-Sampler 3 Mal vor der Abholung waschen, und verwenden Sie die automatische Reinigungsfunktion kontinuierlich die collect Taste 3 mal 3 Mal. Drücken Sie sammeln beginnen Probenahme und die Pumpe drücken, um Stichproben zu stoppen. Setzen Sie den Sampler auf einem Regal oder Boden mit niemand in Position halten. Alle Proben im Dunkeln bei-20 ° C bis die nachfolgenden Analysen zu bewahren. (3) PM Sammlung von Filtern Führen Sie die PM Probenahme in einem offenen Bereich ohne alle nahe gelegenen großen Verschmutzungsquellen auf ∼2 m über dem Boden. Zeichnen Sie die Position des Standortes Probenahme. Der Campus des Beijing Institute of Technology ist beispielsweise wie folgt: 39 ° 57′ 51,0 ” N; 116 ° 19′ 38,5 ” E. Sammeln Sie die PM-Proben auf 20,32 × 25,4 cm2 Filter (siehe Tabelle der Materialien) mithilfe einer großvolumigen Luftkeimsammler (siehe Tabelle der Materialien) mit einer Durchflussrate von 1.000 L/min. Flow Rate und Sammlung Zeit festgelegten relative Auto-Programmierung. Alle ausgewählten Filter im Dunkeln bei-20 ° C bis die nachfolgenden Analysen zu bewahren. 4. biologische Zusammensetzung Analyse Für die biologische Zusammensetzung Analyse verwenden jedes flüssige Probe aus dem Zyklon Aerosol Sampler oder Filter Beispiel für DNA-Extraktion von einem multisource DNA-Extraktion Kit (siehe Tabelle der Materialien) entsprechend des Herstellers Protokollen. Verwenden Sie für Proben aus der Großserien-Luft-Sampler mit Filtern 1/8 der Samples Filter für DNA-Extraktion. Setzen Sie den Filter in einem 50 mL-Tube mit der Probe nach innen und der Rückseite mit Blick auf die Rohrwand. Fügen Sie 10 Perlen in den zentralen Orten auf der Seite des Filters mit der Probe. Wirbel der Röhre für 15 min bei Raumtemperatur. Pipette die Flüssigkeit in der Röhre in einem sauberen 50 mL Zentrifugenröhrchen weiterhin die DNA-Extraktion. Extrahieren Sie die DNA aus der Probe von den Prozessen wie folgt. Bakterien Probe bei 2.000 x g für 5 min Zentrifugieren, überstand zu entfernen und Bakterien in 2 mL sterile PBS-Puffer auszusetzen. Die Aussetzung der Bakterien in einem 2 mL Zentrifugenröhrchen zu sammeln und anschließend Zentrifugieren bei 2.000 x g für 5 min um die überstehende Lösung zu verwerfen. Fügen Sie 350 μL der sterilen PBS-Puffer mit den schwebenden Bakterien zur Lösung. Fügen Sie 0,8 mL RNase A. 150 μl Puffer CL und 8 μL Proteinase K, und mischen Sie sofort durch Wirbel für 1 min schütteln. Nach kurzen Zentrifugation bei 1.000 x g für 30 s (keine Rückstände an der Wand), habe das zentrifugale Rohr in 56 ° C Wasser für 10 Minuten. Fügen Sie 350 μL der Puffer PD und Mischung für 30 s und dann Zentrifuge für 10 min bei 12.000 x g. Legen Sie die DNA-Vorbereitung-Röhre in ein 2 mL Zentrifugenröhrchen, und übertragen Sie die Mischung in Schritt 4.2.6 zur Vorbereitung Röhre gemacht. Dann für 1 min bei 12.000 x g zentrifugieren. Verwerfen Sie das Filtrat, setzen Sie den Inhalt des Röhrchens Vorbereitung wieder in den ursprünglichen 2 mL Zentrifugenröhrchen, und fügen Sie 50 μL der Puffer W1. Zentrifugieren Sie die Mischung für 1 min bei 12.000 x g. Verwerfen Sie das Filtrat, setzen Sie den Inhalt des Röhrchens Vorbereitung wieder in den ursprünglichen 2 mL Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 700 μl Puffer W2 hinzu. Zentrifuge die Mischung für 1 min bei 12.000 x g. Wiederholen Sie diesen Schritt wieder mit 700 μl Puffer W2 zu waschen. Verwerfen Sie die überflüssige Flüssigkeit, und setzen Sie den Inhalt des Röhrchens Vorbereitung wieder in den ursprünglichen 2 mL Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Mischung für 1 min bei 12.000 x g. Der Inhalt des Röhrchens DNA-Vorbereitung in einem anderen sauberen 1,5 mL Zentrifugenröhrchen und 100 μL des Elutionsmittels oder deionisiertes Wasser bis zur Mitte der Membran in der Vorbereitung-Röhre (deionisiertes Wasser oder Laufmittel wurde auf 65 ° C erhitzt). Lassen Sie die Mischung für 1 min bei Raumtemperatur stehen, und Zentrifugieren Sie die Mischung für 1 min bei 12.000 x g. Führen Sie quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (Q-RT-PCR), die relativen Häufigkeiten von Bakterien und Pilzen auf den Sampling-Filtern zu quantifizieren. Grundierungen wie folgt zu verwenden: für bakterielle 16 s rDNA, 515F (5′-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3′) und 806R (5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′); und für den Pilz ITS, ITS1 (5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′) und ITS1 (5′-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3 “). Die Q-RT-PCR-Assays auf eine Real-Time PCR System laufen (siehe Tabelle der Materialien). RT-PCR Zustand: Predegeneration, 95 ° C, 10 min; Degeneration, 95 ° C, 15 s; Tempern und Erweiterung, 60 ° C, 1 min; 40 Zyklen von Degeneration, Tempern und Erweiterung. Verstärken Sie für bakterielle und Pilzinfektionen Gemeinschaft-Struktur-Analyse die V1-V3 Region der bakteriellen 16 s rDNA und ITS -Region von Pilz rRNA-Operon durch PCR. Der Primer wird wie folgt verwendet: für Bakterien, V1-9F (5′-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG ACG AGT TTG ATC MTG GCT CAG-3′) und V3-541R (5′-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-Barcode-ACW TTA CCG CGG CTG CTG G-3 ‘); und für Pilze, ITS-3F (5′-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG CAC ATC GAT GAA GAA CGC AGC-3′) und ITS-4R (CCA 5’ TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-Barcode-GCT CCT CCG CTT ATT GAT ATG C-3 “). Sichergestellt werden, dass die 20 μL Mischung von PCRs 2 μL von 2,5 mM dNTPs, 4 μL von 5 × FastPfu Puffer, 0.8 μL jeder Grundierung (5 μM), 0.4 μl der FastPfu Polymerase und 10 ng DNA-Vorlage (siehe Tabelle der Materialien). Verwenden Sie die PCR-Programm wie folgt: 94 ° C für 5 min; gefolgt von 10 Zyklen von 94 ° C für 30 s, 55-60 ° C für 45 s und 72 ° C für 90 s; 20 Zyklen von 94 ° C für 30 s, 55 ° C für 45 s und 72 ° C für 90 s; und eine letzte Verlängerung bei 72 ° C für 5 Minuten. Durchführen Sie DNA-Reinigung, DNA-Quantifizierung und Pyrosequenzierung wie in einer früheren Studie 21beschrieben. 5. Bioaerosol Probenahme und Anbau Einen internationalen standard Andersen sechs-Stufen-Sampler zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien), kultivierbarer Bakterien und Pilze mit einer Durchflussrate von 28,3 L/min Nutzung einer Abtastzeit von 35 min. probieren setzen die Kultur-Platte in den einzelnen Phasen des Samplers. Desinfizieren Sie hinreichend den Sampler mit 75 % Ethylalkohol nach jeder Probenahme.Hinweis: Der Sampler-Volumenstrom ist behoben und die Abholzeit erfolgt durch manuelle Zeitmessung. Probe der sechs Etappen mit dem Andersen-sechs-Stufen-Sampler, der durch die aerodynamischen Durchmesser von luftgetragenen Partikeln definiert wird, einschließlich der Stufe VI (0,65 – 1,1 μm), Stufe V (1,1 – 2.1 μm), Phase IV (2,1-3,3 μm), Stufe III (3,3 – 4,7 μm), Stufe II (4,7 – 7,0 μm) und Stufe I (≥7.0 μm). Sammeln Sie die bakterielle Partikel und Einzahlung auf die Kultur-Platte in den einzelnen Phasen mit Soja-Kasein-Digest-Agar (siehe Tabelle der Materialien). Es ist ein Container mit vielen Lufteinlässe an der Spitze in den einzelnen Phasen des Samplers. Kultur der Luftkeime Sammlung Platten bei 37 ° C für 24-48 h; dann zählen Sie die Kolonie Zahlen von Bakterien auf der Probenschale für jede Stufe. Um zu verhindern, dass die Partikel von der Andersen-sechs-Stufen-Sampler aus überlappenden zusammengetragen, korrigieren Sie die Zahl der Kolonien auf jeder Ebene Sampler nach folgender Formel:wo Pr: Anzahl der Kolonien auf jeder Ebene korrigiertN: Anzahl der Löcher des Samplers auf allen Ebenen (400), Probenahme undr: die tatsächliche Anzahl der Kolonien. Berechnen Sie die Einheit der Kolonien pro m3 Luft wie folgt:wo C: Konzentration (KBE/m3),N1-N-6: die korrigierte Zahl der Kolonien auf jeder EbeneT: Zeit (min), Probenahme undF: Fluss Abtastrate (28,3 L/min). Verwenden Sie die Methoden von Schritte 5.1 – 5.3 Bioaerosol im Tierhaltungsbetrieb, darunter vier Arten von Schweineställe zu studieren.Hinweis: Der Vieh-Hof liegt in Changchun, China. Die zentrale Lage 2 m über dem Boden in jedem Schweinestall wurde als Standort Probenahme ausgewählt.) Nach Kultur von Bakterien behandeln Sie alle Kolonien in den Platten wie Schritte 6.1 – 6.2 beschrieben. 6. Identifikation von kultivierbarer Bakterien Legen Sie nach 48 h oder 72 h der Kultivierung die Bakterien in einer 2 mL Zentrifugenröhrchen. Mit einem multisource DNA-Extraktion Kit extrahieren die DNA von diesen Bakterien oder Pilzen (siehe Tabelle der Materialien). Die DNA-Extraktion wird in Abschnitt 4.2 beschrieben. Verwenden Sie 200 μl DNA-Extraktion Probe für 16 s rDNA Sequenzierung. Verwenden Sie die gleichen Prozesse wie beschrieben Schritte 4.2, 4.3 und 4.4 biologische Zusammensetzung Analyse.

Representative Results

In dieser Studie führten wir eine Bewertung der die Gesamtverteilung PM und eine umfassende Analyse der Bioaerosole in einem Milchviehbetrieb von September bis Dezember. Viele Umweltfaktoren tragen zur Verteilung von Aerosolpartikeln. Wir untersuchten die Konzentration und Größe Verteilungen von PM in einem Kuhstall mithilfe einer TSI Laser Partikelzähler. Wie in Abbildung 1Adargestellt, war die Konzentration von Aerosolpartikeln im Dezember höchsten und niedrigsten im Oktober, die durch Veränderungen in Temperatur und Feuchtigkeit (Tabelle 1) verursacht werden kann. Die Konzentration von inhalierbaren Aerosolpartikel (0,3-3,0 µm) entfielen mehr als 99 % des gesamten Partikelkonzentration (Abbildung 1 b), und die Partikel in diesem Bereich konnte der tiefen Atemwege verursacht ernsthafte Gefahren für den Menschen zu erreichen und Tiere. Analyse der biologischen Zusammensetzung der Proben erfolgt durch DNA-Extraktion, bakterielle 16SrDNA und Pilz ITS -Region-Sequenzierung statt Mikroorganismus Kultur. Die biologische Analyse der Bioaerosol Proben mit einem Zyklon Aerosol-Sampler oder eine großvolumige Luftkeimsammler mit Filter vergleichen wir vorläufig die Wirkungsgrade dieser beiden Methoden in Bakterien und Pilze zu sammeln. Abbildung 2 zeigten die Analyseergebnisse der Bioaerosol Proben gesammelt während Beijing trübe Tage auf dem Campus der Beijing Institute of Technology im 20. Dezember 2016. Für Bakterien Sammlung zeigten die Ergebnisse, dass der Zyklon Aerosol-Sampler mit Filter (Abbildung 2A) viele weitere Gattungen als großvolumige Luftkeimsammler gesammelt. Für Pilze Sammlung zeigte diesen Sampler gleich Sammlung Effizienz und fast der gleichen Gattung Häufigkeiten (Abb. 2 b). Aus den Ergebnissen, die in Abbildung 2dargestellt konnten wir die Konstellation Wirkungsgrade dieser beiden Methoden für Bakterien und Pilze zu messen. Für Bakterien Sammlung der zyklonalen Aerosol-Sampler viel besser als die Großserien-air Sampler mit Filter, weil die Proben aus dem ehemaligen zeigten eine höhere Gattung Fülle (Abbildung 2A) durchgeführt. Der Pilz Sequenzierung Analyse der zwei Proben aus verschiedenen Probenahmeverfahren ergab jedoch nahezu identische Gemeinschaftsstrukturen (Abb. 2 b). Wir untersuchten kultivierbare Bakterien mit einem Andersen-sechs-Stufen-Sampler. Wie in Abbildung 3dargestellt, wurde die Kolonie Zahlen kultivierbarer Bakterien für Phase I-VI Partikel reduziert. Stufe I Partikel (Teilchen Größe > 8,2 µm) hatten die höchsten Zahlen von kultivierbarer Bakterien-Kolonien. Der Anteil der Stufe I Kolonien in vier verschiedene Typen von Schweineställe einschließlich Abferkeln Haus, Schwangere Sau Haus, Mast und Entwöhnung Haus war 33 %, 30 %, 26 % und 34 %, beziehungsweise. Der Anteil der Phase II Kolonien in vier verschiedene Typen von Schweinezucht war 20 %, 22 %, 19 % und 20 % beziehungsweise. Der Anteil der Phase III Kolonien auf vier verschiedene Arten der Schweinezucht wurde bzw. 18 %, 18 %, 18 % und 19 %. Der Anteil der Phase IV Kolonien in vier verschiedene Typen von Schweineställe betrug 17 %, 16 %, 16 % und 16 % bzw.. Der Prozentsatz der Stufe V Kolonien in vier verschiedene Typen von Schweinezucht war jeweils 10 %, 10 %, 14 % und 6 %. Phase VI Partikel (Teilchen Größe < 1,0 µm) hatte die niedrigsten Zahlen der kultivierbarer Bakterien-Kolonien. Der Anteil der Stufe VI Kolonien in die vier verschiedenen Arten von Schweinezucht war 3 %, 5 %, 6 % und 5 %, beziehungsweise. Die Luftproben wurden in vier verschiedenen Arten von Schweinezucht mit einem Andersen-sechs-Stufen-Sampler gesammelt und dann unter geeigneten Bedingungen gezüchtet. Die gesamte Genom DNA kultivierbarer Bakterien aus jeder Partikel-Phase gesammelt wurde gewonnen und durch bakterielle 16 s rDNA und Pilz ITS -Region-Sequenzierung erkannt. Insgesamt 91 Gattungen mit 158 Arten von Bakterien wurden identifiziert, in den kultivierbaren Bakterien in Schweineställe. Die Gemeinschaftsstrukturen kultivierbarer Bakterien in vier verschiedene Typen von Schweineställe, einschließlich Abferkeln Haus, schwanger säen Haus, Mast und Entwöhnung Haus sind in Abbildung 4 dargestellte mit Daten aus Phase ich Stufe VI. Der Inhalt der verschiedenen vorherrschende bakterielle Gattungen ist nicht das gleiche unter verschiedenen Futterkomponente. Abbildung 1: die Konzentration und Größe Verteilung der Uhr in vier verschiedenen Monaten. (A) Boxplot PM Anzahl während des Studiums. Jede Boxplot umfasst das Maximum, Minimum, Median, zwei Quartile und abnorme Value der Datenbank. (B) durchschnittliche Größe Verbreitungskarten von PM. Es gab 80 Kühe im Haus von September bis Dezember. Der Anteil der PM (≥ 3 µm) in vier Monaten (September, Oktober, November und Dezember) war 0,005, 0,005 und 0,002 0,002. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: biologische Analyse von Bioaerosol Proben gesammelt durch zwei Samplern. (A) und (B) zeigen Sie die Häufigkeiten der bakterielle oder Pilzinfektionen Gattungen in Bioaerosol Proben mit unterschiedlichen Erhebungsmethoden. Benetzte Wand Luftkeimsammler stellt den zyklonalen Aerosol-Sampler. Quarz Filter stellt die großvolumigen Luftkeimsammler mit Filtern. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: durchschnittliche hierarchische Verbreitungskarten kultivierbarer Bakterien auf vier Arten von Futterkomponente. Die vier Arten der Schweinezucht sind Abferkeln Haus, Schwangere Sau Haus, Haus Mast und Entwöhnung Haus. S1 bis S6 repräsentieren die sechs Partikel Phasen (I bis VI) von der Andersen-sechs-Stufen-Sampler gesammelt. Die Etappen wurden durch die aerodynamischen Durchmesser von luftgetragenen Partikeln, einschließlich der Stufe VI definiert (0,65-1,1 µm), Stufe V (1,1-2,1 µm), Phase IV (2.1-3.3 µm), Stufe III (3.3 4.7 µm), Stufe II (4,7 7,0 µm) und Stufe I (7.0 µm). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4: Bakteriengemeinschaft Strukturen mit unterschiedlichen Häufigkeiten in die Luftproben. Die Luftproben wurden in vier verschiedenen Arten von Schweinezucht mit einem Andersen-sechs-Stufen-Sampler gesammelt und dann unter geeigneten Bedingungen gezüchtet. Die gesamte Genom DNA der kultivierbaren Bakterien in den einzelnen Teilchen Phasen von der Andersen-sechs-Stufen-Sampler wurde gewonnen und durch bakterielle 16 s rDNA Sequenzierung erkannt. Die Zahlen 1 bis 6 in jedem Schweinestall repräsentieren Partikel Stufen I bis VI gemessen von der Andersen-sechs-Stufen-Sampler. Der Text auf der rechten Seite enthält der Gattungsname für jedes Bakterium. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

In dieser Studie haben wir einige repräsentative Ergebnisse, die in trüben Tagen und in der Tierhaltung stammen. Die Ergebnisse von Bioaerosol Proben in Beijing dunstigen Tagen ermöglicht ein besseres Verständnis der biologischen Kompositionen der biologischen Zusammensetzung des PM ohne PM während Beijing trübe Tage anwesend. Die Ergebnisse von Proben aus Tierhaltung bieten auch grundlegende Daten für Umgebungsluft Qualitätskontrolle in Schweineställe und eine theoretische Fundierung und technischen Support für die gesunde Zucht und sichere Produktion in Tierhaltung. Viele Umweltfaktoren wie Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Windgeschwindigkeit, könnte für den Vertrieb von Aerosolpartikeln in den Kuhstall (Abbildung 1) beitragen. Frühere Studien haben gezeigt, dass die PM in Zuchtbetriebe kommt hauptsächlich vom Futter, Kot, Fell und Federn, die die tierischen Aktivitäten bezogen werden kann. Die Umweltfaktoren beeinflussen nicht nur tierische Aktivitäten, aber auch die Aggregation und Verbreitung von PM in einer relativ geschlossenen Kuhstall. Daher erkennen wir verschiedenen Konzentrationen und Größenverteilung der PM in vier verschiedenen Monaten. Außerdem die sanitären Zustand, Fütterung, Methode und tierische Aktivität unterschieden sich zwischen den vier Arten der Schweinezucht, die auch ihre Gemeinschaftsstruktur kultivierbarer Bakterien in der Luft (Abbildung 4) beeinträchtigen könnten.

Jedoch in dieser Studie konzentrierten wir uns hauptsächlich auf die verfügbaren Methoden, die wir nutzen könnten, um die Erstellung und Verteilung von Bioaerosolen unter verschiedenen Umweltbedingungen zu studieren. Im Vergleich mit anderen mikrobielle Proben, die von luftgetragenen Mikroorganismen haben sehr niedrige Konzentrationen und werden gemischt mit einer großen Anzahl von Verunreinigungen, wie anorganische Staubpartikel, die gewisse Schwierigkeiten bei der Erfassung und Erkennung von einführen solche Mikroorganismen21. Daher sollten geeignete Methoden der Erfassung und Erkennung für mikrobielle Aerosole ausgewählt werden. Die Entnahme von Proben mikrobielle Aerosol erfolgt in der Regel mithilfe der Niederschlag Methode oder Spezialgeräte, die Mikroorganismen in flüssige, halbfeste oder feste Probenahme mittlere22,23,24 zu sammeln . Dann werden einige entsprechende technische Behandlung und spezifische Tests und Analysen anschließend25durchgeführt. Das Probenahme-Medium sollte Mikroorganismen, die Erkennung und Analyse26zugeordneten Fehler zu reduzieren intakt halten. Verschiedenen Aerosol Mikroorganismus Sampler haben jedoch unterschiedliche Auswirkungen auf die Integrität der Proben aufgrund ihrer unterschiedlichen Stichproben Prinzipien und Medien. Menschen haben viele Arten von Bioaerosol Sampler entworfen, mit denen verschiedene Probenahme Prinzipien, wie träge Impaktion, Filtration Widerstands und elektrostatischen Niederschlag27.

Auswirkungen auf Samplern kann Luft PM in das Sampling-Medium mit hoher Geschwindigkeit drücken Sie mithilfe von Absauganlagen. Es gibt zwei Arten von Auswirkungen auf Samplern: fester und flüssiger. Solide Auswirkungen auf Samplern kann zur Probe Bioaerosole in einer niedrigen Konzentration und kann fast unempfindlich gegen Luft fließen28. Aerosol-Partikel unterschiedlicher Größe können vorläufig gezeigt und Mikroben können direkt in das Kulturmedium, das erhöht die Überlebensrate der kultivierbaren Mikroorganismen10abgetastet werden. Aufgrund träge Auswirkungen mikrobielle Aerosol-Partikel kollidieren leicht am gleichen Standort und Kolonien können leicht nach Kultur überschneiden. Derzeit ist der am häufigsten solidere einwirkenden Sampler der Andersen-6 mikrobielle Aerosol Sampler. In dieser Studie haben wir einen Andersen-sechs-Stufen-Sampler um kultivierbaren Bakterien verteilt in Luft PM in verschiedenen Größen zu studieren.

Zyklon Aerosol Sampler verwenden Wirbelstürme Spirale Luft mit hoher Geschwindigkeit in einen Zylinder oder Kegel. Bioaerosol Partikel können aus den Luftstrom durch die Zentrifugalkraft, getrennt werden, was bedeutet, dass Mikroben in der Innenwand des Samplers stoßen können und dann durch den Sampling-Puffer gesammelt werden. Diese Methode ist praktisch und kann lange Zeiten in großen Stichproben und sampling-Operationen verwendet werden. Diese Methode kann nicht jedoch bei niedrigen Temperaturen implementiert werden, da der Vorgang Flüssigkeit abhängig ist. Der zyklonalen Aerosol-Sampler in dieser Studie verwendeten ist ein zyklonal benetzte Wand Aerosol-Sampler, der extrahieren und zerstreute Krankheitserreger und Partikel aus gesampelten Luft in eine kleine Menge Wasser für Analyse29übertragen kann.

Filter-Sampler können unter niedrigen Temperaturen arbeiten und können Partikel ab einer bestimmten Größe probieren. Aber sie haben einen großen Einfluss auf die mikrobielle Aktivität und sind anfällig für Beschädigungen, die großen Einfluss auf spätere Studien zur Probenahme Aktivität. In dieser Studie wurden Bioaerosol Proben aus Beijing trübe Tage gesammelt, mit einem großvolumigen Luftkeimsammler mit Filter und einen Zyklon Aerosol-Sampler. Ziel dieses Experiments war es, analysiert die biologische Zusammensetzung der PM ohne die Trennung und die Kultivierung von Mikroorganismen in der Luft. Daher wurden diese beiden Probenahmemethoden geeignet für diese Studie. Für die zyklonalen Aerosol-Sampler-Methode in der Luft Mikroben in einer niedrigen Konzentration in den laufenden Puffer leicht extrahiert werden können und können dann bequem ohne zusätzliche Behandlung, die gewöhnlich für Filter Proben analysiert werden. In dieser Studie, diese zwei Probenahmeverfahren, Zyklon Aerosol-Sampler und Filter Sampler zeigten verschiedene Sampling-Effizienz. Die zusätzliche Behandlung, die gewöhnlich für Filter Proben, wie erholt sich die Probe aus dem Filter ist einer der wichtigsten Unterschiede zwischen diesen beiden Methoden. Außerdem wurden die Luftproben gesammelt direkt in den laufenden Puffer durch Zyklon Aerosol-Sampler, während die andere Methode Proben auf Filtern gesammelt. Die Eigenschaften der verschiedenen Art der Sampling-Methode können zu dieser verschiedenen Probenahme Effizienz beitragen. Wir können davon ausgehen, dass der Zyklon Aerosol-Sampler die bessere Wahl für Mikroorganismen-Sammlung ist, und diese Annahme weitere Bestätigung braucht.

In dieser Studie wurden bakterielle 16 s rDNA und Pilz ITS -Region-Sequenzierung verwendet, um die biologische Analyse der Bioaerosole durchzuführen. 16SrDNA -Sequenzierung ist die Bestimmung der 16 s rDNA Segmente in der mikrobiellen Genoms30. 16 s rDNA ist weit verbreitet in Prokaryoten hohe Erhaltungs-und Spezifität, wodurch es nützlich für die Identifizierung von Mikrobenarten31vorhanden. Die Sequenzierung des gesamten Genoms erfordert nur die Extraktion von genomischer DNA und anschließende Sequenzierung. Neben der Produktion einer große Menge an Daten, ermöglicht dabei auch eine umfassendere Analyse der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur. Außerdem können Metagenomik auch in dieser Studienrichtung verwendet werden, indem Sie weitere Informationen in der Zukunft. Handelsman Et Al. schlug zuerst das Konzept der Metagenom in einem 1998 Papier auf Mikroben im Boden32. In späteren Studien wurde das Konzept der Metagenom allmählich akzeptiert, und viel geforscht wurde auf die Mikroben im menschlichen Darm, Meer und Boden33,34,35enthalten. Mit der Unterstützung von Hochdurchsatz-Sequenzierung Metagenomik-Technologie hat sich rasant entwickelt, und es spielt eine immer wichtigere Rolle in der Erforschung der Erregernachweis. Traditionelle mikrobielle Forschungsmethoden beruhen hauptsächlich auf Kultur zur Trennung und Reinigung. Jedoch können nicht viele Studien durchgeführt werden, da mehr als 99 % der Mikroorganismen kultiviert werden kann nicht. Im Gegensatz zu traditionellen Methoden nehmen Metagenomik die genetische Information von der Mikroben in der Umgebung als Ganzes ohne die Notwendigkeit, einzelne Organismen36zu trennen. Eine umfassende Analyse aller daraus resultierenden Mikroorganismen kann direkt durchgeführt werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen zeigte diese Studie mehrere Erkennung, Probenahme und Analyse-Methoden, die für Studien über die biologische Zusammensetzung des ökologischen Uhr PM Überwachung verwendet werden könnte; PM Probenahme durch ein Andersen-sechs-Stufen-Sampler, ein Großserien-Luft-Sampler mit Filter oder Zyklon Aerosol Sampler; und anschließende biologische Analyse anhand von DNA-Sequenzierung. In der Praxis können diese Methoden unter verschiedenen Umweltbedingungen, wie viele Arten der Tierhaltung verwendet werden. Unsere Protokolle und Ergebnisse helfe anderen Forschern auf der ganzen Welt weiter die gesundheitlichen Auswirkungen von Pilz- und bakterielle Bioaerosole in die Umgebung zu erkunden.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Finanzieller Unterstützung für diese Studie kam von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 41775148). Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung.

Materials

airborne laser particle counter TSI Inc, MN, USA model 9306
Andersen six-stage sampler Tisch Inc, USA TE-20-600
AxyPrep multisource DNA Miniprep Kit Axygen, NY, USA AP-MN-MIS-GDNA-50G
FastPfu Polymerase TransGen Inc., Beijing, China AP221-01
High-volume air sampler Beijing HuaRui HeAn Technology Co., Ltd., China HH02-LS120
Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific, USA Applied Biosystems® 7500
Soybean-Casein Digest Agar Becton, Dickinson and company, MD, USA 211043
Tissuquartz filters Pall, NY, USA 7204
Wetted-Wall Air Sampler Research International, Inc. 17161 Beaton Road SE
Monroe, Washington 98272-1034 USA		 SASS 2300
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Wang, Z., Li, J., Qian, L., Liu, L., Qian, J., Lu, B., Guo, Z. Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions. J. Vis. Exp. (143), e58795, doi:10.3791/58795 (2019).
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