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Environment

Composition et analyse de la Distribution des bioaérosols sous différentes Conditions environnementales

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58795
, , , , , ,
1Academy of Military Medical Sciences, 2Chinese Academy of Agricultural Sciences, 3The Experimental High School Attached to Beijing Normal University

Summary

Comprendre la composition biologique des matières particulaires environnement est important pour l’étude de ses effets sur la santé humaine et de la propagation des maladies. Ici, nous avons utilisé trois types de méthodes d’échantillonnage aux bioaérosols et une analyse biologique des microorganismes aéroportés pour mieux explorer les communautés microbiennes aéroportées sous différentes conditions environnementales.

Abstract

Micro-organismes variables en matières particulaires (MP) dans des conditions environnementales différentes peuvent avoir des impacts significatifs sur la santé humaine. Dans cette étude, nous avons décrit un protocole pour plusieurs analyses des compositions biologiques dans l’environnement h cinq expériences sont présentées : (1) PM numéro suivi à l’aide d’un compteur de particules laser ; (2) PM collection à l’aide d’un échantillonneur aérosol cyclonique ; (3) PM collection à l’aide d’un échantillonneur d’air grand volume avec des filtres ; (4) collection de microbes cultivables de l’échantillonneur de six étages Andersen ; et (5) détection de composition biologique d’environnement PM par bactériennes 16SrDNA et séquençage de la région des ITS fongique. Nous avons sélectionné les jours brumeux et une ferme d’élevage comme deux exemples typiques de l’application du présent protocole. Dans cette étude, ces deux méthodes d’échantillonnage, échantillonneur aérosol cyclonique et échantillonneur de filtre, a montré l’efficacité d’échantillonnage différent. L’échantillonneur cyclonique aérosol obtenu de meilleurs résultats en termes de collecte de bactéries, alors que ces deux méthodes ont montré la même efficacité dans la collecte de champignons. Échantillonneurs de filtre peuvent travailler dans des conditions de basse température pendant que les échantillonneurs aérosol cyclonique ont une limitation d’échantillonnage pour la température. Un échantillonneur d’impact solid, comme un sampler de six étages Andersen, permet aux bioaérosols échantillon directement dans le milieu de culture, ce qui augmente le taux de survie des micro-organismes cultivables. Toutefois, cette méthode repose principalement sur la culture alors que plus de 99 % des microbes ne peuvent pas être cultivées. ADN extrait de bactéries cultivables recueillies par l’échantillonneur de six étages de Andersen et échantillons recueillis par échantillonneur aérosol cyclonique et échantillonneur de filtre ont été détectés par bactérienne ADNr 16 s et séquençage de la région des ITS fongique. Toutes les méthodes ci-dessus peuvent avoir l’application large dans de nombreux domaines d’étude, telles que la surveillance de l’environnement et de la détection des pathogènes aéroportés. D’après ces résultats, nous pouvons conclure que ces méthodes peuvent être utilisés dans des conditions différentes et peuvent aider les autres chercheurs à explorer davantage les impacts sur la santé des bioaérosols environnementale.

Introduction

En milieu naturel, les divers types de micro-organismes existent dans bioaérosols, y compris les champignons, les bactéries, les virus et autres microorganismes1. Les micro-organismes aéroportés, qui peuvent être émises par certaines activités humaines comme les opérations de l’alimentation animales dans les fermes d’élevage, sont le contenu important de l’environnement atmosphérique de2. Ces microorganismes peuvent non seulement jouent un rôle important dans l’environnement atmosphérique, mais aussi avoir des impacts significatifs sur la santé humaine et de la propagation des maladies.

Comme un moyen important de propagation de maladies, aérosols microbiens ont attiré l’attention du monde entier. Dans des études récentes, plusieurs maladies humaines se sont avérés pour être associé à la composition complexe d’environnement matières particulaires (MP) à différents endroits, tels que des usines chimiques, les fermes d’élevage et les villes smog3,4. La composition biologique des particules peut-être contribuer à certaines maladies respiratoires et cardiovasculaires dans les humains exposés au PM5. Régions de corps différents, tels que les muqueuses, la peau, tube digestif et des voies respiratoires, peuvent être des cibles potentielles des microbes attachés au PM6,7. Un risque accru de cancer du poumon pourrait être causé par une exposition prolongée aux PM2,58.

Bactéries aéroportées ont été recensées à divers endroits dans plusieurs pays du monde, y compris dans les stations de métro, des hôpitaux vétérinaires, des abattoirs, installations, installations de traitement du lait, tanneries, mines de charbon, de compostage cliniques dentaires et des environnements intérieurs9,10,11,12,13,14,15,16,17, générant une grand nombre de rapports sur les aérosols biologiques. Les endroits bondés campus, bétail fermes et grandes villes pendant les jours brumeux sont trois conditions publiques particulièrement importantes pour lequel nous devons explorent les liens entre la santé humaine et les effets potentiels de l’exposition de la PM. En outre, pendant les journées d’hiver dans les villes du Nord de la Chine, des PM2,5 valeurs élevées peuvent affecter la santé humaine. Bien que les PM2,5 peut générer des effets toxiques en ciblant les surfaces respiratoires et se dissoudre dans le sang18, il n’est pas encore clair si et comment les microbes attachés aux PM2,5 susceptibles d’affecter la santé humaine19 ,,20. Fermes d’élevage sont l’une des principales sources de particules et d’aérosols microbiens dans les airs. Le grand nombre d’agents pathogènes, tels que les virus de la grippe et Brucella melitensis, qui sont transportés par les aérosols dans les champs autour de fermes d’élevage est des facteurs importants, provoquant des maladies respiratoires du bétail et de volaille travailleurs.

Dans cette étude, nous avons exploré plusieurs types d’analyses des bioaérosols, y compris PM numéro suivi, aux bioaérosols collecte et l’analyse de la composition biologique. Des échantillons d’air ont été prélevés par un échantillonneur aérosol cyclonique, un échantillonneur d’air grand volume avec des filtres et un échantillonneur de six étages Andersen. Ensuite, les échantillons collectés par ces trois échantillonneurs ont été analysés par des analyses biologiques y compris bactérienne ADNr 16 s et fongiques ITS séquençage pour déterminer leur composition biologique. Ici, nous montrons les résultats représentatifs des échantillons aux bioaérosols prélevés durant les jours brumeux de Beijing et de fermes d’élevage indiquant que bioaérosols pourrait avoir de grandes répercussions sur la santé humaine et animale. La comparaison entre le liquide et filtre des méthodes d’échantillonnage ont été également explorés dans cette étude, principalement basée sur les données de 16 s ADN et le séquençage de STI fongique.

Protocol

1. PM numéro suivi Utiliser une laser aéroporté particule contre (voir Table des matières) pour déterminer le nombre total de PM. Recueillir le PM par l’orifice de prélèvement d’air sur le dessus du compteur de particules laser aéroporté.Remarque : Ce compteur de particules est un matériel de bureautique et il peut travailler de façon autonome lorsque le programme y compris les temps d’échantillonnage, intervalle, temps de collection, etc. a été fixé sur son écran tactile. Munir l’instrument d’un capteur pour surveiller la température et humidité relative. Mesurer et consigner les données de température et humidité relative simultanément toutes les 5 min. Au total, mesurer et enregistrer les 6 classes de taille de particules différentes (0,3 à 0,5 μm, 0,5 à 0,7 μm, 0,7 à 2,5 μm, 2,5 à 5 μm, 5 à 10 μm et > 10 μm) chaque 5 min. mesurer simultanément 4 autres classes de taille de particules (0,3 à 0,5 μm, 0,5 à 1 μm, 1 à 3 μm et ≥ 3 μm). Recueillir les échantillons d’air si le trou d’échantillonnage sur le dessus de l’échantillonneur et utiliser les modules de test à l’intérieur de l’échantillonneur pour mesurer la taille des particules de chaque PM. Puis les données sont enregistrées automatiquement. Tous les processus ci-dessus peuvent être effectuées automatiquement après les paramètres relatifs, y compris l’échantillonnage temps et comptant la gamme, figurent cependant l’afficheur tactile mini du compteur de particules laser aéroporté.Remarque : Ce compteur de particules est un matériel de bureautique et il a des modules de test qui comptent le nombre de PM des classes de taille de particules différentes. Afin d’évaluer l’écart-type expérimental, faire en sorte que les classes de taille de particules différentes sont comptées avec au moins 15 répétitions. S’assurer que les lectures sont stockées dans la mémoire interne de l’instrument et par la suite analysés. Vérifiez que l’analyse des données primaires inclut PM concentration numérique, le test ANOVA et le pourcentage de matières particulaires dans chaque classe de taille. Par exemple, comme le montre la Figure 1 a, les concentrations de PM numéros en décembre (237,6 particules/cm3) étaient significativement plus élevées que ceux en octobre (moyenne : 110,2 particules/cm3) (analyse de la variance ; P-value < 0,05). Figure 1 b montre que le nombre de particules inférieures à 3 μm sont responsables de plus de 99 % du nombre total. Le compteur de particules laser permet de surveiller les concentrations de nombre de PM et de stocker les données automatiquement. Un disque flash USB permet d’exporter les données dans l’ordinateur et effectuer le test d’ANOVA. 2. PM Collection par aérosol cyclonique échantillonneurs Effectuer le PM d’échantillonnage dans une zone dégagée sans aucunement d’envergure à proximité des sources de pollution au ∼2 m au-dessus du sol. Enregistrer la position du site d’échantillonnage. Par exemple, le campus de l’Institut de technologie de Pékin est la suivante : 39 ° 57′ 51,0 ” N ; 116 ° 19′ 38,5 ” E. Un échantillonneur aérosol cyclonique permet de recueillir des échantillons d’air. Utiliser un flux de l’échantillonneur de 323 L/min et un temps de collection de 6 h.Remarque : Le débit de l’échantillon est fixe et non modifiable. Le temps de la collection est contrôlé par chronométrage manuel qu’il existe seulement un bouton démarre et s’arrête sur ce marquoir. Utilisez l’eau stérile pour laver l’intérieur de l’échantillonneur cyclonique aérosol 3 fois avant le prélèvement et la fonction de nettoyage automatique 3 fois en maintenant enfoncé le bouton encaisser 3 fois. Appuyez sur le bouton recueillir démarrer d’échantillonnage et appuyez sur le bouton de la pompe pour arrêter d’échantillonnage. Mettre l’échantillonneur sur une étagère ou un plancher sans que personne le maintiennent en place. Conserver tous les échantillons à-20 ° C dans l’obscurité jusqu’à ce que les analyses subséquentes. 3. PM Collection de filtres Effectuer le PM d’échantillonnage dans une zone dégagée sans aucunement d’envergure à proximité des sources de pollution au ∼2 m au-dessus du sol. Enregistrer la position du site d’échantillonnage. Par exemple, le campus de l’Institut de technologie de Pékin est la suivante : 39 ° 57′ 51,0 ” N ; 116 ° 19′ 38,5 ” E. Recueillir des échantillons de PM sur 20,32 × 25,4 cm2 filtres (voir Table des matières) à l’aide d’un échantillonneur d’air de grand volume (voir Table des matières) à un débit de 1 000 L/min. Réglez l’heure de taux et de la collection de flux en auto-programmation relative. Préserver des filtres tout échantillonnés dans l’obscurité à-20 ° C jusqu’à ce que les analyses subséquentes. 4. analyse de la Composition biologiques Pour l’analyse de la composition biologique, utilisez chaque échantillon liquide de l’échantillon de sampler ou filtre cyclonique aérosol pour l’extraction de l’ADN par une extraction d’ADN multisource Kit (voir Table des matières) selon des protocoles par le fabricant. Pour les échantillons de l’échantillonneur d’air grand volume avec filtres, utilisez 1/8 de chaque échantillon de filtre pour l’extraction de l’ADN. Placez le filtre dans un tube de 50 mL avec l’échantillon vers l’intérieur et à l’arrière faisant face à la paroi du tube. Ajouter 10 perles dans les sites centraux vers le côté du filtre contenant l’échantillon. Vortex le tube pendant 15 min à température ambiante. Pipeter le liquide dans le tube dans un tube à centrifuger propre 50 mL pour continuer le processus d’extraction de l’ADN. Extraire l’ADN de l’échantillon par les processus comme suit. Centrifuger les échantillons de bactéries à 2 000 x g pendant 5 min, retirez le surnageant et suspendre les bactéries dans 2 mL de tampon PBS stérile. Recueillir la suspension de la bactérie dans un tube à centrifuger 2 mL et puis centrifuger à 2 000 x g pendant 5 min pour du surnageant. Ajouter 350 μL de tampon PBS stérile contenant les bactéries en suspension à la solution. Ajouter 0,8 mL de RNase A. Ajouter 150 μl de tampon de CL et 8 μL de protéinase K et mélanger immédiatement par vortex secousses pendant 1 min. Après la brève centrifugation à 1 000 x g pendant 30 s (pas de résidus sur le mur), mettre le tube centrifuge en eau à 56 ° C pendant 10 min. Ajouter 350 μL de tampon EP et mélanger pendant 30 s, puis centrifuger pendant 10 min à 12 000 x g. Placer le tube de préparation d’ADN dans un tube à centrifuger 2 mL et transférer le mélange fait à l’étape 4.2.6 au tube de préparation. Puis centrifuger pendant 1 min à 12 000 x g. Jeter le filtrat, remettre le contenu du tube de préparation dans le tube à centrifuger original 2 mL et ajouter 50 μL de tampon W1. Centrifuger le mélange pendant 1 min à 12 000 x g. Jeter le filtrat, remettre le contenu du tube de préparation dans le tube à centrifuger original 2 mL et ajouter 700 μL de tampon W2. Centrifuger le mélange pendant 1 min à 12 000 x g. Répétez cette étape pour laver à nouveau avec 700 μl de tampon W2. Jeter les déchets liquides et remettre le contenu du tube de préparation dans le tube à centrifuger 2 mL original. Centrifuger le mélange pendant 1 min à 12 000 x g. Mettre le contenu du tube de préparation d’ADN dans un autre tube à centrifuger propre 1,5 mL et ajouter 100 μL d’éluant ou eau désionisée jusqu’au milieu de la membrane dans le tube de préparation (eau désionisée ou comme éluant a été chauffée à 65 ° C). Laissez le mélange reposer à température ambiante pendant 1 min et centrifuger le mélange pendant 1 min à 12 000 x g. Effectuer quantitative PCR en temps réel (Q-RT-PCR) pour quantifier les abondances relatives des bactéries et des champignons sur les filtres de prélèvement. Utiliser les amorces comme suit : pour bactérienne ADNr 16 s, 515F (5′-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3′) et 806R (5′-GGA LTC CHV GGG TWT LTC AT-3′) ; et pour les champignons ITS, ITS1 (5′-TCC GTA GGT GAA TDC GCG G-3′) et ITS1 (5′-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3′). Exécutez les tests de Q-RT-PCR sur un système de PCR en temps réel (voir Table des matières). Condition de RT-PCR : predegeneration, 95 ° C, 10 min ; dégénérescence, 95 ° C, 15 s ; recuire et extension, 60 ° C, 1 min ; 40 cycles de dégénérescence de recuire et extension. Pour l’analyse de structure de la communauté bactérienne et fongique, amplifier la région V1-V3 de bactérienne ADNr 16 s et la région ITS de l’opéron ARNr fongiques par PCR. Utilisez les amorces comme suit : pour les bactéries, V1-9F (5′-CCT ATC CCC TGT GTG TDC TGG CAG TCT CAG ACG AGT TTG CTA MTG GCT CAG-3′) et V3-541R (5′-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT GCC loi CAG-barcode-ACW TTA GCC CGG CTG CTG G-3′) ; et pour les champignons, STI-3F (5′-CCT ATC CCC TGT GTG TDC TGG CAG TCT CAG ACC ATC GAT GAA GAA CCG AGC-3′) et STI-4R (5′-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT GCC loi CAG-barcode-GCT CCT GCC CTT ATT GAT ATG C-3′). Veiller à ce que le mélange de 20 μL de RFT inclus 2 μL des dNTPs 2,5 mM, 4 μL de 5 × FastPfu tampon, 0,8 μL de chaque amorce (5 μM), 0,4 μL de FastPfu polymérase et 10 ng d’ADN (voir Table des matières). Utilisez le programme PCR comme suit : 94 ° C pendant 5 min ; suivie de 10 cycles de 94 ° C pendant 30 s, 55-60 ° C pour 45 s et 72 ° C pendant 90 s ; 20 cycles de 94 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 45 s et 72 ° C pendant 90 s ; et une extension finale à 72 ° C pendant 5 min. Exécuter pyrosequencing comme décrit dans une précédente étude 21, la quantification de l’ADN et la purification de l’ADN. 5. aux bioaérosols prélèvement d’échantillons et de la culture Utiliser un échantillonneur de six étages Andersen standard international (voir Table des matières) pour goûter les bactéries aéroportées cultivables et champignons à un débit de 28,3 L/min. utiliser un temps de prélèvement de 35 min. mettre la plaque de culture dans chaque étape de l’échantillonneur. Suffisamment désinfecter l’échantillonneur avec 75 % d’alcool éthylique après chaque prélèvement.Remarque : Le débit de l’échantillon est fixe et le temps de collecte est contrôlé par chronométrage manuel. Étapes d’échantillon les six avec l’échantillonneur de six étages Andersen, qui est définie par le diamètre aérodynamique des particules aéroportées, notamment en scène VI (0,65 – 1,1 μm), scène V (1,1 à 2,1 μm), stade IV (2.1 – 3.3 μm), étape III (3.3 – 4,7 μm), phase II (4.7 – 7,0 μm) et stade I (≥7.0 μm). Recueillir les particules bactériennes et déposer sur la plaque de culture dans chaque étape contenant du soja-caséine Digest Agar (voir Table des matières). Il y a un contenant de nombreuses bouches d’aération sur le dessus dans chaque étape de l’échantillonneur. La collection de bactéries aéroportées de la culture les plaques à 37 ° C pendant 24 à 48 heures ; Ensuite, comptez le nombre de colonies de bactéries sur le plat de l’échantillon pour chaque étape. Pour empêcher les particules recueillies par l’échantillonneur de six étages Andersen de chevauchement, corriger le nombre de colonies à chaque niveau de l’échantillonneur par la formule suivante :où Pr : corrigé nombre de colonies à chaque niveau,N : nombre de trous de l’échantillonneur à tous les niveaux (400), l’échantillonnage etr: le nombre réel des colonies. Calculer l’unité de colonies par m3 d’air comme suit :où c : concentration (UFC/m3),N1-N6: le nombre corrigé des colonies à chaque niveau,T: temps (min), l’échantillonnage etF: débit d’échantillonnage (28,3 L/min). Utiliser les méthodes de mesures 5.1 – 5,3 à étudier les bioaérosols en ferme d’élevage, y compris les quatre types de porcheries.Remarque : La ferme d’élevage se trouve à Changchun, en Chine. La position centrale de 2 m au-dessus du sol dans chaque porcherie a été choisie comme emplacement de l’échantillonnage.) Après la culture des bactéries, traiter toutes les colonies dans les plaques comme décrit dans les étapes 6.1 – 6.2. 6. l’identification des bactéries cultivables Après 48 h ou 72 h de culture, placez les bactéries dans un tube à centrifuger 2 mL. Extraire l’ADN de ces bactéries ou de champignons à l’aide d’une extraction de l’ADN multisource Kit (voir Table des matières). Le processus d’extraction de l’ADN est décrite à la section 4.2. Échantillon d’extraction ADN utilisation 200 μL de séquençage de l’ADNr 16 s . Utiliser les mêmes procédés, tel que décrit dans les étapes 4.2, 4.3 et 4.4 sur l’analyse de la composition biologique.

Representative Results

Dans cette étude, nous avons effectué une évaluation de la distribution globale de PM et une analyse exhaustive de la bioaérosols dans une ferme laitière de septembre à décembre. Plusieurs facteurs environnementaux contribuent à la répartition des particules d’aérosol. Nous avons étudié la répartition de concentration et de la taille des particules dans une maison de la vache à l’aide d’un compteur de particules laser TSI. Comme le montre la Figure 1 a, la concentration des particules d’aérosols était plus élevé en décembre et le plus bas en octobre, qui peut-être être causé par des changements de température et d’humidité (tableau 1). La concentration des particules d’aérosol inhalables (0,3 à 3,0 µm) sont responsables de plus de 99 % de la concentration de particules totales (Figure 1 b), et les particules dans cette gamme pourraient atteindre les voies respiratoires profondes, provoquant de graves dangers pour l’homme et animaux. Composition biologique analyse d’échantillons peut être effectuée par ADN extraction, bactériennes 16SrDNA et séquençage de région ITS fongique au lieu de la culture du micro-organisme. De l’analyse biologique des bioaérosols échantillons prélevés à l’aide d’un échantillonneur cyclonique aérosol ou un échantillonneur d’air grand volume avec filtres, on peut provisoirement comparer l’efficacité de ces deux méthodes dans la collecte de bactéries et champignons. La figure 2 montre les résultats de l’analyse des échantillons aux bioaérosols prélevés durant les jours brumeux de Beijing dans le campus de l’Institut de technologie de Pékin en 20 décembre 2016. Pour la collection de bactéries, les résultats indiquent que l’échantillonneur cyclonique aérosol recueilli des genres plus nombreux que l’échantillonneur d’air grand volume avec filtres (Figure 2 a). Pour la collecte de champignons, ces échantillonneurs ont montré l’efficacité égale collection et presque la même abondance de genre (Figure 2 b). D’après les résultats présentés à la Figure 2, nous avons pu mesurer l’efficacité de collection différente de ces deux méthodes pour les bactéries et les champignons. Pour la collection de bactéries, l’échantillonneur aérosol cyclonique effectué beaucoup mieux que le grand volume d’air échantillonneur avec filtres parce que les échantillons provenant de l’ancien a montré une plus grande abondance de genre (Figure 2 a). Toutefois, l’analyse de la séquence fongique des deux échantillons de différentes méthodes d’échantillonnage ont montré des structures communautaires presque identique (Figure 2 b). Nous avons étudié les bactéries cultivables aéroportés à l’aide d’un échantillonneur de six étages d’Andersen. Comme illustré à la Figure 3, le nombre de colonies de bactéries cultivables de stade I à VI de particules a été réduit. Stade I particules (particules taille > 8.2 µm) avaient le plus grand nombre de colonies de bactéries cultivables. Le pourcentage de stade I colonies dans quatre types différents de porcheries, y compris la mise-bas maison de truie maison, enceintes, engraissement et sevrage maison était de 33 %, 30 %, 26 % et 34 %, respectivement. Le pourcentage des colonies II étape dans quatre types différents de porcheries était de 20 %, 22 %, 19 % et 20 % respectivement. Le pourcentage de stade III colonies dans quatre types différents de porcheries était de 18 %, 18 %, 18 % et 19 % respectivement. Le pourcentage de stade IV colonies dans quatre types différents de porcheries était de 17 %, 16 %, 16 % et 16 % respectivement. Le pourcentage des colonies V stade dans quatre types différents de porcheries était de 10 %, 10 %, 14 % et 6 % respectivement. Scène VI les particules (particules taille < 1,0 µm) ont le plus faible nombre de colonies de bactéries cultivables. Le pourcentage des colonies VI scène dans quatre types différents de porcheries était de 3 %, 5 %, 6 % et 5 %, respectivement. Les échantillons d’air proviennent en quatre types différents de porcheries à l’aide d’un échantillonneur de six étages de Andersen et puis cultivées dans des conditions appropriées. L’ADN du génome entier des bactéries cultivables prélevés dans chaque étape de la particule a été extraite et détecté par bactérienne ADNr 16 s et séquençage de la région des ITS fongique. Un total de 91 genres et 158 espèces de bactéries ont été identifiées dans les bactéries cultivables dans les porcheries. Les structures communautaires de bactéries cultivables dans quatre types différents de porcheries, y compris la mise-bas de maison, enceinte semer maison, engraissement et sevrage maison sont présentées dans la Figure 4 avec les données de l’étape I de scène VI. Le contenu de différents genres bactériens prédominants n’est pas la même entre différentes porcheries. Figure 1 : la distribution de concentration et de la taille des particules dans quatre différents mois. (A) Boxplot PM nombre au cours de la période d’étude. Chaque boxplot comprend au Maximum, minimum, médian, deux quartiles et valeur anormale de la base de données. Cartes de distribution de taille moyenne (B) des particules. Il y avait 80 vaches dans la maison de septembre à décembre. Le pourcentage de matières particulaires (≥ 3 µm) en quatre mois (septembre, octobre, novembre et décembre) était respectivement de 0,005, 0,005, 0,002 et 0,002. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : analyses biologiques des échantillons aux bioaérosols recueillies par deux collecteurs de. (A) et (B) montrent l’abondance des genres bactériens ou fongiques dans les échantillons de bioaérosols obtenus avec les méthodes de collecte différents. Échantillonneur d’Air humidifié-mur représente l’échantillonneur aérosol cyclonique. Les filtres quartz représente l’échantillonneur d’air grand volume avec des filtres. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : moyen des cartes de répartition hiérarchique des bactéries cultivables dans quatre types de porcheries. Les quatre types de porcheries sont mise-bas maison de truie maison, enceintes, engraissement maison et maison de sevrage. S1 à S6 représentent les étapes de six particules (I à VI) collectées par l’échantillonneur de six étages d’Andersen. Les stades ont été définis par le diamètre aérodynamique des particules aéroportées, notamment le stade VI (0,65-1,1 µm), scène V (1,1 à 2,1 µm), stade IV (2.1-3.3 µm), étape III (3.3-4,7 µm), phase II (4,7-7.0 µm) et stade I (7,0 µm). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : structures de la communauté bactérienne avec différentes abondances dans les échantillons d’air. Les échantillons d’air proviennent en quatre types différents de porcheries à l’aide d’un échantillonneur de six étages de Andersen et puis cultivées dans des conditions appropriées. L’ADN du génome entier de bactéries cultivables dans chaque étape de particules collecté par l’échantillonneur de six étages Andersen a été extraite et détecté par séquençage bactérienne ADNr 16 s . Les numéros 1 à 6 dans chaque type de porcherie représentent des étapes de la particule I à VI mesurée de l’échantillonneur de six étages Andersen. Le texte sur le côté droit comprend le nom du genre pour chaque bactérie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Dans cette étude, nous avons fourni des résultats représentatifs qui ont été obtenus pendant les jours brumeux et dans les fermes d’élevage. Les résultats de bioaérosols échantillons prélevés pendant les jours brumeux de Beijing a facilité une meilleure compréhension de la composition biologique de la composition biologique des particules sans PM présent pendant les jours brumeux de Beijing. Les résultats des échantillons prélevés sur des fermes d’élevage fournira également des données de base pour le contrôle d’air ambiant dans les porcheries et un fondement théorique et le support technique d’élevage saine et sécuritaire production dans les fermes d’élevage. De nombreux facteurs environnementaux comme la température, humidité et vitesse du vent, pourraient contribuer à la distribution des particules d’aérosol dans la maison de la vache (Figure 1). Des études antérieures ont révélé que le PM dans les fermes d’élevage provient principalement de fourrages, de matières fécales, de fourrure et de plume, qui pourrait être lié aux activités animales. Les facteurs environnementaux peuvent affecter non seulement des activités animales, mais aussi l’agrégation et la diffusion des particules dans une maison de la vache relativement fermée. Par conséquent, nous détectons différentes concentrations et la distribution des tailles des particules en quatre mois différents. En outre, l’état sanitaire, alimentation méthode et activité animale étaient différentes entre les quatre types de porcheries, qui pourraient également affecter leur structure des communautés de bactéries cultivables dans l’air (Figure 4).

Toutefois, dans cette étude, nous nous sommes concentrés principalement sur les méthodes disponibles que nous pourrions utiliser pour étudier la composition et la distribution de bioaérosols dans des conditions environnementales différentes. Comparativement aux autres échantillons microbiens, celles des micro-organismes aéroportés ont de très faibles concentrations et sont mélangés avec un grand nombre d’impuretés, comme les particules de poussières inorganiques, qui présentent certaines difficultés lors de la collecte et la détection des ces microorganismes21. Par conséquent, les méthodes appropriées de collecte et de détection doivent être choisies pour aérosols microbiens. La collecte des échantillons d’aérosols microbiens est généralement réalisée à l’aide de la méthode de précipitation ou l’équipement spécialisé pour collecter les microorganismes en liquide, solide ou semi-solide d’échantillonnage moyenne22,23,24 . Ensuite, certains traitement technique correspondant et essais spécifiques et des analyses seront effectuées ultérieurement25. La moyenne d’échantillonnage devrait garder les micro-organismes intacte afin de réduire l’erreur associée à la détection et l’analyse26. Cependant, échantillonneurs de micro-organismes différents aérosols ont des effets différents sur l’intégrité des échantillons en raison de leurs principes d’échantillonnage différentes et les médias. Les gens ont conçu beaucoup de genres d’échantillonneurs aux bioaérosols qui utilisent les principes d’échantillonnage différentes, comme l’impaction inertielle, la résistance de la filtration et précipitation électrostatique27.

Un impact sur les échantillonneurs peut pousser aéroporté PM dans le milieu d’échantillonnage à grande vitesse à l’aide de matériel d’extraction. Il existe deux types de répercussions sur les échantillonneurs : solides et liquides. Solide ayant une incidence sur les échantillonneurs peuvent servir aux bioaérosols échantillon à une concentration faible et peut être presque imperméable à l’air flow28. Des particules d’aérosol de différentes tailles peuvent subir préalablement et microbes peuvent être dégustés directement dans le milieu de culture, ce qui augmente le taux de survie des micro-organismes cultivables10. En raison des répercussions inertielle, particules aérosols microbiens facilement se heurtent au même endroit, et colonies peuvent se recouper facilement après culture. À l’heure actuelle, l’échantillonneur impact massif plus courante est l’échantillonneur d’aérosols microbiens Andersen-6. Dans cette étude, nous avons utilisé un échantillonneur de six étages Andersen pour étudier les bactéries cultivables distribués dans les particules aéroportées de différentes tailles.

Échantillonneurs d’aérosol cyclonique utilisent cyclones dans l’air en spirale à grande vitesse dans un cylindre ou un cône. Aux bioaérosols particules peuvent être séparés de la circulation de l’air par force centrifuge, ce qui signifie que les microbes peuvent tomber sur la paroi interne de l’échantillonneur et ensuite être recueillis par le tampon d’échantillonnage. Cette méthode est pratique et peut être utilisée pour longtemps des périodes à fort débit d’échantillonnage et les opérations d’échantillonnage. Toutefois, cette méthode ne peut être appliquée à des températures basses car l’opération est tributaire de liquide. L’échantillonneur de cyclonique aérosol utilisée dans cette étude est un échantillonneur cyclonique humidifiée-mur aérosol peut récupérer et transférer aéroportés pathogènes et les particules de l’air échantillonné dans un petit volume d’eau pour analyse29.

Échantillonneurs de filtre peuvent travailler dans des conditions de basse température et peuvent déguster des particules supérieures à une certaine taille. Cependant, ils ont un grand impact sur l’activité microbienne et sont sujettes aux dommages, qui influencera grandement les études ultérieures sur l’activité de prélèvement. Dans cette étude, aux bioaérosols de jours brumeux de Beijing ont été échantillonnés en utilisant un échantillonneur d’air grand volume avec des filtres et un échantillonneur aérosol cyclonique. Le but de cette expérience était d’analyse la composition biologique des particules sans la séparation et la mise en culture de microorganismes aéroportés. Par conséquent, ces deux méthodes d’échantillonnage ont été adaptés pour cette étude. Pour la méthode de sampler aérosol cyclonique, microbes aéroportés à de faibles concentrations peuvent être extrait facilement dans la mémoire tampon en cours d’exécution et puis peuvent être analysés facilement sans le traitement supplémentaire qui est couramment utilisé pour les échantillons de filtre. Dans cette étude, ces deux méthodes d’échantillonnage, échantillonneur aérosol cyclonique et échantillonneur de filtre, a montré l’efficacité d’échantillonnage différent. Le traitement supplémentaire qui est couramment utilisé pour les échantillons de filtre, par exemple de récupérer l’échantillon du filtre, est l’une des principales différences entre ces deux méthodes. En outre, les échantillons d’air ont été recueillies directement dans la mémoire tampon en cours d’exécution par l’échantillonneur aérosol cyclonique tandis que l’autre méthode a prélevé des échantillons sur les filtres. Les caractéristiques des différent type de méthode d’échantillonnage pourraient contribuer à cette efficacité d’échantillonnage différent. On peut supposer que l’échantillonneur aérosol cyclonique est le meilleur choix pour la collection de micro-organismes, et cette hypothèse doit confirmation ultérieure.

Dans cette étude, bactérienne ADNr 16 s et séquençage de région ITS fongique ont été utilisés pour effectuer l’analyse biologique des bioaérosols. 16SrDNA séquençage consiste à déterminer les segments de l’ADNr 16 s dans les génomes microbiens30. L’ADNr 16 s existe largement chez les procaryotes avec conservation élevée et spécificité, ce qui le rend utile pour l’identification des espèces microbiennes31. Le séquençage du génome entier exige seulement l’extraction de l’ADN génomique et séquençage subséquent. En plus de produire une grande quantité de données, ce processus permet également une analyse plus détaillée de la structure des communautés microbiennes. En outre, métagénomique permet également dans ce champ d’étude en fournissant plus d’informations à l’avenir. Handelsman et coll. proposé tout d’abord le concept de la métagénome dans un document de 1998 sur les microbes dans le sol,32. Dans des études ultérieures, le concept de la métagénome a été progressivement accepté et beaucoup de recherche a été menée sur les microbes inclus dans l’humain gut, océan et sol33,34,35. Avec le soutien de séquençage haut débit technologie, métagénomique s’est développée rapidement et elle joue un rôle de plus en plus important dans l’étude de la détection des pathogènes. Les méthodes traditionnelles de recherche microbienne s’appuient principalement sur la culture de séparation et de purification. Cependant, beaucoup d’études ne peut être effectuée parce que plus de 99 % des microbes ne peuvent pas être cultivées. Contrairement aux méthodes traditionnelles, métagénomique peut prendre l’information génétique de tous les microbes dans l’environnement dans son ensemble sans la nécessité de séparer les organismes individuels36. Une analyse exhaustive de tous les micro-organismes qui en résultent peut être effectuée directement.

En résumé, cette étude a montré plusieurs de détection, d’échantillonnage et les méthodes d’analyse qui pourraient être utilisés pour des études sur la composition biologique des particules environnementales, y compris les heures de surveillance ; PM d’échantillonnage par un échantillonneur de six étages de Andersen, un échantillonneur d’air grand volume avec filtres ou échantillonneur aérosol cyclonique ; et les analyses biologiques, basée sur le séquençage de l’ADN. Dans la pratique, ces méthodes peuvent être utilisées dans des conditions environnementales différentes, telles que de nombreux types de fermes d’élevage. Nos protocoles et résultats peuvent aider d’autres chercheurs du monde entier d’étudier plus avant les impacts sanitaires des bioaérosols fongiques et bactériennes dans l’environnement.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Soutien financier pour cette étude provenait de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 41775148). Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit.

Materials

airborne laser particle counter TSI Inc, MN, USA model 9306
Andersen six-stage sampler Tisch Inc, USA TE-20-600
AxyPrep multisource DNA Miniprep Kit Axygen, NY, USA AP-MN-MIS-GDNA-50G
FastPfu Polymerase TransGen Inc., Beijing, China AP221-01
High-volume air sampler Beijing HuaRui HeAn Technology Co., Ltd., China HH02-LS120
Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific, USA Applied Biosystems® 7500
Soybean-Casein Digest Agar Becton, Dickinson and company, MD, USA 211043
Tissuquartz filters Pall, NY, USA 7204
Wetted-Wall Air Sampler Research International, Inc. 17161 Beaton Road SE
Monroe, Washington 98272-1034 USA		 SASS 2300
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Wang, Z., Li, J., Qian, L., Liu, L., Qian, J., Lu, B., Guo, Z. Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions. J. Vis. Exp. (143), e58795, doi:10.3791/58795 (2019).
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