JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

في تصوير الكالسيوم فيفو خلايا الشعر الخط الجانبي في الزرد اليرقات

Published: November 28, 2018
doi:
10.3791/58794
,
1Section on Sensory Cell Development and Function,NIDCD/National Institutes of Health, 2National Institutes of Health-Johns Hopkins University Graduate Partnerships Program

Summary

الزرد هو نظام نموذج العديد من الميزات القيمة بما في ذلك الوضوح البصري، التنمية الخارجية السريعة،، وأهمية خاصة في مجال السمع والتوازن، خارجياً يقع خلايا الشعر حسية. توضح هذه المقالة الزرد كيف المحورة وراثيا يمكن استخدامها للاعتداء ميتشانوسينسيشن خلايا الشعر والدالة بريسينابتيك بكاملها.

Abstract

هي خلايا حسية الشعر mechanoreceptors الموجودة في الإذن الداخلية المطلوبة للسمع والتوازن. يتم تنشيط خلايا الشعر في الاستجابة للمحفزات الحسية التي يصرف ميكانيكيا قمي نتوءات تسمى حزم الشعر. انحراف يفتح قنوات ميتشانوترانسدوكشن (MET) في حزم الشعر، مما يؤدي إلى تدفق الاتصالات، بما في ذلك الكالسيوم. هذا التدفق الموجبة ديبولاريزيس الخلية ويفتح قنوات الكالسيوم الجهد عن طريق بوابة الموقع بسالي على بريسينابسي خلايا الشعر. في الثدييات، وهي المغطى خلايا الشعر في العظام، وأنه يمثل تحديا لتقييم هذه الأنشطة المجراة في وظيفيا. وفي المقابل، اليرقات الزرد شفافة وتمتلك جهازا خارجياً يقع الخط الجانبي الذي يحتوي على خلايا الشعر. هذه الخلايا الشعر مماثلة وظيفيا وهيكليا لخلايا الثدييات الشعر ويمكن أن يكون تقييما وظيفيا المجراة. توضح هذه المقالة تقنية أن يستخدم مؤشر كالسيوم مشفرة جينياً (جيتشي)، إشارات GCaMP6s، لقياس آثار التحفيز الكالسيوم في خلايا الشعر الزرد الخط الجانبي. يمكن استخدام GCaMP6s، جنبا إلى جنب مع التصوير [كنفوكل]، لقياس إشارات الكالسيوم في المجراة في قمة وقاعدة لخلايا الشعر الخط الجانبي. وتوفر هذه الإشارات قراءات في الوقت الحقيقي، وقابلة للقياس لكل أنشطة تعتمد على ميتشانوسينسيشن وبريسينابسي الكالسيوم داخل هذه الخلايا الشعر. كما توفر هذه الإشارات الكالسيوم المعلومات الفنية الهامة فيما يتعلق بكيفية الكشف عن خلايا الشعر ويحيل المنبهات الحسية. عموما، هذا الأسلوب بإنشاء بيانات مفيدة عن التغيرات النسبية في نشاط الكالسيوم في الحية. أقل مناسبة تماما للتحديد الكمي لحجم التغييرات الكالسيوم المطلقة. هذا الأسلوب في الحية حساس للتحف الحركة. كمية معقولة من الممارسة والمهارة مطلوبة من أجل تحديد المواقع المناسبة والتثبيت، والتحفيز لليرقات. في نهاية المطاف، عند تنفيذ بشكل صحيح، ينص البروتوكول على الموضحة في هذه المقالة طريقة قوية لجمع معلومات قيمة عن النشاط خلايا الشعر في الدول الطبيعية، متكاملة تماما داخل الحيوانات حية.

Introduction

تصوير الكالسيوم الفنية هو أداة قوية يمكن استخدامها لمراقبة نشاط العديد من الخلايا في وقت واحد1. على وجه الخصوص، قد ثبت التصوير الكالسيوم باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة جينياً (جيسيس) يكون مفيداً لأنه جيسيس يمكن التعبير عنها في أنواع محددة من الخلايا ومترجمة سوبسيلولارلي2. في أبحاث علم الأعصاب، جعلت هذه الميزات تصوير الكالسيوم جيسيس باستخدام وسيلة قوية كل تعريف أنماط النشاط داخل الشبكات العصبية وقياس تدفق الكالسيوم في نهايات الفردية3،4. الاستفادة من هذه الميزات، دراسة أجريت مؤخرا استخدام [كنفوكل] مجهرية وجيسيس لمراقبة نشاط سوبسيلولار ضمن مجموعات من خلايا حسية الشعر5.

خلايا الشعر هي ميتشانوريسيبتورس التي تكشف عن المحفزات سليمة والدهليزيه في الإذن الداخلية وحركة المياه المحلية في نظام الخط الجانبي في6،فيتيبراتيس المائية7. خلايا الشعر غالباً ما تكون هدفا لضرر أو طفرات وراثية تؤدي إلى الشكل الأكثر شيوعاً لفقدان السمع في البشر المعروفة باسم فقدان السمع الحسي8،9. ولذلك، من المهم أن نفهم كيف أن هذه وظيفة الخلايا من أجل فهم كيفية علاج ومنع فقدان السمع. لتعمل بشكل صحيح، استخدام خلايا الشعر اثنان هياكل متخصصة تسمى حزم ميتشانوسينسوري الشعر وشرائط متشابك لكشف ويحيل المحفزات، على التوالي. باقات الشعر تقع على قمة خلايا الشعر، وتتكون أساسا من نتوءات الجميلة، مثل الشعر المعروف باسم ستيريوسيليا (الشكل 1أ). في خلايا الشعر الدهليزية والخط الجانبي، يحتوي كل حزمة الشعر أيضا كينوسيليوم طويلة واحدة (هدب الحقيقي الوحيد للخلية)، التي يمكن أن تمتد أعلى بكثير من ستيريوسيليا (الشكل 1أ). المحفزات ميتشانوسينسوري يصرف حزم الشعر، ويضع انحراف التوتر على الروابط التي تسمى “نصيحة-ارتباطات” التي تربط بين ستيريوسيليا10. هذا التوتر يفتح قنوات ميتشانوترانسدوكشن (MET) يقع في ستيريوسيليا، أدى إلى تدفق الاتصالات، بما في ذلك11،الكالسيوم12قمي. في نهاية المطاف هذا النشاط قمي ديبولاريزيس الخلية الشعر ويفتح قنوات الكالسيوم الجهد عن طريق بوابة (Cav1.3) في قاعدة الخلية. وتوجد قنواتv1.3 Ca المتاخمة لشرائط متشابك، بنية presynaptic الحبال حويصلات في المناطق النشطة. تدفق الكالسيوم القاعدية من خلال قنواتv1.3 Ca مطلوب للانصهار حويصلة، كبيرة، وتنشيط الخلايا العصبية الزبائ13،14.

لسنوات عديدة، استخدمت تقنيات الكهربية مثل تصحيح كامل الخلية لقط لسبر الخصائص الوظيفية لخلايا الشعر في كثير من الأنواع، بما في ذلك الزرد15،،من1617، 1819،،20. وكانت هذه التسجيلات الكهربية قيمة خاصة في مجالات السمع والتوازن لأنه يمكن استخدامها للحصول على قياسات بالغة الحساسية من الخلايا الحسية الفردية، الذي يهدف إلى ترميز المحفزات سريع للغاية على مدى الحصول على مجموعة واسعة من الترددات وكثافات21،22. ولسوء الحظ، لا يمكن قياس كامل الخلية تسجيلات نشاط سكان خلايا الشعر. دراسة نشاط سكان خلايا في السطر الأفقي الزرد، إمكانيات ميكروفونيك وإمكانات العمل الزبائ قد استخدمت لقياس ميتشانوسينسيتيفي summed واستجابة بوستسينابتيك خصائص فردية نيوروماستس23 ،24. ولسوء الحظ، لا من تسجيلات كامل الخلية لا القياسات الميدانية المحلية المحتملة لها القرار المكانية لتحديد أين النشاط هي التي تحدث داخل خلايا فردية أو قياس نشاط كل خلية داخل مجموعة من سكان. في الآونة الأخيرة، استخدمت الأصباغ الكالسيوم وجيسيس لتجاوز هذه التحديات25،26.

في الزرد، أثبتت جيسيس نهج قوية لدراسة وظيفة خلايا الشعر بسبب السهولة النسبية لخلق الزرد المعدلة وراثيا والوضوح البصري لليرقات27. يرقات الزرد، يوجد خلايا الشعر في الإذن الداخلية، فضلا عن نظام الخط الجانبي. الخط الجانبي تتكون من مجموعات روزيت مثل خلايا الشعر تسمى نيوروماستس التي تستخدم للكشف عن التغييرات المحلية في حركة المياه (الشكل 1). الخط الجانبي مفيد بشكل خاص لأنه يقع خارجياً على طول سطح السمك. مكن هذا الوصول تحفيز خلايا الشعر وقياس إشارات الكالسيوم بصريا في يرقات سليمة. وعموما، جعلت سهولة ترانسجينيسيس، الشفافية لليرقات، والوصول لا مثيل لها من خلايا الشعر الخط الجانبي الزرد نموذجا لا تقدر بثمن لدراسة نشاط الشعر الخلايا الحية. هذا هو ميزة كبيرة بالمقارنة مع نظم الثدييات فيها خلايا الشعر محاطة بالهياكل العظمية للإذن الداخلية. وهذا الافتقار إلى الوصول إلى جعلت من الصعب جداً الحصول على القياسات المجراة في الوظيفية لخلايا الثدييات الشعر.

البروتوكول الواردة هنا وصف كيفية رصد التغيرات تعتمد على القناة وبريسينابسي MET في الكالسيوم داخل خلايا فردية في الشعر وبين الخلايا داخل نيوروماستس في الزرد اليرقات. هذا البروتوكول يستخدم خط الزرد المعدلة وراثيا الراسخة التي تعرب عن GCaMP6s المترجمة بغشاء تحت سيطرة المروج محددة myosin6b خلايا الشعر28. مواقع هذا التعريب غشاء GCaMP6s للكشف عن تدفق الكالسيوم من خلال قنوات أيون يقع في غشاء البلازما التي تعتبر حاسمة بالنسبة لوظيفة خلايا الشعر. على سبيل المثال، يمكن الكشف عن المترجمة بغشاء GCaMP6s الكالسيوم التدفق من خلال MET القنوات في حزم قمي الشعر وعن طريق كاليفورنياالخامسقنوات 1.3 قرب شرائط متشابك في قاعدة الخلية. وهذا يتناقض مع استخدام جيسيس المترجمة في سيتوسول، كما كشف جيسيس سيتوسوليك الإشارات الكالسيوم التي مزيج من نشاط القناة 1.3VMET وكاليفورنيا، فضلا عن مساهمات الكالسيوم من مصادر أخرى (مثل الإصدار المخزن، ). هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية شل ويشل اليرقات GCaMP6s المعدلة وراثيا قبل التصوير. ثم توضح هذه المقالة كيفية إعداد واستخدام طائرة سائل لتحويل حزم الشعر لتحفيز خلايا الشعر الخط الجانبي بطريقة الخاضعة للرقابة واستنساخه. وترد البيانات التمثيلية التي يمكن تحقيقها باستخدام هذا البروتوكول. وترد أيضا أمثلة للبيانات التي تمثل حركة القطع الأثرية. ويرد وصف تجارب التحكم التي يتم استخدامها للتحقق من النتائج واستبعاد القطع الأثرية. أخيرا، يتم وصف طريقة لتصور إشارات الكالسيوم المكانية في البرنامج فيجي. هذا التحليل فيجي مقتبس من أساليب التصور المحددة سابقا تم تطويرها باستخدام MATLAB5. عموما، هذا البروتوكول يحدد أسلوب إعداد قوية يستخدم جيسيس في الزرد اليرقات لقياس ووضع تصور لخلايا الشعر الكالسيوم ديناميات المجراة.

Protocol

وأقر جميع الحيوانات عمل “اللجنة استخدام الحيوانات” في “معاهد الصحة الوطنية في” إطار بروتوكول دراسة الحيوان #1362-13. ملاحظة: يأخذ هذا البروتوكول حوالي 0.5 إلى 1 ح لإكمال لا انقطاعات إذا أعدت بالحلول والمعدات وإعداد مقدما. هذا البروتوكول هو الأمثل ل Tg(myo6b:GCaMP6s-caax)5،29 الزرد اليرقات في 3-7 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية). هذا السطر المعدلة وراثيا وتعرب عن GCaMP6s المترجمة بغشاء (الزرد الأمثل كودون) على وجه التحديد في جميع خلايا الشعر الزرد. قبل التصوير، وتربى اليرقات في المخزن المؤقت للجنين (E3) تحت الظروف القياسية. الرجوع إلى الجدول للمواد اللازمة لإعداد النشرة المصورة من جميع المعدات والأدوية اللازمة لتنفيذ هذا البروتوكول. 1-إعداد الحلول إعداد 1 مل من α-بونجاروتوكسين (125 ميكرومتر)، الذي يستخدم لشل اليرقات الزرد أثناء التصوير الوظيفي. إضافة 968.6 ميليلتر من الماء المعقم عالي النقاوة و 33.4 ميليلتر من الفينول الحمراء 1 ملغ من α-بونجاروتوكسين (زجاجة كاملة). جعل 100 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية.تنبيه: ارتداء القفازات والقيام باستعدادات في غطاء محرك السيارة عند التعامل مع مسحوق α-بونجاروتوكسين. كما يوصي بقفازات عند التعامل مع الحل α-بونجاروتوكسين. تحضير 1 لتر من المخزن المؤقت الجنين x 60 (E3). إضافة ز 17.2 من كلوريد الصوديوم و 0.76 ز مسحوق بوكل 954.4 مل من الماء عالي النقاوة. إضافة مل 19.8 م 1 كاكل2ومل 19.8 1 م MgSO46 مل م 1 هيبيس المخزن المؤقت إلى الحل. تخزين 60 x E3 الأسهم الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. إعداد ل 10 1 x E3 (5 ملم كلوريد الصوديوم؛ 0.17 ملم بوكل؛ 0.33 مم كاكل2؛ 0.33 مم MgSO4، الرقم الهيدروجيني 7.2)، وهو حل الذي تنتشر اليرقات في قبل تصوير الوظيفية. إضافة مل 167 من 60 x E3 حل الأسهم إلى 10 لتر الماء عالي النقاوة لجعل حل x E3 1. تخزين 1 الحل x E3 في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة تصل إلى 6 أشهر. إعداد المخزن المؤقت العصبية (ملحوظة) (140 ملم كلوريد الصوديوم؛ 2 مم بوكل؛ كاكل 2 مم2؛ مجكل 1 مم2؛ 10 ملم حبيس العازلة، 7.3 درجة الحموضة)، الذي يستخدم تزج اليرقات أثناء التصوير الوظيفي.ملاحظة: 1 x E3 يمكن أن تستخدم أيضا لتصوير الوظيفية، ولكن الردود أكثر قوة وموثوقية في NB. الجمع بين 28 مل من كلوريد الصوديوم م 5، 2 مل 1 م بوكل، 2 مل م 1 كاكل2، 1 مل 1 “مجكل م”2، و 10 مل من 1 م حبيس المخزن المؤقت مع 957 مل من الماء عالي النقاوة. تحقيق درجة الحموضة إلى 7.3 مع 1 م هيدروكسيد الصوديوم. فلتر تعقيم. تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.ملاحظة: جعل RT قبل استخدام الحل. يعد مرض التصلب العصبي المتعدد-222 الأوراق المالية (تريكايني، 0.4 في المائة)، الذي يستخدم لتخدير اليرقات. حل 400 ملغ 3-أمينوبينزواتي إيثيل ميثانيسولفوناتي الملح و 800 مغ نا2هبو4 في 100 مل ماء المقطر. قم بضبط درجة الحموضة إلى 7. مخزن في 4 درجات مئوية. استخدام 0.04% مرض التصلب العصبي المتعدد-222 تخدير اليرقات أثناء حقن التثبيت و α-بونجاروتوكسين. 2-الإعداد للتصوير الدائرة ودبابيس إعداد قاعة التصوير (الشكل 2أ). تطبيق طبقة رقيقة من الشحوم سيليكون فراغ عالية على الجزء السفلي من الدائرة نضح على طول حواف المربع التي ستلتزم ساترة. لا تترك ثغرات في الشحوم. راسخا اضغط أسفل حول حواف ساترة ختم لقاعة التصوير. يمسح الشحوم الزائدة بعيداً.ملاحظة: ينصح بحقنه 5 مل مع تلميح ميكروبيبيتي 200 ميليلتر للتطبيق الشحوم. إعداد انكابسولانت السيليكون لملء الدائرة. مزيج بنسبة 10:1 (على أساس الوزن) قاعدة لعلاج عامل. مزيج دقيق ولكن بلطف، استخدام تلميح ميكروبيبيتي لخلق فقاعات الحد الأدنى. صب انكابسولانت السيليكون على ساترة ملحقة حيث يكون مستوى سطح الدائرة. سيتم تعبئة حوالي 3 غرام انكابسولانت الدائرة. بعناية اضغط الدائرة ضد سطح مستو مع إبقائها الأفقي، أو استخدام تلميح ميكروبيبيتي (تحت ستيريوميكروسكوبي) إزالة أو سحب فقاعات إلى حافة الدائرة. ضع الدائرة في فرن مختبر بين عشية وضحاها في 60-70 درجة مئوية. ضع الدائرة داخل مربع التهوية لضمان أن لا تهب الهواء الساخن مباشرة على انكابسولانت تجنب خلق تموجات. استخدام الملقط غرامة وسلك التنغستن للأزياء ودبابيس تستخدم لشل اليرقات عن طريق رأس وذيل (الشكل 2B1) على انكابسولانت صلابة. جعل رأسه دبابيس، عقد قطعة من سلك التنغستن 0.035 ملم في يد واحدة تحت ستيريوميكروسكوبي. استخدام الملقط غرامة في ناحية أخرى، ثني السلك 1 ملم أعلى من النهاية في 90°. تبادل الملقط لغرامة مقص وقص 1 مم بعد الخضوع لإنشاء رقم التعريف الشخصي. كرر الخطوة 2.3.1 استخدام سلك 0.025 ملم دبابيس الذيل، ولكن ترك 0.5 مم أسلاك على كلا جانبي من الانحناء. استخدام الملقط لإدخال المسامير في انكابسولانت تصلب في الدائرة (للتخزين). 3-إعداد الإبر للشلل والتحفيز إعداد إبر حقن القلب باستخدام الزجاج الشعيرات الدموية مع خيوط. سحب الإبر إلى قطر الحافة داخلية من 1 – 3 ميكرومتر (الشكل 2-ج). تعد الإبر نافثة للسوائل باستخدام الزجاج الشعيرات الدموية دون خيوط. سحب الإبر مع نصيحة رقيقة، والطويلة التي لا يمكن كسرها إلى القطر تلميح الصحيح. قطع نصيحة رقيقة وطويلة من إبرة نافثة للسوائل بفرك عمودياً ضد آخر إبرة نافثة للسوائل أو السيراميك فقط أعلاه حيث يمكن بنت نصيحة إبرة لإنشاء قطر الحافة داخلية من 30 – 50 ميكرومتر [الشكل 2ج (وسط الصورة) و الشكل 3 A2]. التأكد من أن الكسر حتى عبر الحافة (الشكل 2ج، صورة الأوسط) وليست خشنة أو حتى كبير جداً (الشكل 2ج، الصورة الصحيحة) لضمان وتدفق الموائع الدقيقة أثناء تنشيط خلايا الشعر.ملاحظة: يمكن استخدام الملمع إبرة لإصلاح فواصل خشنة. 4-تعلق وشل حركة اليرقة للتصوير الدائرة يستحم يرقة Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) في حوالي 1 مل من E3 المخزن المؤقت الذي يحتوي على 0.04% مرض التصلب العصبي المتعدد-222 1 – 2 دقيقة على سطح انكابسولانت سيليكون دائرة التصوير حتى تصبح اليرقة غير متحرك أو لا تستجيب للمس. تحت ستيريوميكروسكوبي، ضع اليرقة في مركز الدائرة التروية حيث أنها تقع الشقة على جانبها ضد انكابسولانت سيليكون.ملاحظة: للاتساق، دائماً جبل اليرقات على نفس الجانب (مثل الجانب الأيمن أسفل الجانب الأيسر لأعلى) (الشكل 2B1). استخدام الملقط غرامة، تحقيق 0.035 مم رأس دبوس أسفل خط عمودي في اليرقة والدائرة. أدخل pin الرأس بين العين وحويصله أوتيك وأسفل إلى انكابسولانت (الأرقام 2B1 و 2B2). استخدم مجموعة ثانية من الملقط لاستقرار اليرقة على طول الجانب الظهرية أو البطني أثناء التثبيت. التأكد من أن الجزء الأفقي من pin اتصالات اليرقة ولا تضغط على طول الطريق إلى انكابسولانت. زاوية الدبوس بطنيا (الشكل 2B1) أو الإشارة قليلاً نحو الأمامي من الأسماك لتجنب التداخل مع حقن القلب اللاحقة وتصوير خلايا الشعر. استخدام الملقط، إدراج دبوس ذيل 0.025 ملم notochord أقرب ما يمكن إلى نهاية الذيل (الشكل 2B1).ملاحظة: كن حذراً لتجنب تمتد اليرقة. دبوس اليرقة مسطحة. يجب أن تكون عيون فرضه (الشكل 2B1). وهذا مهم جداً لسهولة حقن القلب (الشكل 2B2-B2 ‘، الخطوة 5)، تيسير طائرة تصوير المرغوب فيه (الشكل 1B1-B2 ”، الخطوتين 8 و 9)، وقياس كثافة حافز نافثة للسوائل ( الشكل 3A3، الخطوة 7). 5-حقن α-بونجاروتوكسين في تجويف القلب شل يرقة ملاحظة: ارتداء القفازات عند التعامل مع α-بونجاروتوكسين. الطرد المركزي قاسمة α-بونجاروتوكسين بإيجاز قبل استخدامها لمنع انسداد من إبرة حقن القلب. 3 الردم ميليلتر من حل α-بونجاروتوكسين إلى إبرة حقن قلب باستخدام هلام تحميل تلميح ماصة. تحميل الحل بالتساوي إلى الحافة مع لا فقاعات. أدخل إبرة حقن القلب في حامل ماصة يعلق على ميكرومانيبولاتور يدوي. تحت ستيريوميكروسكوبي، وضع الإبرة حيث يكون عمودي محاذاة المحور A-P لليرقات المثبتة وتخديره، مشيراً إلى أسفل بزاوية مقدارها ~ 30°. قم بتوصيل صاحب ماصة حاقن الضغط. تطبيق الإعدادات المقترحة التالية: بينجيكشن = 100 hPa، تينجيكشن = 0.5 s، وبكومبينسيشن = 5 hPa. حقن بولس في الحل لاختبار ما إذا كان تلميح إبرة براءات الاختراع. ابحث عن نفخة صغيرة من الحل أحمر (من الفينول الأحمر) ترك غيض الإبرة. إذا كان ينظر إلى أي لون أحمر، بلطف جداً تتخلص من طرف إبرة ضد حافة pin ثم حاول مرة أخرى حتى الإبرة براءات الاختراع. وبدلاً من ذلك، سحب إبرة مع فتح نصيحة أكبر. دفع الإبرة نحو القلب حتى أنها تمس الجلد خارج القلب (الشكل 2B2). اضغط الإبرة في اليرقة وابحث عن المسافة البادئة للخلية الصبغية في الجلد أمام القلب للتأكد من أن الإبرة توضع في الطائرة الصحيحة بالنسبة إلى اليرقة (B2الرقم 2’). دفع الإبرة كذلك حتى يثقب الجلد ويدخل تجويف القلب. سحب الإبرة إلى الوراء قليلاً. حقن بلعه من α-بونجاروتوكسين في تجويف القلب. ننظر للتضخم تجويف القلب أو صبغة حمراء دخول التجويف. شطف بلطف اليرقة 3 مرات مع 1 مل من ملاحظة: لإزالة مرض التصلب العصبي المتعدد-222 المتبقية. ابدأ بإزالة كافة السوائل. الحفاظ على اليرقة في حوالي 1 مل ملحوظة في قاعة التروية.ملاحظة: التأكد من أن ضربات القلب اليرقات وتدفق الدم تظل قوية بعد حقن التدبيس والقلب وطوال التجربة تصوير كامل. 6-إعداد المجهر وإعداد السوائل-جت تجميع مجهر [كنفوكل] تستقيم استخدام المكونات المبينة في الجدول للمواد: مجهر [كنفوكل] مع 488 نانومتر الليزر وعوامل التصفية المناسبة، والبرمجيات المجهر مراقبة وتنسيق التصوير والتحفيز، والهواء x 10 الهدف، 60 × الهدف المياه، بيزو زي موضوعي ماسح (z-المداخن)، كاميرا عالية السرعة، ومحول الدائرة الدائرية، المزودة بمحركات المرحلة، ومرحلة إدراج محول. الرجوع إلى تشانغ et al.29 لخيارات إضافية وإرشادات بشأن الأجهزة المجهر. تجميع الطائرة النفاثة السائل يتكون من 3 عناصر رئيسية: الفراغ ومضخة الضغط، والمشبك ضغط عالي السرعة، ومرحلة الرأس (كما هو موضح في الجدول للمواد). استخدام المشبك ضغط عالي السرعة للتحكم في توقيت ومدة لتصريف الضغط أو فراغ الخروج من مرحلة الرؤساء وإلى ماصة نافثة للسوائل. قم بتوصيل ناتج مرحلة الرأس حامل ماصة ضخ السائل عبر أنابيب سيليكون السميكة. 7-المواءمة بين اليرقة والسوائل-جت ملاحظة: وهناك 3 طائرات من الاهتمام داخل كل نيوروماست: (1) نصائح حزم الشعر (الشكل 3A3: كينوسيليا، تستخدم لقياس كثافة التحفيز)؛ (2) أن الطائرة يلتقي الشعر-حزمة (الشكل 1B1 B1 ‘: قاعدة الحزم الشعر قمي حيث يتم الكشف عن إشارات الكالسيوم MET-قناة-تعتمد على)؛ و (3) أن الطائرة متشابك (الرقم 1B2-B2 ‘: حيث يتم الكشف عن الإشارات presynaptic الكالسيوم في قاعدة الخلية الشعر). ويرد في الشكل 1هذه الطائرات. الردم 10 ميليلتر من ملحوظة في إبرة نافثة للسوائل مقطوعة بشكل صحيح (من الخطوة 3، 2) استخدام هلام تحميل تلميح. تحميل الحل بالتساوي إلى الحافة مع لا فقاعات. إدراج صاحب ماصة يعلق على ميكرومانيبولاتور يجهز الإبرة. ضع الدائرة التروية في محول دائرة دائرية على المسرح المجهر.ملاحظة: من أجل التناسق، دائماً ضع اليرقة في نفس اتجاه (مثلاً الدائرة التي تحتوي على اليرقة مع الخلفي اتجاه جت السوائل والبطني يتجه نحو المجرب الجانب). نقل المرحلة يجهز بحيث اليرقة في مركز مجال الرؤية. تشغيل محول الدائرة الدائرية حيث أن محور A-P اليرقة تقريبا تتماشى مع مسار الإبرة نافثة للسوائل. استخدام التباين التدخل الخفيفة والتفاضلية المنقولة (DIC)، تجلب اليرقة في التركيز وأنها مركز تحت الهدف 10 x. رفع هدف 10 x. استخدام ميكرومانيبولاتور الميكانيكية، إسقاط الإبرة نافثة للسوائل في مركز مجال الرؤية حيث أنها مضاءة بالضوء المنقولة وبالكاد لمس الحل ملحوظة. انخفاض الهدف 10 x. وتركز على اليرقة لتأكيد موقعة. تركيز أعلى للبحث عن إبرة نافثة للسوائل. حرك الإبرة نافثة للسوائل مع ميكرومانيبولاتور في س-وص-أكسيس حتى يتم في وضع مواز للجانب الظهرية للأسماك. التركيز مرة أخرى على اليرقة. إسقاط الإبرة في محور ع. ضع الإبرة على طول الجانب الظهرية للأسماك و ~ 1 ملم بعيداً عن الجسم (الشكل 3A1). عناية نقل محول غرفة دائرية (إذا لزم الأمر) لضمان اتساق الإبرة نافثة للسوائل على طول خط الوسط A-P لليرقة (A1منالشكل 3). الانتقال من مرحلة يجهز لوضع نيوروماست للفائدة في مركز مجال الرؤية. الحفاظ على طرف إبرة نافثة للسوائل على طول الجانب الظهرية للأسماك. لا تلمس غيض الإبرة نافثة للسوائل لليرقة أو سطح الدائرة. قم بالتبديل إلى 60 × الهدف المياه. التأكد من أن الهدف هو منغمسين في الحل ملحوظة. وأحال استخدام تركيز جيد لتحديد موقع باستخدام نيوروماست الضوء والبصريات DIC.ملاحظة: تم تصميم هذا الإعداد لتحفيز نيوروماستس على طول الخط الجانبي الخلفي الأولية. خلايا الشعر داخل هذه نيوروماستس الاستجابة لتدفق السوائل الموجه الأمامي أو الخلفي. انظر Chou et al.31 لخريطة دقيقة لحساسية نيوروماست السوائل داخل منظومة الخط الجانبي. ضع إبرة ضخ السائل مع ميكرومانيبولاتور حيث يكون من 100 ميكرون من الحافة الخارجية من نيوروماست (الشكل 3A2).ملاحظة: اختر نيوروماستس التي تقدم آراء واضحة من أعلى إلى أسفل (1B1 الأرقام ‘-B2’ و الرقم 3A3) بدلاً من زاوية الجانب وجهات النظر (الشكل 1C1-C2). وجهة نظر واضحة من أعلى إلى أسفل يسمح بالتصوير من كافة حزم الشعر قمي في طائرة بصري واحد متزامنة أو التصوير لمجالات متشابك في طائرات بصري أقل (الشكل 3A3). وتركز ما يصل إلى النصائح من الشعر قمي-الحزم (كينوسيليا) (الشكل 1ألفو الأرقام 3A2 3A3). ينبغي أن يكون الجزء السفلي من الإبرة نافثة للسوائل في التركيز في هذه الطائرة. تعيين المشبك ضغط عالي السرعة من الدليل إلى الوضع الخارجي لتلقي مدخلات من برامج التصوير. صفر المشبك ضغط عالي السرعة بالضغط على زر “صفر”. استخدم مقبض النقطة المحددة لتعيين الضغط يستريح قليلاً من الإيجابية (~ 2 مم زئبق). تأكيد الإخراج يستريح من المشبك ضغط عالي السرعة استخدام لكنها هذه المبادرة تعلق على إخراج المرحلة الرأس.ملاحظة: تعيين ضغط إيجابي طفيف في بقية لتجنب امتصاص السوائل تدريجيا إلى الإبرة نافثة للسوائل على مر الزمن. إذا كان السائل يدخل الأنبوب متصل بالسوائل-الطائرة النفاثة، وتصل إلى مرحلة الرأس، أنها يمكن أن تلحق الضرر المعدات. تحديد الضغوط اللازمة لحفز حزم الشعر. استخدم 0.125 و 0.25 V إسهاما (6.25 و 12.5 ملم زئبق) 200 – 500 مللي ثانية لتطبيق حافز اختبار (الشكل 3A3 A3 ”).ملاحظة: تحويل المشبك ضغط عالي جهد إدخال (من البرمجيات أو الأجهزة الأخرى بالاتصال بالمنفذ BNC على منفذ الأمر المشبك ضغط عالي السرعة) إلى الضغط الذي تبرأ من المسرح الرئيسي، وفي نهاية المطاف، الإبرة نافثة للسوائل (1.0 V = 50 مم زئبق، بينما الخامس-1، 0 =-50 مم زئبق). في هذا التكوين (راجع الخطوة 7، 2) إيجابية ينحرف الضغط (دفع) حزم الشعر نحو الأمامي، والضغط السلبي (سحب) ينحرف حزم الشعر نحو مؤخرة. استخدام الضوء المنقولة والبصريات DIC جنبا إلى جنب مع شريط مقياس, قياس مسافة انحراف من المحفزات 6.25 و 12.5 مم زئبق من نصائح حزم الشعر، كينوسيليا (الشكل 1أ و أرقام 3A3-3 ”). اختر ضغط أن يتحرك الحزم (كوحدة متماسكة 1) على مسافة حوالي 5 ميكرومتر (الشكل 3A3 ”). ضمان أن تظل النصائح من كينوسيليا في التركيز طوال الوقت. نقل ميكرومتر نافثة للسوائل ± 25 على طول محور A-P اليرقة لإيجاد المسافة والضغط الذي ينحرف النصائح من كينوسيليا 5 ميكرومتر.ملاحظة: استخدام GCaMP6s في اليرقات 3 – 7 إدارة الشرطة الاتحادية، ينبغي تحقيق القرب من تشبع GCaMP6s الكالسيوم إشارات انحراف 5 ميكرومتر وينبغي أن لا تضر هياكل حزمة الشعر قمي (الشكل 3A3 ”). يمكن استخدام أصغر التشرد المسافات لتقديم المحفزات غير تشبع (الشكل 3A3 ‘). المسافات التشرد > 10 ميكرون من الصعب تقدير ( الشكل 3A3 ” ‘) ويمكن أن يضر بمرور الوقت. إشارة التشبع يعتمد على عمر نيوروماست (وارتفاع كينوسيليال) فضلا عن المؤشرات المستخدمة. التحقق من سالكيه إبرة نافثة للسوائل في كل اتجاه (ضغط/دفع والفراغ/سحب) بشكل دوري أثناء التصوير. الإبر نافثة للسوائل تسد بسهولة وتفقد سالكيه فراغ، بل أنها تحافظ على سالكيه الضغط المتبقية. استخدام البصريات DIC وحافز اختبار قصير في كل اتجاه للتحقق من سالكيه نافثة للسوائل. تركيز العينة إلى الطائرة للفائدة (مثلاً قاعدة الحزم الشعر قمي أو القاعدة لخلية الشعر في الطائرة متشابك؛ الشكل 1 B1-B2 ‘). 8-تصوير اقتناء الخيار الإجراء 1: اقتناء طائرة واحدة ملاحظة: يتم تصوير جميع المبينة في هذا البروتوكول على الرايت تعيين برامج التصوير للحصول على عملية شراء 80-الإطار الجري أو مستمر بالتقاط كل 100 مللي بتحقيق معدل إطار من 10 هرتز. الحصول على مجموعة، الفتحة، وطاقة الليزر تحسين الكشف عن الإشارات، ولكن تجنب التشبع، وفوتوبليتشينج، والضوضاء. إعدادات مثال أوبترا/SFC كما يلي: 488 نانومتر الليزر الطاقة: 50 (حزمة الشعر MET الطائرة)، 75 (طائرة متشابك)؛ شق 35 ميكرون؛ اكتساب = 2.7؛ كسب م = 3900.ملاحظة: تطبيق 2 × binning إذا إشارات ضعيفة جداً أو صاخبة، أو قد فوتوبليتشينج المفرطة. 2 × binning إرادة تعزيز الكشف عن إشارة على حساب القرار المكانية. حدد حافزا لتسليم خلال الإطار 80 (8 ق) اقتناء بعد الإطار 30، 3 s.ملاحظة: بعض المحفزات المثال على النحو التالي: 200 مرض التصلب العصبي المتعدد (+ أو-0.25 V) يصل إلى 2 s (+ أو-0.25 V) خطوة في الاتجاه الأمامي أو الخلفي لتحديد الاتجاه حساسية كل خلية الشعر؛ 2 s، موجه مربعة 5 هرتز (0.25 V ل 200 مرض التصلب العصبي المتعدد،-0.25 الخامس ل 200 مرض التصلب العصبي المتعدد، كرر 5 مرات) لحفز الشعر كافة الخلايا في وقت واحد. سيتم تنشيط ضغط إيجابي (التحفيز الأمامي) نصف خلايا الشعر. ضغط سلبي (التحفيز اللاحق) تنشيط أخرى نصف خلايا الشعر. تأكد من أن برامج التحفيز أو جهاز تقوم بإرجاع المشبك الضغط إلى 0 الخامس بعد الانتهاء من التحفيز. قياس الاستجابات الكالسيوم ميتشانوسينسيتيفي. التركيز على القاعدة حزم الشعر قمي (الأرقام 1A و 1B1-B1 ‘) والبدء في الحصول على الصور.ملاحظة: إذا كان يتم عرض نيوروماست وضوح من الأعلى إلى أسفل (الشكل 1B1 B1 ‘)، كافة حزم الشعر قمي يمكن تصويرها في وقت واحد على متن طائرة واحدة. قياس الاستجابات presynaptic الكالسيوم. التركيز لقاعدة لخلايا الشعر (الأرقام 1A و 1B2 B2 ‘) والبدء في الحصول على الصور.ملاحظة: إذا نيوروماست يعتبر وضوح من الأعلى إلى أسفل (الشكل 1B2-B2 ‘)، يمكن الحصول على طائرات التصوير presynaptic جميع خلايا الشعر في 2 – 3 طائرات مجموعة 2 ميكرومتر وبصرف النظر. تيراغرام [myo6b:ribeye-مشري] الأسماك المحورة وراثيا يمكن استخدامها للتعرف على وتحديد موقع أشرطة presynaptic ومواقع ل دخول الكالسيوم29. 9-تصوير اقتناء الخيار الإجراء 2: اقتناء الطائرة متعددة لحن زي بيزو يعلق على هدف 60 x للشراء السريع (12-18 مللي ثانية). تأكد من تحديد إعدادات ماكس عالي السرعة. إنشاء عملية امتلاك Z-مكدس استخدام بيزو زي. اكتساب النشاط MET حزمة الشعر في 5 طائرات بحجم الخطوة 0.5 ميكرومتر. الحصول على إشارات presynaptic في 5 طائرات بحجم الخطوة 1 ميكرومتر. تعيين معدل الإطار إلى 10 هرتز. كل الإطار سيتم القبض على كل 20 مللي ثانية وكل مكدس Z كل 100 مللي. إعداد اقتناء 400 إطارات أو مداخن Z 80 في 10 هرتز 8 s الجري اقتناء. تعيين طاقة الليزر والفتحة والكسب تحسين الكشف عن الإشارات، ولكن تجنب التشبع، وفوتوبليتشينج، والضوضاء. إعدادات مثال لنظام أوبتيرا/SFC كما يلي: 488 نانومتر الليزر الطاقة: 75 (حزمة الشعر MET الطائرة)، 125 (طائرة متشابك)؛ شق 35 ميكرون؛ اكتساب = 2.7؛ كسب م = 3900.ملاحظة: تطبيق 2 × binning إذا كانت إشارات ضعيفة جداً،صاخبة، أو قد فوتوبليتشينج المفرطة. 2 × binning إرادة تعزيز الكشف عن إشارة على حساب القرار المكانية. حدد حافزا لتسليم خلال اقتناء بدءاً من الإطار 150، بعد 3 s. مواصلة البروتوكول كما هو موضح أعلاه للحصول على طائرة واحدة، ولكن مركز Z-المكدس في الطائرات قمي أو القاعدية (خطوات 8.4 و 8.5). 10-السيطرة: كتلة الدوائي الكالسيوم مقولة جميع الإشارات ملاحظة: باتا (1، 2-bis(o-aminophenoxy) الإيثان-N، N، N′، حمض N′-تيتراسيتيك) العلاج عنصر تحكم حرجة عند أولاً إنشاء هذا البروتوكول. بعد إكمال الخطوات 8 أو 9، يستبدل ملاحظة 1 مل ملاحظة تحتوي على 5 مم باتا تهزم نصيحة الروابط المطلوبة إلى بوابة قمي MET القنوات الموجودة في حزم الشعر. احتضان لمدة 10 – 20 دقيقة في الرايت يغسل باتا 3 مرات مع 1 مل NB. كرر الخطوة 8 أو 9. بعد المعالجة باتا، ينبغي أن يكون هناك أي تغيير في الأسفار GCaMP6s استجابة للتحفيز نافثة للسوائل في حزم الشعر قمي أو الطائرة متشابك. إذا استمرت التغيرات في الأسفار GCaMP6s، هذه ليست إشارات الكالسيوم الحقيقية وقد تكون التحف الحركة. 11-التحكم: كتلة الدوائي من إشارات الكالسيوم بريسينابتيك (اختياري) بعد إكمال الخطوات 8 أو 9، استبدالها ملاحظة ملحوظة: تتضمن 10 ميكرون إيسراديبيني مع 0.1% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) لمنع قنوات الكالسيوم من نوع L في بريسينابسي خلايا الشعر. احتضان لمدة 10 دقائق في الرايت دون تنفيذ يغسل، كرر الخطوة 8 أو 9. بعد العلاج، ينبغي أن تكون هناك GCaMP6s fluorescence التغييرات استجابة للتحفيز نافثة للسوائل في حزم الشعر قمي ولكن الطائرة متشابك لا. إذا كانت التغييرات في الأسفار GCaMP6s مستمرة في الطائرة متشابك، هذه ليست إشارات الكالسيوم الحقيقية وقد تكون التحف الحركة. 12-تمثيل البيانات الرسومية وتجهيز الصور ملاحظة: استخدم برنامج الرسوم البيانية (خطوات 12.2 – 12.2.3) وفيجي (خطوات 12.1 – 12.1.5) للخطوة 12. ستاكريج، توربوريج (الخطوة 12.1.3)، سلسلة الوقت محلل V3 (الخطوات 12.1.4–12.1.6)، والإضافات فيجي أيضا المطلوبة (انظر الجدول للمواد). فتح تسلسل صورة في فيجي، سلسلة زمنية واحدة-طائرة (طائرة واحدة 80-الإطار) أو سلسلة زمنية Z-المكدس (400-الإطار متعدد الطائرة). انقر على “ملف”، حدد “استيراد” من القائمة المنسدلة وانقر على “تسلسل الصور.” لسلسلة مرات Z-مكدس، Z-المشروع نقطة في كل مرة (5 طائرات كل تيميبوينت) لإنشاء تسلسل صورة 80-الإطار. انقر على “صورة”، حدد “رزمة” من القائمة المنسدلة، اختر “أدوات” من القائمة المنسدلة وانقر فوق “مجمعة Z-المشروع.” حدد “متوسط كثافة” كأسلوب الإسقاط، وإدخال “5” من أجل “حجم المجموعة”.ملاحظة: يمكن تحليل كل طائرة داخل Z-المكدس بشكل منفصل لمزيد من المعلومات المكانية. إزالة 1 الأول s (10 إطارات) من 8 s (إطارات 80) للحصول على الصور. انقر فوق “صورة”، حدد “رزمة” من القائمة المنسدلة، اختر “أدوات” من القائمة المنسدلة وانقر على “جعل سوبستاك.” أدخل “11-80” “الشرائح”.ملاحظة: هذا سوبستاك وسوف يشار إليها باسم stk1. تسجيل تسلسل الصور (stk1) باستخدام البرنامج المساعد ستاكريج32. انقر فوق “الوظائف الإضافية”، حدد “ستاكريج”، وحدد “الترجمة” كالطريقة للتسجيل للسلسلة الزمنية 70-الإطار.ملاحظة: هذا سوبستاك المسجلة وسوف يشار إليها باسم stk2. استخدام البرنامج المساعد مرات سلسلة V3 محلل لاستخراج قياسات الكثافة (و) GCaMP6. وضع منطقة للفائدة (ROI) على حزم الشعر قمي أو مواقع بريسينابتيك في stk2. الرجوع إلى الموقع إيماجيج (انظر الجدول للمواد للارتباط) للحصول على إرشادات حول كيفية استخدام الوقت سلسلة محلل V3.ملاحظة: استخدام دائري 1 – 2 ميكرومتر دوروا لحزم قمي الشعر والتعميم 3 – 5 ميكرومتر دوروا للطائرة متشابك (الأرقام 4A1 و 4A2). حدد معلمات القياس. انقر فوق “تحليل”، حدد “تعيين القياس”، وتأكد من تحديد فقط “تعني قيمة الرمادي”. في إدارة العائد على الاستثمار، حدد كافة رويس واستخدم دالة قياس متعددة لتوليد قيم الكثافة (و) لكل عائد الاستثمار في السلسلة الزمنية. ضمن إدارة العائد على الاستثمار، انقر فوق “أكثر >>”، وحدد “تدبير متعددة” من القائمة المنسدلة. قيم الأرض (F). لصق القيم (F) من نتائج “قياس متعددة” في برنامج الرسوم البيانية لإنشاء رسم س ص (4A1 الأرقام ‘و 4A2’).ملاحظة: (س) إنشاء القيم يدوياً أو استخدام الطابع الزمني من بيانات التعريف. تحديد خط الأساس (وس) لكل عائد الاستثمار بحساب متوسط القيم (F) في برنامج الرسوم البيانية من الإطارات التحفيز قبل 1 – 20. لكل عائد الاستثمار، طرح (وس) من القيم (F) في كل تيميبوينت لإنشاء قيم ΔF (F وo). ريبلوت، إذا رغبت في ذلك. حساب ومؤامرة ΔF/وس. لكل عائد الاستثمار، تقسيم القياس ΔF من (وس) وريبلوت (4A1 الأرقام ” و 4A2 ”). 13-الصور المعالجة والحرارة الخريطة تمثيل الإشارات الزمانية الكالسيوم ملاحظة: واستخدمت الأعمال السابقة إنشاء تمثيل خريطة الحرارة المكاني لإشارات الكالسيوم في الزرد الخط الجانبي الشعر خلايا مخصصة البرامج المكتوبة Matlab5،28. وقد تم تكييف هذا التحليل لبرمجيات المصدر المفتوح تحليل فيجي33. استخدام فيجي لجميع الخطوات المذكورة أدناه. الإضافات ستاكريج وفيجي توربوريج أيضا مطلوبة (انظر الجدول للمواد). نفذ الخطوات 12.1 – 12.1.3 لكل Z-مكدس أو السلاسل الزمنية طائرة واحدة لإنشاء سوبستاك المسجلة المشار إليها ك stk2. استخدام stk2 لإنشاء صورة خط أساس. انقر فوق “صورة”، حدد “رزمة” من القائمة المنسدلة، وحدد مشروع “Z”. حدد “متوسط كثافة” من أجل “إسقاط نوع”، وقم بإدخال “1” على “شريحة ابدأ” و “20” على “إيقاف شريحة”.ملاحظة: هذا Z-الإسقاط وسوف يشار إليها باسم باسيلينيمج. وقتيا بن تسلسل الصور (و) 70-الإطار (stk2) في صناديق 0.5-s 14. انقر على “صورة”، حدد “رزمة” من القائمة المنسدلة، اختر “أدوات” من القائمة المنسدلة وانقر فوق “تجميع المشروع Z”. حدد “متوسط كثافة” أسلوباً “الإسقاط” وأدخل 5 على “حجم المجموعة.”ملاحظة: هذا الإسقاط-Z المجمعة سوف يشار إلى stk2bin وو في الشكل 5. طرح قيمة خط الأساس (باسيلينيمج) بكسل من تسلسل الصورة (و) بند (stk2bin) لإنشاء تسلسل صورة ΔF. انقر على “العملية” وحدد “صورة آلة حاسبة” من القائمة المنسدلة. حدد stk2bin ك “Image1” وباسيلينيمج “Image2.” حدد “طرح” عن “عملية”.ملاحظة: هذا الأساس طرح Z الإسقاط يشار إلى stk2binBL وواو-BL = ΔF في الشكل 5. اختر جدول بحث (لوط) من اختيار لعرض تسلسل الصور ΔF (stk2binBL). انقر على “الصورة”، حدد “جداول البحث” من القائمة المنسدلة وانقر فوق طرفية للاختيار.ملاحظة: هو “أحمر حار” طرفية المستعملين المحليين المستخدمة في الشكل 5. هذا الأساس طرح Z-الإسقاط مع لوط يشار إليه لوط stk2binBL و ΔF طرفية في الشكل 5. تعيين الحد الأدنى (دقيقة) وقيم السطوع (كحد أقصى) الحد الأقصى طرفية stk2binBL. انقر فوق “صورة”، حدد “ضبط”، وانقر فوق “السطوع”. تعيين قيمة الحد الأدنى لإزالة الضوضاء الخلفية من طرفية stk2binBL. تعيين قيم الحد الأقصى الاحتفاظ بالإشارات التي تهم ولكن تجنب التشبع إشارة [مثلاً 200 إلى 1600 (تتراوح كثافة الصورة 12 بت = 0 إلى 4095)].ملاحظة: استخدام نفس قيم الحد الأدنى والحد الأقصى عند إجراء مقارنات بصرية أو تمثيلات. يمكن إنشاء شريط طرفية معايرة ΔF في فيجي لكل تسلسل الصور طرفية (مثلاً، stk2binBL-طرفية المستعملين المحليين). انقر فوق “تحليل”، حدد “أدوات”، وانقر فوق “شريط المعايرة”. أونكليك “تراكب” لتوليد صورة فردية منفصلة مع شريط المعايرة طرفية للرجوع إليها. تحويل كلا من ΔF (stk2binBL-لوط)مع الصورة لوتاند وقتيا بند (و) المطلوب (stk2bin) تسلسل إلى RGB. انقر فوق “صورة”، حدد “نوع”، وانقر فوق “لون RGB.”ملاحظة: تحويل RGB Z-الإسقاطات سوف يكون يشار إلى stk2binBL-لوط-RGB و stk2bin-RGB، على التوالي. تراكب الصور طرفية ΔF (stk2binBL-لوط-RGB) على إهمال الصور (F) (stk2bin-RGB). انقر فوق “عملية”، ومن ثم “صورة الإله الحاسبة”. تحديد stk2bin-RGB ك Image1 و stk2binBL-لوط-RGB ك Image2. حدد “شفافية صفر” ل “عملية”.ملاحظة: إذا كان هناك الكثير من الضجيج أو الخلفية في تراكب طرفية ΔF، كرر الخطوة 13.3 بوصة لزيادة قيمة دقيقة. إذا كان هناك تشبع، كرر الخطوة 13.3 وزيادة قيمة الحد الأقصى. 14-صورة التجهيز والزمانية تمثيل خريطة الحرارة باستخدام ماكرو فيجي ملاحظة: المقطع التالي يشير إلى ماكرو فيجي يسمى لوتوفيرلاي استناداً إلى الخطوة 13 التي سيقوم تلقائياً بإنشاء تمثيل خريطة الحرارة المكاني لإشارات GCaMP6s. ويتطلب هذا التحليل فيجي برمجيات تحليل المصدر المفتوح33 والإضافات ستاكريج وفيجي توربوريج (انظر الجدول للمواد). تحميل الماكرو تراكب “فيجي طرفية” (LUToverlay.ijm) المصاحبة لهذا البروتوكول (انظر ملف الترميز الإضافي). فتح سلسلة زمنية متعددة الطائرة أو سلاسل زمنية واحدة-طائرة (راجع الخطوة 12.1). انقر على “الإضافات”، حدد “وحدات الماكرو”، انقر فوق “تشغيل”، ثم حدد الماكرو لوتوفيرلاي. سوف يظهر مربع حوار مع النص، “أخبرني عن الحصول على الصور الخاصة بك”.ملاحظة: في مربع الحوار، الأرقام الحالية هي القيم المقترحة، ويمكن أن تتغير وفقا للإعداد المستخدمة من قبل المجرب. القيم المسرودة في المربع، وترد أدناه لسلسلة زمنية متعددة طائرة مع الصور 400 و 5 طائرات كل تيميبوينت (الخطوة رقم 9). بعد ” عدد الطائرات الواحدة تيميبوينت ”، أدخل عدد الطائرات في تيميبوينت (على سبيل المثال، لخطوة 12.1.1 استخدام طائرة متعددة 400 سلسلة زمنية مع 5 طائرات كل تيميبوينت، أدخل “5”). لعملية شراء طائرة واحدة (مثلاً، الخطوة 8) أدخل “1”.ملاحظة: في مربعات الحوار المتبقية، لسلسلة زمنية متعددة طائرة، “تيميبوينتس” تشير إلى عدد الصور المسقطة Z-المكدس (مثلاً، هذا الخطوة 12.1.1 تيميبوينتس 80). استخدم الخيار “تحديد النطاق إلى تحليل” لإزالة 1 أول s تسلسل الصورة (على سبيل المثال، لتحديد الخطوة 12.1.2 “11-80” لإزالة الإطارات 10 الأولى والأولى 1 s). بعد “تعريف تيميبوينتس في الأساس”، قم بإدخال العدد من الصور لاستخدامها لإنشاء الصورة الأساسية [على سبيل المثال، لخطوة 13.2.، أدخل “20” لاستخدام الصور قبل التحفيز (11-30)]. بعد “تيميبوينتس الواحد بن الزمانية” أدخل عدد الصور بن للتراكب. (على سبيل المثال، لخطوة 13.2.2. حدد “5” لإنشاء صناديق 0.5-s 14). بعد أن “كثافة دقيقة” و “كثافة ماكس” إدخال قيم الحد الأدنى والحد الأقصى سطوع إزالة الضوضاء الخلفية (الحد الأدنى)، والاحتفاظ بإشارات اهتمام مع تجنب التشبع (الحد الأقصى). بعد اختيار “جدول بحث”، حدد طرفية المستعملين المحليين المطلوب للتراكب. انقر فوق “موافق”.ملاحظة: سيتم إنهاء الماكرو تحليل الصور وفقا للإرشادات المقدمة في الخطوة 13. سيتم أيضا تسمية الصور التي تم إنشاؤها بواسطة الماكرو وفقا للإرشادات التي تظهر في الخطوة 13. إغلاق كافة الإطارات التحليل قبل معالجة تسلسل صورة جديدة.

Representative Results

وبعد myo6b:GCaMP6s-كاكس الأسماك المحورة وراثيا المعطل تداولها بشكل صحيح ويتم تسليم التحفيز ضخ السائل إلى خلايا الشعر الخط الجانبي، وإشارات قوية الكالسيوم يمكن تصور وقياسه(أرقام 4 و 5، المتخذ في 2 × binning). خلال التحفيز نافثة للسوائل، وإشارات الكالسيوم يمكن قياسها أما بحزم الشعر قمي، حيث فتح قنوات MET في الاستجابة للمحفزات، أو في القاعدة لخلايا الشعر، حيث يؤدي بريسينابتيك قنوات الكالسيومv1.3 كاليفورنيا كبيرة. مثال ممثل للردود الكالسيوم في هذه المناطق مع نيوروماست فردية وترد في الشكل 4A1-A2 ”. في هذا المثال، تم تسليم حافزا نافثة لسوائل 5 هرتز 2-s لتنشيط جميع خلايا الشعر داخل نيوروماست الممثل. خلال التحفيز، ويمكن الكشف عن إشارات قوية الكالسيوم في حزم الشعر (الشكل 4A1-A1 ”، وترد ردود 8 الشعر حزم). في هذا النظام، تعرض ما يقرب من جميع الخلايا الشعر ناضجة هذا التدفق قمي من الكالسيوم5. وفي المقابل، داخل نيوروماست نفسه، هناك إشارات الكالسيوم يمكن اكتشافها في الطائرة القاعدية، ومتشابك في فقط مجموعة فرعية (~ 30 ٪) من خلايا الشعر (الرقم 4A2 A2 ”، تظهر الخلايا 4 مع الردود presynaptic)5. 4 الأخضر رويس إظهار الخلايا مع لا إشارات هامة presynaptic الكالسيوم (الشكل 4A2 A2 ”) على الرغم من إشارات قوية الكالسيوم قمي (الرقم 4A1-A1 ”). في هذا المثال الممثل (الشكل 4A1-A2 ”) الملون رويس تصل حزم الشعر في الطائرة MET قمي (الشكل 4A1) المباراة بأجسادهم الخلية في الطائرة متشابك القاعدية (الشكل 4A2). ويبرز هذا المثال يمكن أن تقاس كيف كلا إشارات الكالسيوم تعتمد على و presynaptic MET داخل خلايا فردية في الشعر، وبين السكان من خلايا الشعر. يمكن رسم إشارات الكالسيوم في حزم الشعر على حد سواء وفي بريسينابسي بيانيا كالخام GCaMP6s (و) شدة أو كثافةس GCaMP6s ΔF/و (راجع الخطوة 12، 4A1 الأرقام ‘-A1 ” و 4A2’-A2 ”). الرسوم البيانية GaMP6s (و) تسليط الضوء على أنه يمكن أن تختلف شدة الأسفار خط الأساس لكل خلية (4A1 الأرقام ‘ و 4A2’). في الرسومات البيانيةيا GCaMP6s ΔF/واو، هو تطبيع كل خلية إلى أن قيمة خط الأساس ورسم تغير الكثافة النسبية من خط الأساس (4A1 الأرقام ” و 4A2 ”). في كل (F) وقطع ΔF/وس GCaMP6s، وإشارات الكالسيوم في كل حزمة الشعر قمي وطائرة presynaptic القاعدية الشروع مع بداية الحافز (مربع رمادي) والانخفاض أضعافاً مضاعفة بعد انتهاء التحفيز. خلال التحفيز، ارتفاع سرعة إشارات الكالسيوم في حزم الشعر وتشبع إذا لم يغير قوة الانحراف (الشكل 4A1-A1 ”). وفي المقابل، ضمن مجموعة فرعية خلايا الشعر مع إشارات الكالسيوم يمكن اكتشافها في الطائرة متشابك، إشارات الكالسيوم زيادة أكثر تدريجيا وأقل تعرضا للتشبع (الشكل 4A2 A2 ”). في خلايا الشعر دون إشارات الكالسيوم presynaptic (رويس الخضراء)، تظل إشارات الكالسيوم قرب خط الأساس. وبالإضافة إلى هذه تمثيلات رسومية (الشكل 4)، إشارات الكالسيوم يمكن تصور مكانياً في نيوروماست كامل أثناء وقت التسجيل. يظهر مثال لتمثيل الزمانية المكانية في الشكل 5 لإشارات GCaMP6s بريسينابتيك في الطائرة القاعدية من نيوروماست. ويرد في الشكل 5، الخطوات الرئيسية لعملية تسلسل صورة للتصور المكاني كما هو موضح في الخطوة 13. أولاً، يتم إهمال الصور GCaMP6s (و) الخام وقتيا [الرقم 5: الصف 1 (يتم عرض 5 صناديق 14)؛ الخطوة 13.2.1]. ثم، يتم طرح الصورة الأساس، محسوبة من التحفيز قبل الإطارات (الخطوة 13.2)، من إشارات الأسفار GCaMP6s (F) للحصول على صور ΔF (الشكل 5: صف 2؛ والخطوة 13.2.2). بعد ذلك، يتم تحويل الصور الرمادية ΔF إلى لون طرفية المستعملين المحليين (الشكل 5: الصف 3، “الأحمر الساخن طرفية المستعملين المحليين”؛ والخطوة 13.3 بوصة). أخيرا، يتم مضافين الصور ΔF مع التحويل طرفية المستعملين المحليين على الصور (و) بند وقتيا (الشكل 5، الصف الأول) للكشف عن الإشارات الزمانية المكانية داخل نيوروماست خلال التحفيز (الشكل 5: صف 4؛ والخطوة 13.4). خرائط الحرارة من إشارات GCaMP6s ΔF توفير كل المعلومات القيمة المكانية والزمانية التي ليس من السهل تحليل الخروج من رويس واحدة والرسوم البيانية المستخدمة في الشكل 4. خرائط الحرارة يمكن أن تساعد في تصور المعلومات الزمانية المكانية الهامة، بما في ذلك المعلومات سوبسيلولار فيما يتعلق ببداية ومدة إشارات الكالسيوم داخل كل خلية الشعر، فضلا عن توقيت وشدة الخلافات بين خلايا الشعر داخل كامل نيوروماست. من المهم التأكد من أن الرسوم البيانية وخرائط الحرارة المكانية تمثل إشارات الكالسيوم الحقيقية وليست القطع الأثرية بسبب الحركة. في هذا البروتوكول، يمكن التحف الحركة نتيجة الانجراف المفرط أو حركة اليرقة أو الحركة بسبب التحفيز نافثة للسوائل. كل من هذه القطع الأثرية تشكل تحديا للقضاء نهائياً على هذا التحضير المجراة. بينما يمكن تصحيح تسجيل تسلسل الصور (الخطوة 12.1.3) يجب تحديد أغلبية الحركة في x وياكسيس، تسلسل الصور مع الحركة المفرطة في محور ع وإزالتها من التحليلات. التحف الحركة أسهل لتحديد عن طريق الرسوم البيانية إشارات الكالسيوم. ويمكن ملاحظة أمثلة على تغيرات كثافة GCaMP6s أن القطع الأثرية وليست حقيقية GCaMP6s إشارات على القمة (الرقم 4B1 ‘-B1 ”) وقاعدة (الشكل 4C1’-C1 ”) خلايا الشعر. في حزم الشعر قمي، التحف الحركة شائعة عند التحفيز السائل-جت قوية جداً (الشكل 3A3 ” ‘). خلال هذه المحفزات القوية مفرطة، يمكن الانتقال من التركيز خلال التحفيز السائل-جت الطائرة حزمة الشعر قمي ثم العودة إلى المستوى البؤري الأصلي بعد إنهاء الحافز (الشكل 4B1 ‘-ب ”). وهذا يجعل من الصعب على دقة قياس إشارات الكالسيوم تعتمد على MET قمي. يمكن رؤية مثال على التحف الحركة حزمة الشعر في الشكل 4B1 ‘-B1 ”. هنا، تظهر الرسوم البيانية انخفاضا في إشارات GCaMP6s خلال التحفيز (مربع رمادي) عندما يتم حزم الشعر خارج نطاق التركيز. بعد انتهاء التحفيز، زيادة الإشارات GCaMP6s سرعة حزم الشعر العودة إلى موضعها الأصلي، والعودة إلى التركيز. وهذا يتناقض مع المثال في الشكل 4A1 ‘-A1 ” فيها إشارات الكالسيوم قمي زيادة في مستهل الحافز وانخفاض عندما ينتهي التحفيز. في حين يمكن نقل الحركة بسبب الإفراط نافثة للسوائل المنبهات أيضا الطائرة متشابك من التركيز، هذا النوع من القطع الأثرية الحركة أقل شيوعاً في هذه الطائرة. بدلاً من ذلك، التغييرات في التركيز في محور ع سبب الحركة أو الانجراف من اليرقة هي الأسباب الأكثر شيوعاً للتحف الحركة. يمكن أن تؤثر على اليرقات المتحركة أو العائمة قياسات GCaMP6s في كل من قمة وقاعدة لخلايا الشعر. يتم عرض مثال للحركة اليرقات التي يزيد GCaMP6s في الطائرة القاعدية، ومتشابك من خلال التحفيز في الشكل 4ج ‘-ج ”. الحركة التحف (الشكل 4C1 ‘-C1 ”) يمكن تمييزها عن إشارات presynaptic الحقيقية (الشكل 4A2’-A2 ”) بدراسة مسار الوقت إشارات GCaMP6s. بدلاً من زيادة وتقليل أضعافاً مضاعفة بالحافز (الشكل 4A2 ‘-A2 ”)، الزيادات الناجمة عن الحركة في إشارة GCaMP6s يكون مربع الشكل وصعود وهبوط فجأة مع ظهور وإزاحة من الحافز، على التوالي ( الشكل 4 C1 ‘-C1 ”). بالإضافة إلى دراسة متأنية لمسار الوقت إشارات GCaMP6s، يمكن استخدام تجارب التحكم باستخدام الأدوية التفريق بين الحقيقي GCaMP6s إشارات من التحف الحركة. على سبيل المثال، يمكن تطبيقها باتا (خطوة 10) تهزم تلميح-الروابط المطلوبة لوظيفة MET-القناة في حزم الشعر. وينبغي القضاء على باتا السائل-جت-أثارت تدفق الكالسيوم MET-قناة-تعتمد على قمي فضلا عن تدفق الكالسيوم القاعدية، presynaptic اللاحقة من خلال قنواتv1.3 Ca. في المثال الممثل إشارات الكالسيوم أثارت الحافز الحقيقي (الشكل 4A1-A2 ”) خلال التحفيز نافثة للسوائل، وسيلغي كافة التغييرات في الأسفار GCaMP6s في كلتا الطائرتين قمي والقاعدية بعد العلاج باتا. وفي المقابل، والتغيرات في الأسفار GCaMP6s بسبب الحركة مثل تلك المبينة في 4B1 الأرقام ‘-B1 ” و 4 ج 1’-C1 ” لن يتم القضاء بمعاملة بابتا. بالإضافة إلى استخدام باتا لإزالة جميع آثار التحفيز GCaMP6s إشارات، يمكن تطبيق إيسراديبيني (الخطوة 11) على وجه التحديد عرقلة تدفق الكالسيوم تعتمد على 1.3vCa في الطائرة متشابك القاعدية بينما تترك قمي MET-قناة-تعتمد على الكالسيوم تدفق سليمة5. بعد تطبيق إيسراديبيني، في نيوروماست فردية مع لا التحف الحركة، والتغيرات في الأسفار GCaMP6s في حزم الشعر قمي (الشكل 4A1 ‘-A1 ”) خلال التحفيز ضخ السائل سيكون دون تغيير، بينما جميع GCaMP6s متشابك سيلغي fluorescence التغييرات في القاعدة (الشكل 4A2 ‘-A2 ”). أي تغيير في إشارة GCaMP6s في الطائرة متشابك بعد تطبيق إيسراديبيني (مثل،الشكل 4C1-C1 ”) سيكون على الأرجح تناظر التحف الحركة. الشكل 1 : نظرة عامة نيوروماست الخط الجانبي وطائرات التصوير الوظيفي. (أ) الرسم التخطيطي إلى اليسار يصور جانب وجهة نيوروماست مع أربع خلايا الشعر الهيئات (أسود) الاتصال بالخلايا العصبية الزبائ بوستسينابتيك (أزرق). شرائط (الأخضر) حبل حويصلات في مواقع نشطة presynaptic داخل كل خلية. قمي لكل جسم الخلية مجموعة من ستيريوسيليا (1 ميكرومتر) التي تحتوي على قنوات MET. وقد كل حزمة الشعر كينوسيليوم واحد بنقل القوة الميكانيكية لحركة المياه إلى قاعدة لحزمة الشعر. ويصور الرسم التخطيطي في الحق نفس النموذج في طريقة عرض من أعلى إلى أسفل. في هذا العرض من أعلى إلى أسفل، أسود يستخدم للإشارة إلى الخلايا الأربع المبينة في الرسم التخطيطي على اليسار، والرمادي يستخدم للإشارة إلى الخلايا الأخرى الموجودة في نيوروماست. ضمن هذا النموذج وهذه الآراء 2، تبرز ثلاث طائرات هامة: (1) نصائح حزم الشعر (كينوسيليا) يستخدم لتحديد حجم حزمة الشعر انحراف، (2) أن الطائرة MET قمي في قاعدة الحزم الشعر حيث يدخل الكالسيوم في الخلية أثناء التنشيط، و (3) أن الطائرة متشابك في قاعدة الخلية حيث يدخل الكالسيوم قرب شرائط متشابك. (B1-B1 ‘) صور من أعلى إلى أسفل DIC و GCaMP6s للطائرة يلتقي في قاعدة الحزم الشعر، حيث يمكن تسجيل إشارات تعتمد على ميتشانوسينسيشن الكالسيوم. (B2-B2 ‘) صور من أعلى إلى أسفل DIC و GCaMP6s من نيوروماست نفسه ك B1 B1 ‘، ولكن في قاعدة نيوروماست في الطائرة متشابك، حيث يمكن الكشف عنها بإشارات الكالسيوم presynaptic. (C1-C2) صور نيوروماست الإعراب عن GCaMP6s حيث شنت اليرقات غير صحيح. في هذا المثال، متوضعة قمي MET (C1) وطائرة متشابك (C2) في قاعدة الخلية بزاوية دون الحد الأمثل. هذا الموقف لا يسمح لجميع حزم الشعر تصويرها في طائرة واحدة، وهناك حاجة إلى العديد من طائرات التصوير أكثر لالتقاط النشاط في جميع نقاط الاشتباك العصبي داخل هذا نيوروماست B1-B2 بالمقارنة مع ‘. الصور من اليرقات في 5 إدارة الشرطة الاتحادية. شريط مقياس في الخلية C2 يناظر كل الصور في B1 C2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 2 : التصوير الدائرة الزرد المتصاعدة وقلب إجراءات الحقن والإبر. (أ) المعروضة دائرة لتصوير مع يرقة (المبين بمستطيل متقطع) الموجود في المركز فوق انكابسولانت سيليكون. (B1) سيظهر هو يرقة إدارة الشرطة الاتحادية 5 معطلة بدبابيس اثنين. دبوس رئيس كبير يوضع خط عمودي على الجسم الخلفي فقط للعين. يتم فرضه عيون اثنين تماما ذلك تماما هو حجب أسفل العين بالعين العلوية. دبوس ذيل صغيرة يتقاطع notochord في الذيل. اليرقة مسطحة وغير الملتوية. (B2) شل اليرقة، إبرة حقن قلب عمودي موجها إلى الهيئة وجلبت المتاخمة للقلب. يجب الاتصال بإبرة حقن قلب الخلية الصبغية أمام القلب. (B2 ‘) اكتئاب الإبرة في الجلد يسبب المسافة البادئة للخلية الصبغية أمام القلب. (ج) إبر بالترتيب من اليسار إلى اليمين: مثال إبرة حقن القلب مع فتح من حوالي 3 ميكرومتر؛ مثال إبرة نافثة للسوائل جيدة مع فتح من حوالي 50 ميكرومتر؛ مثال إبرة السائل-جت كسر سيئة كبيرة وخشنة وسوف تنتج المحتمل المحفزات المفرطة وغير النظامية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 3 : محاذاة نافثة للسوائل وتحديد المواقع ومعايرة التحفيز. (A1) سيظهر يرقة المنحى مع مواجهة الرأس إلى اليسار وذيل بالحق، وابرة السائل-جت الموجهة نحو مواز لمحور A-P الجسم الزرد. يتم محاذاة هذا إبرة نافثة للسوائل لتحفيز نيوروماستس التي تستجيب للأمامي (ودفع الضغط) والخلفي (سحب/الفراغ) توجيه تدفق السائل. (A2) يظهر هو نيوروماست (المبينة بالخط الأبيض المتقطع) ونصائح للشعر قمي حزم (كينوسيليا) على الجانب الأيسر الفريق وابرة نافثة للسوائل على الجانب الأيمن من لوحة. هو السائل-الطائرة النفاثة ميكرومتر تقريبا 100 متوضعة من الحافة نيوروماست. (A3 A3 ” ‘) النصائح من الشعر قمي حزم (كينوسيليا) تحريف مسافات مختلفة باختلاف الضغوط التحفيز نافثة للسوائل. يتم إظهار مسار تلميح واحد كينوسيليال 1.5 ميكرومتر (A3 ‘) و 5 ميكرومتر (A3 ”) انحراف المسافات. دائرة سوداء تشير إلى موقف يستريح كينوسيليوم. من المهم أن كينوسيليا هي لا نحيد بعيداً جداً، وخلاف ذلك كثافة حافز لا يمكن تحديده كمياً موثوق بها ويمكن أن تصبح ضارة (A3 ” ‘). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 4 : “اجتمع قمي” والقاعدية إشارات GCaMP6s بريسينابتيك خلال التحفيز نافثة للسوائل في خلايا الشعر الخط الجانبي. (A1-A2 ”) GCaMP6s تغيرات كثافة خلال التحفيز نافثة للسوائل داخل نيوروماست ممثل. وتظهر الصور على اليسار قمي MET الطائرة (A1) والطائرة متشابك القاعدية (A2) داخل نيوروماست نفس. واستخدمت لون رويس مشفرة في A1 و A2 لرسم مسار الوقت (و) ΔF/و GCaMP6s كثافة الرسوم البيانية للحق في كل صورة والفترة بين إنجاب طفل وآخر. (B1-B1 ”) مثال لتسلسل صورة MET قمي بالحركة الزائدة خلال التحفيز نافثة للسوائل. وتوضح الصورة على اليسار (B1) رويس تستخدم للأرض (F) و ΔF/و GCaMP6s كثافة الرسوم البيانية بالحق. (C1-C1 ”) مثال لتسلسل صورة في الطائرة متشابك القاعدية أن يظهر حركة القطع الأثرية و GCaMP6s إشارة التغييرات التي هي غير صحيح الكالسيوم الإشارات. وتوضح الصورة على اليسار (C1) رويس تستخدم للأرض (F) و ΔF/و GCaMP6s كثافة الرسوم البيانية بالحق. مربع رمادي في كل رسم بياني يمثل مدة التحفيز نافثة للسوائل خلال كل تسلسل الصور. استخدمت حافزا نافثة لسوائل 5 هرتز 2-s على سبيل المثال في A1-A2 ” و B1 B1 ”. في C1-C1 ”، استخدمت حافز خطوة أمامي s 2. ويصور المحور Y للرسوم البيانية GCaMP6s (و) وحدات التعسفي (A.U.) التي تم الحصول عليها من قياس كثافة الصورة فيجي. ومن أمثلة كل من اليرقات في 4-5 إدارة الشرطة الاتحادية. شريط المقياس = 5 ميكرون لكل الصور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 5 : التصور الزمانية المكانية presynaptic GCaMP6s الإشارات خلال التحفيز السائل-جت- وتوجز الخطوات لتصور التغييرات الزمانية المكانية في كثافة GCaMP6s داخل نيوروماست خلال التحفيز. يتم تمثيل الوقت من اليسار إلى اليمين وفقا للطابع الزمني في الجزء العلوي من الصور. يظهر الصف العلوي 5 صناديق الزمانية 14 من تسلسل صورة GCaMP6s (و) 70-إطار (الخطوة 13.2.1). في الصف الثاني، خط الأساس (الخطوة 13.2) قد أزيلت من كل صورة GCaMP6s (و) بند لإنشاء صور ΔF (الخطوة 13.2.2). في الصف الثالث، فقد حولت الصور ΔF من درجات الرمادي (الصف الثاني) إلى “الأحمر الساخن طرفية المستعملين المحليين” (الخطوة 13.3 بوصة). يتم تعيين min و max هذه الصور طرفية المستعملين المحليين وفقا لخريطة الحرارة “الحمراء الساخنة طرفية المستعملين المحليين” من الكثافة النسبية ΔF (A.U.) على الحق (الخطوة 13.3.1). في الصف السفلي، وقد تم الصف الثالث مضافين على الصور (F) في الصف العلوي (الخطوة 13.4). شريط رمادي في الجزء العلوي من هذا الرقم يشير إلى توقيت حافز نافثة للسوائل 5 هرتز 2-s. المثال من يرقات إدارة الشرطة الاتحادية 5. ويرد أسطورة خريطة الحرارة “الحمراء الساخنة طرفية المستعملين المحليين” من الكثافة النسبية ΔF (A.U.) إلى اليمين. شريط المقياس = 5 ميكرون لكل الصور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

في فيفو التصوير في الحيوانات سليمة أصلاً صعبة. العديد من الخطوات في هذا الأسلوب حاسمة للحصول على موثوقية في فيفو القياسات الكالسيوم من خلايا الشعر الخط الجانبي. على سبيل المثال، من المهم جداً أن اليرقة معلقة وشلت بشكل صحيح قبل التصوير لتقليل حركة أثناء التصوير. الحركة الزائدة أثناء التصوير يمكن أن يؤدي إلى تغييرات في الأسفار GCaMP6s ليست إشارات حقيقية ولا تتوافق مع التغييرات في مستويات الكالسيوم (مثلاً، 4B1 الأرقام ‘-B1 ” و 4 ج 1′-C1 ”). يمكن وضع دبابيس الذيل أكثر من الأسفل للمساعدة في تقليل الحركة، على الرغم من أن هذا قد يجعل نيوروماستس الخلفي أكثر غير قابل للوصول. وعلاوة على ذلك، بعد حقن القلب، يمكن تدويرها دبابيس الرأس حيث أن الجزء الأفقي من pin يكمن عبر صفار البيض. بالإضافة إلى تغيير موقف دبابيس، من الممكن أيضا استخدام قيثارة شريحة الدماغ بدلاً من دبابيس لشل اليرقات34. عند وضعها فوق اليرقات بشكل صحيح، قيثارة إضافية، يحتمل أن تكون أقل أسلوب الغازية لشل حركة اليرقات. بينما يمكن أن تؤدي حركة كبيرة من التثبيت غير كافية، يمكن أن يؤدي إلى الشلل غير مكتملة، الحركة، عدم القيام بشكل صحيح بحقن القلب تسليم α-بونجاروتوكسين ويشل اليرقات والحركة في نهاية المطاف التحف. على الرغم من أن المسكنات الشائعة الاستخدام قد ثبت أن تؤثر على استثارة خلايا الشعر الزرد، قد أظهرت الأعمال الأخيرة أن البنزوكائين مخدر لا تتداخل مع كثير من جوانب نشاط خلايا الشعر. وبالمثل، استخداماً الأكثر مخدر MS-222 إلا يتداخل مع جوانب معينة من نشاط خلايا الشعر15. ولذلك، نظراً للطبيعة الصعبة لحقن α-بونجاروتوكسين، البنزوكائين أو مرض التصلب العصبي المتعدد-222 التطبيق يمكن أن تكون طريقة بديلة مفيدة للشلل لمنع الحركة في اليرقة أثناء تصوير الكالسيوم الوظيفية.

وبالإضافة إلى التحديات التقنية التي ينطوي عليها هذا البروتوكول، عينة محملة تماما حتى عديمة الفائدة إذا لم صحية قبل وأثناء كل تجربة التصوير اليرقة وخلايا الشعر. للتأكد من أن خلايا الشعر واليرقات يتمتعون بصحة جيدة، من المهم الإبقاء على اليرقات في المخزن المؤقت E3 خالية من الحطام مثل تشوريونس (قشرة البيض)، والنفايات، والكائنات الحية الدقيقة. على الرغم من أن موقع سطحية لخلايا الشعر الخط الجانبي مفيد للتصوير، هذا الموقع يجعلها أكثر عرضه للأضرار الخلوية عند المخزن المؤقت E3 عرقلة. بيئة نظيفة ومائي مهم بشكل خاص للشباب اليرقات (2-4 إدارة الشرطة الاتحادية) أو طفرات لا يمكن الاحتفاظ حوض تستقيم الموقف وتكمن أساسا في الجزء السفلي من صحن بيتري. وفي هذه الحالات، خلايا الشعر الخط الجانبي وكبولا الواقية المحيطة بحزم الشعر يمكن بسهولة تصبح الشبهة. حتى عند بدء تشغيل مع يرقات سليمة وخلايا الشعر، طوال كل تجربة، أنها حاسمة لضمان أن اليرقة ضربات القلب وتدفق الدم السريع. إذا كان يؤدي إلى إبطاء تدفق الدم أو توقف، يمكن أن تصبح الشبهة صحة خلايا الشعر. الاستعدادات الشبهة التي تنطوي على اليرقات غير صحية أو فقدان تدفق الدم، موت خلايا الشعر يمكن تحديد عدة طرق: الأولى، بظهور كاريوبيكنوسيس أو التكثيف النووية، الذي يظهر كفقاعة داخل الخلية تحت DIC البصريات؛ وثانيا، بانكماش الخلية ووجود سرعة نقل الجزيئات داخل السيتوبلازم؛ وثالثاً، عندما تباعد نصائح كينوسيليا في اتجاهات مختلفة35. عندما تتعطل حزم الشعر، لا تنتقل كينوسيليا مفلطح متماسك معا خلال التحفيز.

هذا الإعداد قد العديد من القيود البسيطة، أحدها أن الإعداد فقط لا تزال قوية لمدة 1-3 ساعات بعد إنشائه. التعديلات مثل استخدام دبابيس صغيرة أو شريحة الدماغ الإصرار على شل اليرقات وإضافة نظام التروية يجوز تمديد مدة بقاء هذا الإعداد في فيفو . قيد آخر هو أن فوتوبليتشينج ويمكن أن تحدث لالضيائيه بعد تكرار تصوير المحاكمات. طريقة مثيرة للتغلب على هذا التحدي تكييف هذا البروتوكول للضوء–ورقة الفحص المجهري. الضوء-ورقة الفحص المجهري وسيلة قوية للحد من تركيز الضوء، مما يؤدي إلى أقل فوتوبليتشينج ولالضيائيه36. معا، قد يساعد التثبيت الطف وتعرض صور أقل إطالة كل دورة التصوير. دورات التصوير لم يعد يمكن استخدامها لفحص كامل مدة التغييرات الفنية المصاحبة للتنمية والعمليات الأساسية لإزالة الشعر-الخلية وتجديدها بعد الإصابة. من المهم أن نشير إلى أنه، بالإضافة إلى الفحص المجهري ورقة الضوء، هذا البروتوكول يمكن تكييفها مع سائر أنواع نظم [كنفوكل] (القرص مسح نقطة، 2-فوتون، والغزل) فضلا عن أنظمة بسيطة نسبيا ويديفيلد28،34 . وعموما، براعة يجعل هذا البروتوكول أداة قيمة التي يمكن تكييفها واستخدامها مع أنظمة التصوير متعددة.

وفي حين يمكن تكييفها واستخدامها مع العديد من أنظمة التصوير هذا البروتوكول، يمكن تكييفها أجزاء من هذا البروتوكول واستخدامها (1) مع مؤشرات أخرى إلى جانب GCaMP6s و (2) إلى صورة النشاط في الخلايا الحسية والخلايا العصبية داخل الزرد اليرقات الأخرى. على سبيل المثال، في دراسة سابقة، استخدمنا هذا البروتوكول إلى نشاط الصورة باستخدام عدة مؤشرات المرمزة وراثيا داخل خلايا الشعر الخط الجانبي لكشف حويصلة الانصهار (سيفي) والغشاء الجهد (بونجووري)، سيتوسوليك الكالسيوم (RGECO1) والغشاء الكالسيوم (كا jRCaMP1a و GCaMP6s-كا)، وفي إطار عمليات الزبائ الخط الجانبي للكشف عن غشاء الكالسيوم (GCaMP6s-كا)5. استناداً إلى خبرتنا في استخدام هذه المؤشرات، السطر المعدلة وراثيا Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) الموصوفة في هذا البروتوكول يوفر بداية ممتازة للتصوير النشاط في نيوروماستس الخط الجانبي. جميع المؤشرات المذكورة أعلاه، وقد وجدنا أن GCaMP6s هو الأكثر حساسية وفوتوستابل. وبالإضافة إلى هذه الميزات، نسلط الضوء على خط Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) المعدلة وراثيا لأنه يمكن استخدامه لإجراء قياسات منفصلة اثنين: ميتشانوسينسيشن خلايا الشعر والكالسيوم presynaptic ضمن سطر واحد محوره وراثيا.

تقنية الموضحة في هذه المقالة يوضح كيف يمكن تصوير الكالسيوم في الخط الجانبي الزرد وسيلة قوية لدراسة الكيفية التي تعمل بها خلايا الشعر في بيئتها الأصلية. وهذا النهج مكمل لدراسات ثدييات في الشعر-الخلية التي يجري حاليا دراسة الدالة في explants فيفو السابقين . وبالإضافة إلى ذلك، يمكن مواصلة النموذج الزرد لاستخدامها كمنصة لاختبار فعالية مؤشرات وراثيا المرمزة التي يمكن تطبيقها بعد ذلك دراسة النشاط في خلايا الثدييات الشعر.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة/NIDCD البحوث الداخلية الأموال 1ZIADC000085-01 (K.S.K.). نود أن نعترف وونغ حلوى لمساعدتها في كتابة الماكرو فيجي. كما نود أن نشكر وو دوريس والحلوى وونغ لاقتراحاتهم مفيدة مع البروتوكول.

Materials

Section 1
α-Bungarotoxin R&D Systems 2133 For paralyzing larvae prior to imaging
Phenol red Solution 0.5%  Sigma-Aldrich P0290 For visualization of α-bungarotoxin solution during heart injection
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine) Sigma-Aldrich A5040 For anesthetizing larvae
Section 2
Imaging chamber Siskiyou PC-R Platform to mount larvae for imaging
No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm VWR 48366-227 To seal imaging chamber 
High vacuum silicone grease Fischer Scientific 14-635-5D  For affixing of coverslip to imaging chamber
Silicone encapsulant clear 0.5 g kit Ellsworth Adhesives Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG To fill imaging chamber to create a surface to pin fish 
Oven Techne HB-1D For drying silicone encapsulant
Stereomicroscope Carl Zeiss Microscopy Stemi 2000 with transmitted light illumination For illuminating wire, forceps and scissors to make pins
Fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 For making pins 
Fine scissors  Cole-Palmer 5.5", EW-10818-00 For cutting tunsgten wire to make pins
Tungsten wire, 0.035 mm Goodfellow W005131 For head pins to immobilize larvae
Tungsten wire, 0.025 mm ThermoFischer Scientific AA10405-H4 For tail pins to immobilize larvae
Section 3
Micropipette guller Sutter Instrument Company P-97 For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles
Borosilicate glass capillaries w/ filament Sutter Instrument Company BF 150-86-10 Glass to be pulled into α-bungarotoxin injection needles for heart injection
Borosilicate glass capillaries w/o filament Sutter Instrument Company B 150-86-10 Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells
Pipette polisher Narishige MF-830 microforge To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks
Ceramic tile Sutter Instrument Company NC9569052 For scoring and evening breaking fluid-jet needles 
Sections 4 & 5
Fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 For pinning larvae
Gel loading tips Eppendorf 5242956003 For backfilling heart injection needles
Stereomicroscope Carl Zeiss Microscopy Stemi 2000 with transmitted light illumination For illuminating larvae during pinning and heart injection
Glass capillary/needle holder WPI MPH315 To hold fluid-jet needles
Manual micromanipulator Narishige M-152 For holding and positioning of needle holder to inject α-bungarotoxin 
Magnetic stand Narishige GJ-1 For holding manual micromanipulator for α-bungarotoxin injection
Pressure injector Eppendorf Femtojet 4x To deliver α-bungarotoxin
Sections 6, 7 & 8
Confocal microscope Bruker Swept field/Opterra confocal microscope Fixed, upright microscope with DIC optics and 488nm laser with appropriate filters
Microscope software Bruker Prairieview 5.3 To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet
10X air objective Nikon MRH00101 Low magnification for positioning of larvae and fluid jet
60X water objective Nikon MRF07620 Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)
Piezo-Z objective scanner with controller/driver Physik Intruments instruments/Bruker 01144210/UM-Z-PZ High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy
EMCCD camera  QImaging Rolera EM-C2 EMCCD camera  Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s
Circular chamber adapter Siskiyou PC-A For holding and rotating imaging chamber on microscope stage
Motorized Z-deck stage Prior Scientific ZDN12MP Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together
Z-deck stage insert adaptor NIH Machine shop custom To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage
Fluid-jet apparatus ALA scientific instruments HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP For controlling and delivering the fluid-jet stimulus
Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 ft) Cole-Palmer Masterflex L/S 13, 96400-13 For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump
Motorized micromanipulator Sutter Instrument Company MP-225 For holding and positioning of needle holder for fluid jet 
Micromanipulator controller Sutter Instrument Company MPC-200 For controlling fluid-jet needle manipulator
Gel loading tips Eppendorf 5242956003 For backfilling fluid-jet needles
Glass capillary/needle holder WPI MPH315 To hold fluid-jet needles
PSI manometer Sper Scientific 840081 For measuring pressure clamp output
Section 9
BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant ThermoFischer Scientific B1204 To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals
Isradipine Sigma-Aldrich I6658 To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse
DMSO Sigma-Aldrich D8418 Solvent for pharmacological compounds
Section 10
Prism7 Graphpad Prism7 Software to plot GCaMP6 intensity changes
FIJI Schindelin, et., al.34 https://fiji.sc/ Software to process images and create spatio-temporal signal maps
Turboreg Plugin Thévenaz et., al.29  http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
StackReg Plugin Thévenaz et., al.29 http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
Times Series Analyzer V3 Plugin Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. 163 (8), 1605-1625 (2011).
  2. Pérez Koldenkova, V., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
  3. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  4. Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging Neuronal Activity with Genetically Encoded Calcium Indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), (2012).
  5. Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
  6. Harris, G. G., Frishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), 76-79 (1970).
  7. Eatock, R. A. Vertebrate Hair Cells: Modern and Historic Perspectives. Vertebrate Hair Cells. , 1-19 (2006).
  8. Tang, L. S., Montemayor, C., Pereira, F. A. Sensorineural hearing loss: potential therapies and gene targets for drug development. IUBMB Life. 58 (9), 525-530 (2006).
  9. Assad, J. A., Shepherd, G. M. G., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
  10. Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (22), 10297-10301 (1995).
  11. Ricci, A. J., Wu, Y. -. C., Fettiplace, R. The Endogenous Calcium Buffer and the Time Course of Transducer Adaptation in Auditory Hair Cells. Journal of Neuroscience. 18 (20), 8261-8277 (1998).
  12. Moser, T., Beutner, D. Kinetics of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse of the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 883-888 (2000).
  13. Brandt, A., Khimich, D., Moser, T. Few CaV1.3 channels regulate the exocytosis of a synaptic vesicle at the hair cell ribbon synapse. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (50), 11577-11585 (2005).
  14. Olt, J., Allen, C. E., Marcotti, W. In vivo physiological recording from the lateral line of juvenile zebrafish. The Journal of Physiology. 594 (19), 5427-5438 (2016).
  15. Olt, J., Johnson, S. L., Marcotti, W. In vivo and in vitro biophysical properties of hair cells from the lateral line and inner ear of developing and adult zebrafish. The Journal of Physiology. 592 (10), 2041-2058 (2014).
  16. Griguer, C., Fuchs, P. A. Voltage-dependent potassium currents in cochlear hair cells of the embryonic chick. Journal of Neurophysiology. 75 (1), 508-513 (1996).
  17. Art, J. J., Fettiplace, R. Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea. The Journal of Physiology. 385, 207-242 (1987).
  18. Goutman, J. D., Pyott, S. J. Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Mouse and Rat Inner Hair Cells in the Intact Organ of Corti. Methods in Molecular Biology. 1427, 471-485 (2016).
  19. Einarsson, R., et al. Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  20. Fuchs, P. A. Time and intensity coding at the hair cell’s ribbon synapse. The Journal of Physiology. 566, 7-12 (2005).
  21. Moser, T., Brandt, A., Lysakowski, A. Hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 326 (2), 347-359 (2006).
  22. Trapani, J. G., Nicolson, T. Chapter 8 – Physiological Recordings from Zebrafish Lateral-Line Hair Cells and Afferent Neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
  23. Olt, J., Ordoobadi, A. J., Marcotti, W., Trapani, J. G. Physiological recordings from the zebrafish lateral line. Methods in Cell Biology. 133, 253-279 (2016).
  24. Stawicki, T. M., Esterberg, R., Hailey, D. W., Raible, D. W., Rubel, E. W. Using the zebrafish lateral line to uncover novel mechanisms of action and prevention in drug-induced hair cell death. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  25. Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring Intracellular Calcium Ion Dynamics in Hair Cell Populations with Fluo-4 AM. PLOS ONE. 7 (12), 51874 (2012).
  26. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  27. Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Chapter 10 – Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. Methods in Cell Biology. 133, 229-252 (2016).
  28. Sheets, L., et al. Enlargement of Ribbons in Zebrafish Hair Cells Increases Calcium Currents But Disrupts Afferent Spontaneous Activity and Timing of Stimulus Onset. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (26), 6299-6313 (2017).
  29. Chou, S. -. W., et al. A molecular basis for water motion detection by the mechanosensory lateral line of zebrafish. Nature Communications. 8 (1), 2234 (2017).
  30. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  31. . Fiji is just ImageJ Available from: https://fiji.sc/ (2018)
  32. Esterberg, R., Hailey, D. W., Coffin, A. B., Raible, D. W., Rubel, E. W. Disruption of intracellular calcium regulation is integral to aminoglycoside-induced hair cell death. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (17), 7513-7525 (2013).
  33. Stengel, D., Zindler, F., Braunbeck, T. An optimized method to assess ototoxic effects in the lateral line of zebrafish (Danio rerio) embryos. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 193, 18-29 (2017).
  34. Fadero, T. C., et al. LITE microscopy: Tilted light-sheet excitation of model organisms offers high resolution and low photobleaching. Journal of Cell Biology. , (2018).

Tags

In VivoCalcium ImagingLateral-lineHair CellsLarvalZebrafishMechanotransductionPresynaptic ActivitySensory Hair CellsTungsten WireHead PinsTail PinsAlpha BungarotoxinHeart InjectionMicromanipulatorPressure Injector

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lukasz, D., Kindt, K. S. In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish. J. Vis. Exp. (141), e58794, doi:10.3791/58794 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image