Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Uylissa A. Rodriguez; Yaping Zeng; Margaret A. Parsley; Bridget E. Hawkins; Donald S. Prough; Douglas S. DeWitt

doi:10.3791/58792

JoVE Journal > Neuroscience

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Neuroscience

Последствия взрыва индуцированной нейротравма под давлением грызунов средней мозговой артерии

Published: April 01, 2019

doi:

10.3791/58792

Uylissa A. Rodriguez^1,2, Yaping Zeng^1,2, Margaret A. Parsley^1,2, Bridget E. Hawkins^1,2, Donald S. Prough^1,2, Douglas S. DeWitt^1,2

¹Charles R. Allen Research Laboratories, Department of Anesthesiology,University of Texas Medical Branch, ²The Moody Project for Translational Traumatic Brain Injury Research,University of Texas Medical Branch

Summary

Здесь мы представляем протокол для описания методов для ex vivo сосудистой реактивности определение после первичного взрыва черепно-мозговой травмы (bTBI) с использованием сегментов церебральной артериальной изолированные, под давлением, грызун среднего (MCA). bTBI индукционные осуществляется с помощью ударной трубы, также известный как расширенный симулятор взрыва (ABS) устройства.

Abstract

Хотя там были исследования на гистопатологические и поведенческие эффекты воздействия взрыва, меньше были посвящены взрыв в церебральной сосудистой эффектов. Воздействия (т.е. не, взрыва) черепно-мозговой травмы (ЧМТ) как известно уменьшить давление саморегуляции в мозговой сосудистую как людей, так и экспериментальных животных. Гипотеза, что взрыв индуцированной черепно-мозговой травмы (bTBI), как последствия ЧМТ, приводит к нарушения церебральной сосудистой реактивности был проверен измерения миогенных проволочек ответы на снижение внутрисосудистого давления в грызунов среднего церебральной артериальной (MCA) сегменты от крыс, подвергается мягкой bTBI с помощью трубки шок расширенный симулятор взрыва (ABS). Крысах Sprague-Dawley взрослых, мужчины были под наркозом, интубированных, вентилируемые и подготовлен для Шам bTBI (идентичные манипуляции и анестезии за исключением взрыва травмы) или мягкий bTBI. Крысы были рандомизированы для получения Шам bTBI или мягкий bTBI следуют жертву 30 или 60 мин после травмы. Сразу же после bTBI восстанавливающих рефлекс подавления раз (ОР) были оценены, эвтаназии на время очков после травмы была завершена, мозг был собран и отдельных сегментов MCA были собраны, смонтированы и под давлением. Как внутрипросветная давления, увлажненную через артериальных сегментов был сокращен с шагом в 20 мм рт.ст от 100 до 20 мм рт.ст., MCA диаметров были измеряется и регистрируется. С понижением давления внутрипросветная, MCA диаметров росло значительно выше базовой линии в Шам bTBI групп в то время как MCA расширитель ответы были значительно сокращены (p < 0,05) в обеих группах bTBI, что подтверждается со зрением, меньше MCA диаметров записаны для bTBI групп. Кроме того, RR подавления в bTBI группах была значительно (p < 0,05) выше, чем в Шам bTBI групп. MCA собранные из Шам bTBI групп, выставлены типичные сосудорасширяющих свойства уменьшается внутрипросветная давления в то время как MCA собранные после bTBI выставлены значительно препятствует миогенных сосудорасширяющих ответы на снижение давления, сохраняется для по крайней мере 60 минут после bTBI.

Introduction

Похоже что в результате воздействия (т.е. не, взрыва) TBI, взрыв индуцированной черепно-мозговой травмы (bTBI) связанные с церебральной сосудистой травмы¹ и нарушения церебральной сосудистой компенсационного ответы на случаи как изменения в парциальных давлений двуокиси углерода (Пако₂)²^,³^,⁴ и кислорода (PaO₂)⁵. Кроме того воздействие взрыва вызвало церебральной артериальной спазм сосудов в животных⁶ и bTBI пациенты⁷^,,⁸. Хотя клинические TBI⁹ и жидкости перкуссия травмы (ИНФ)¹⁰^,^,¹¹¹² связаны с нарушением церебральной сосудистой реакции на изменения в артериального давления (т.е., давление саморегуляции)⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹², неопределенности остаются относительно воздействия bTBI на способности саморегуляции церебрального сосудистого давления.

Нарушение мозгового кровообращения реагирует на изменения системного артериального давления с целью поддержания непрерывной кислорода и питательных доставлены метаболически активные мозг¹³^,¹⁴^,¹⁵^, ¹⁶. Уникальный тип гомеостаза, саморегуляции¹⁷^,¹⁸^,¹⁹ возникает, когда «орган поддерживает постоянное кровотока, несмотря на изменения в крови (перфузии) давления или других физиологических и патологических стимулов»²⁰. церебральных артерий сжиматься или расширяться в ответ на изменения в кровяного давления, оксида азота (NO), вязкости крови, Пако₂ и PaO₂,^, и т.д.⁴^,¹¹^,¹⁶ ²¹. артериальная миогенных ответ относится к такой сужения или расширения. Миогенных сосудистой реакции, впервые описан Бейлисс²² и одним из основных механизмов саморегуляции CBF, характеризуется вазоконстрикция если перфузионного давления увеличивается и вазодилатация если перфузионного давления уменьшается ¹⁴ ^, ¹⁷. Эта Сосудистая реакция является неотъемлемое способность сократительной ткани (например, сосудистая гладких мышечных клеток, VSMC в) реагировать растянуть и/или изменения в Люмене и/или стены напряженности²³^,²⁴^, ²⁵^,²⁶^,²⁷^,^,²⁸²⁹. Когда напряжены артерий (например, во время внутрисосудистого давления увеличивается), VSMC сжимают²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁸.

Исследования, которые изучать сопротивление сосудов ex vivo обычно применяют один из двух методов для тестирования фармакологических и физиологические свойства изолированных сопротивление сосудов: метод монтажа кольца и канюлированной, под давлением метод. Метод подготовки монтируется кольцо судна включает в себя два провода, прошла intraluminally через сегмента судна, которые держат сегмент на месте. Измерять количество усилие на изометрически устойчивый провода датчиков стимуляции VSMC. Однако, эта технология несет с собой определенные оговорки, прежде всего, неизбежный ущерб, причиненный эндотелиального слоя просвета как провода передаются через него³⁰ и различной степенью растяжения, понесенные в изолированном сегменте что в свою очередь приводит к судно стены растяжение, в конечном счете затрагивающие судна чувствительность к фармакологических агентов³¹. Методология подготовки канюлированной, герметичный сосуд использует arteriograph, состоит из двух отдельных палат, которые собирают каждый дом размещение среднего артериального церебрального (MCA) от одиночного животного. Микропипеткой вставляется в каждом конце сегмента, проксимальный конец сегмента крепится к микропипеткой с швами и просвета мягко увлажненную с физиологическим солевым раствором (PSS) для того, чтобы ликвидировать крови и любые другие вещества. Дистальный конец затем фиксируется с швами. Трансмуральное или Люминал давление устанавливается путем повышения два водохранилища, прилагается к каждой пипетку для подходящей высоты выше каждый сегмент, но на разных высотах в отношении других³²^,³³^,³⁴^,³⁵ ^,³⁶. Преобразователи давления расположены вдоль водохранилища и micropipettes обеспечивают перфузии измерения давления в то время как суда усиливаются с помощью инвертированного микроскопа, оснащен монитор, видео камеры и масштабирования, позволяя для измерения внешнего MCA диаметров. Хотя оба метода являются ценными, лучше имитирует методологии подготовки канюлированной, герметичный сосуд и разрешений судов исследованы быть ближе к их в vivo условий³²^,³⁷.

Эффекты различных видов воздействия (т.е. не, взрыва) TBI на церебральной сосудистой реакции ранее были изучены в церебральной артериальной сегментов²¹^,³⁵^,^,³⁶³⁸. Используя аналогичный ex vivo MCA протокол для сбора судна, монтажа и перфузии, как описано в текущем исследовании, ранее исследования получил успех с их соответствующих расследований в связанных механизмов мозгового сосудистую дисфункции после ЧМТ. Голдинг et al.³⁴ рассмотрены эндотелия опосредованной Диатермический в взрослых, мужской Лонг-Эванс крыса MCA после тяжелой ЧМТ через контролируемые корковых воздействия (CCI) травмы. В втором исследовании, Голдинг et al.³⁶ расследование цереброваскулярной реактивности гипотензии или CO₂после сбора урожая в MCA от крыс, которые понесли мягкая ТПП. Yu et al.³⁸ анализируются ли Пероксинитрит падальщики улучшение проволочек ответы на сокращение внутрисосудистого давления в взрослых, мужской Sprague-Dawley крыса MCA сегментов подвергается ИПИ в то время как Мэтью et al.²¹ изучал миогенных ответы на гипотония в MCA собирают после умеренной, Центральный инф.

Лучше изучить гипотезу что bTBI, как не Доменная TBI, результаты в нарушения церебральной сосудистой реактивности, мы протестировали механизм способствует скомпрометированный саморегуляции, измеряя миогенных проволочек ответы для уменьшения внутрисосудистого давления ex vivo в изолированных, под давлением грызунов MCA сегментов (рис. 1) собранных от крыс, подвергается мягкая bTBI, с использованием модели трубки шок расширенный симулятор взрыва (ABS) (рис. 2 и рис. 3) (см. Родригес et al.³⁹ Таблица 1) использующий сжатый воздух непосредственно доставлен водитель камеры для создания Freidlander как⁴⁰ над – и пониженного давления волн (см. Родригес et al.³⁹1 рисунокA).

Рисунок 1 : Расположение средней мозговой артерии (MCA). Вентральной вид мозга крысы, подчеркнув расположение MCA по отношению к задней мозговой артерии (PCA), внутренней сонной артерии (МКА), внешних сонных артерий (ЭКА), базилярной артерии (BA) и общей сонной артерии (ОСО). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Расширенный взрыва симулятор (ABS) шок трубки устройства. ABS, используется для производства первичного взрыва травмы у всех животных, исследования. 1 = драйвер камеры; 2 = расширительная Камера; 3 = образца камеры; 4 = отраженной волны супрессор; желтая звезда = образец лоток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Protocol

Все экспериментальные протоколы были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Университета Техаса Медицинское отделение, ассоциации оценки и аккредитации лабораторных животных ухода (АААЛЖ) аккредитованных объекта. 1. животных подготовка к ABS Blast травмы Включите вентилятор механический грызунов тома и дыхание ставки между 40 – 45 вдохов в минуту. Переключатель термостатически контролируемых потепления на одеяло и ленты синий блокнот над ним. Подсоедините шланг вентилятора Вентилятор. Соберите эндотрахеальной интубации салазок, ларингоскоп, долго раскладки пинцет, стилет, эндотрахеальную трубку, и ватный тампон пропитанный 0,05 мл 1% лидокаина HCl. организовать на голубой коврик. Подтвердите что грызун анестезии «пузырь» камеры, вентилятора, воздушные камеры и изофлюрановая палаты шланги надежно подключены и придает их соответствующих вилки или розетки. Цистит пузырь палата зажим должен быть открытым; Держатель вентилятора должны быть закрыты. На воздушные камеры установите регулятор для воздуха в помещении до 2 Л/мин и ручку для кислорода до 1 Л/мин. Включите изофлюрановая и установите ручку в 4% объема смеси. Запустить таймер и молодых взрослых (≈3 месяцев), мужской Sprague-Dawley крыса (350-400 г) в анестезии пузырь камеры для 4 – 6 мин. Взвешивание крыс на Марк 2 мин. Подтвердите, что крысы полностью под наркозом, мягко сжимать пальцы задние лапы. Если наблюдается не лапы вывода, уменьшить воздуха в помещении и установите ручку в 1 Л/мин, кислорода до 0,4 Л/мин и изофлюрановая до 2% объема смеси. Включите монитор температуры прямой кишки telethermometer. ОТКРОЙТЕ зажим для вентилятора и близко зажим к палате обезболивающий пузырь. Удалите крысы из анестезии пузырь камеры и позиции на санях эндотрахеальной интубации. Интубировать крыса. Место Ларингоскоп в рот животного, использовать длинные раскладки пинцет позиционировать язык в сторону, тампоном лидокаин пропитанной хлопка тампон кончик вдоль внутри горла и аккуратно вставьте стилет, содержащий эндотрахеальную трубку в трахею крыс. После интубированных, вставьте конец шланга вентилятора для внешнего конца эндотрахеальной трубки и наблюдать и подтвердите, что крыса дыхание стабильно и без затруднений. Свяжите вниз эндотрахеальную трубку на место забота что язык свободен от узла. Применить Белый вазелин Зонд ректальный telethermometer и вставить непосредственно под хвост. Выньте лоток образца ABS из образца камеры и место под светильник жары для потепления до крыса размещение на лоток. Бритья в верхней части головы крысы, начиная над глазами и вниз, чтобы между ушами. Вырежьте вилки уха стандартного размера пены на одинаковых половинки с ножницами. Начало в центре основания вилку и вырезать прямо до закругленными подсказка. Вставьте половинки кусок в каждой подушечку сначала вдоль канала уха до контакта с барабанной перепонки. Контролировать ректальной температуры. После того, как будет достигнута температура 37 ° C, крыса готова быть загружена в лоток образца ABS. Закрепите крысы на поднос образца ABS. Снимите шланг вентилятора с эндотрахеальной трубки и быстро, но мягко скользить крыса в верхнем конце лоток, осторожно направляя голову через держатель открытия и резиновый воротник. Вставьте шланг вентилятора обратно в эндотрахеальную трубку, проверьте резиновый воротник, чтобы убедиться, что это, надежно, но не плотно вокруг шеи и убедитесь, что крыса лежит в боковой лежачем положении (рис. 3). Выключить изофлюрановая и снять шланг вентилятора с эндотрахеальной трубки. Блокировка и зафиксируйте лоток образца ABS, содержащий наркотизированных крыс в камеру образец ABS. Аккуратно щепотку Хинд лапу пальцами, с использованием длинный пинцет каждые 3 s до вывода рефлекторный ответ вызвал. 2. ABS Blast устройства подготовка и взрыв TBI индукции Примечание: Протокол 2.1 – 2.10 обычно шагов в то же время как шаги 1.1 – 1.22 так ABS готова для взрыва травмы администрации право после того, как загружается и обеспеченных в камеру образец крыса. Ослабьте ручку ручного гидравлического насоса (рис. 4A) для обеспечения любого остаточного воздуха бежать из драйвера камеры (рис. 4B) и ослабить камеры от его печать. Ослабьте гайки крышки (рис. 4C) от все нить стержни (рис. 4D) окружающих драйвер камеры и слайд камера справа и слева от расширительная камера (Рисунок 4E). Полностью удалите двух стержней все потока и их соответствующие колпачковые гайки, расположенные в верхней части водитель палаты для размещения листов майларовый между водителем и расширения производства. Стек и ленты вместе вдоль верхнего края четыре предварительно вырезать и предварительно отмеренных (длина 30 см, ширина 20 см, 0,004 дюйма толщиной) майлара листы (формируя майлара «мембраны») с помощью 2,54 см кусок липкой лентой. Надежно используя второй кусок ленты, лента верхним краем майлара мембраны в верхней палаты расширения и над центром открытия между водителем и расширения камеры (рис. 4F). Безопасный водитель камеры против майлара мембраны путем замены двух стержней все нить в верхней части камеры и ручной затяжки всех колпачковые гайки вокруг камеры. Расположить аксессуар стальной блок против ручного гидравлического насоса блок и водитель камеры до надежно подходят. Затяните ручку ручного гидравлического насоса и подтвердите, что драйвер камеры остается под давлением с нет утечки, наблюдая за порог постоянное давление на индикаторе гидравлические. Откройте файл приобретение триггера, записывает ABS взрыв устройства давления следов на компьютере устройство ABS blast. Отвинтите Резервуар сжатого воздуха (рис. 4G) основная ручка достаточно слегка открыть дыхательные пути. Эксплуатация ручного гидравлического насоса, до тех пор, пока индикатор уровня достигает красная стрелка, указывающая уровень давления нужного палаты ≈5, 000 psi. Безопасный и позиции наркотизированных животных на поднос ABS образца (рис. 4H) в боковых лежачем положении (рис. 3) и зафиксируйте лоток образца в камеру образец ABS (Рисунок 4я). Аккуратно щепотка задние лапы, используя длинный пинцет каждые 3 s до вывода рефлекторный ответ вызвал. Нажмите кнопку Пуск на странице приобретение открытые на компьютере устройство ABS blast. Как только на экране появится окно «Фирм», нажмите и удерживайте триггер устройство ABS взрыва до взрыва погасла, сверлении майлара мембраны и управляющей взрыва травмы ABS (20.9 ПСИ ±1.14, 138 кПа ±7.9) для крыс. Сразу после взрыва взрывает, начните второй таймер, чтобы отслеживать, сколько времени (в мин и s) прошло после травмы. Выньте крысы из лотка образца ABS и вернуться на голубой коврик и потепления одеяло, поставив его полностью на спине для оценки выпрямляющий рефлекс подавления. Рекордное время для возвращения восстанавливающих рефлекс. Наблюдая за второй таймер, документ в мин и s время после травмы, которые он принимает для крысы ролл от его обратно на его живот три последовательных раз. Возвращение крыса в зале обезболивающий пузырь. Ослабьте ручку ручного гидравлического насоса для рыхления драйвер камеры и движения. Затяните ручку главный резервуар сжатого воздуха для того чтобы закрыть дыхательных путей. Рисунок 3 : Крыса размещение на лоток образца ABS и внутри ABS. Направления и ориентации исследование животного внутри АБС. При помещении в АБС, животное находится в поперечной лежачем положении с дорсальной поверхности головки перпендикулярно направлению ударной волны (красные стрелки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4 : Расширенный симулятор взрыва (ABS) шок трубки устройства схематический. Основные компоненты АБС. A = ручной гидравлический насос; B = драйвер камеры; C = колпачковые гайки; D = все нить стержней; E = расширительная Камера; F = место размещения майлара мембраны; G = баллонов сжатого воздуха; H = образец лоток; Я = образец камеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 3. Приготовление раствора PSS грызунов MCA Примечание: В то же время обычно выполняются действия протокола 3.1 – 3.3, как шаги 1.1 – 1.22 PSS решение готова к использованию. Подготовить и смешайте 1000 мл физиологического раствора соли (PSS) следующих состава и концентрации: 130 мм NaCl; 4.7 мм KCl; 1.17 мм MgSO4∙7H2O; Глюкоза 5 мм; 1.5 мм CaCl2; 15 мм NaHCO3. Сбалансировать PSS с газовой смеси 21% O2 и 5% CO2 в балансе N2. Решение готово, когда читает рН 7,4.Примечание: Все газы получаются из баллоны со сжатым газом в концентрациях, упомянутых выше. Заполните резервуар бутылки и труб с приготовленным раствором PSS и холод оставшийся раствор. 4. Добыча грызунов MCA сегментов После документирования восстанавливающих рефлекс время, возвращение крыса в зале обезболивающий пузырь. Закройте зажим для вентилятора и откройте зажим в палату. Поверните изофлюрановая на 4% объема смеси и держать крыс в камере для 2-3 мин до глубоко под наркозом. После того, как крыса наркоз, откройте зажим для вентилятора и близко зажим к палате обезболивающий пузырь. Уменьшить изофлюрановая до 2% объема смеси и удалить его из камеры пузырь. Поместите его на животе на потепление одеяло и снова вставьте конец шланга вентилятора для внешнего конца эндотрахеальной трубки. Поддерживать искусственной вентиляции легких при коэффициенте дыхание от 40 – 45 вдохов в минуту и анестезии на 2% объема смеси для 30 или 60 мин немедленно пост bTBI травмы. После завершения либо 30 или 60 мин выживания время, увеличить изофлюрановая до 4% от объема смеси и глубоко анестезировать для 5-6 мин немедленно усыпить, обезглавливание, с помощью гильотины грызунов конкретных.Примечание: В этих экспериментах мы держали под наркозом и искусственной вентиляции легких после возвращения выпрямляющий животных рефлекторные до обезглавливание. Если исследование требует длительного выживания timepoints, анальгетиков должно осуществляться для животного до появления от анестезии. Деликатно удалите мозга от черепа. Используйте лезвие скальпеля #10 сделать Центральный, 1,5-дюймовый вертикальной, кость глубокий разрез от верхней части бритые головы до затылочного мыщелка. Используйте малых костей rongeurs для открытия и кожи головы от кости черепа. Используйте большие кости rongeurs для вырезки и извлечь затылочной, interparietal и нижней половины лобной кости, обшивка мозга. Лопаточкой хирургической тщательно выкопать мозг из черепа после того, как мозг бесплатно вокруг кости.Примечание: Принять крайней осторожностью, когда разделения мозга от черепа так, как не излишне буксир, дергать или тянуть деликатный MCA сегментов от черепной стены. Депозит заготовленной мозга в охлажденной PSS решение, содержащееся в небольшой стакан Петри блюдо, которое непосредственно отдыхает на вершине твердого блока льда. Осторожно удалите как в левой и правой MCA начиная круг Уиллис. Продолжайте удаление сегмента боков и дорсально около 4-5 мм. Аккуратно очистите собранных MCA сегменты примерно 4-5 мм в длину любой соединительной ткани, с помощью microforceps. Смонтируйте MCA на arteriograph. Иглу проксимальный конец каждого сегмента с первого микропипеткой стекла (диаметр ≈70 мкм) и зафиксируйте с швом нейлона 10-0. Мягко perfuse просвет с PSS для удаления любых остатков крови и другие содержимое из просвета. Иглу дистального конца каждого сегмента с второй микропипеткой без растяжения сегмента MCA и зафиксируйте с швом нейлона 10-0. После успешной установки сегмента MCA, место камеры на вершине Перевернутый микроскопа для увеличения судов. Микроскоп оснащен видео камеры, монитора и видео скалер откалиброван с оптический микрометр для артериальной диаметр измерения. Заполните каждый сегмент и окружающие arteriograph Ванна с постоянно распространен PSS нагревается от комнатной температуры до 37 ° C и достижение равновесного уровня с газовой смеси 21% O2 и 5% CO2 в балансе N2. Сбалансировать MCA сегментов при давлении 50 мм рт.ст, 60 мин путем повышения бутылки водохранилище, подключен к micropipettes на нужной высоте над сегментами. Преобразователи давления, расположенный между micropipettes и водохранилище бутылки будет оценивать Трансмуральное давление в сегменте MCA, указывающий, когда достиг желаемого давления 50 мм рт.ст.. После завершения периода уравновешивания увеличить внутрисосудистого давления до 100 мм рт.ст, установив водохранилище бутылки на разных высотах. Доставить 30 мм K+ (для подтверждения судна сужением) через Люминал perfusate и мера артериальной диаметров. Примерно в 10 минут позже доставить 10-5 M Ach (для судна дилатация) и измерения артериального диаметров. Изучите судно проволочек ответы. Нижняя водохранилище бутылки для уменьшения внутрисосудистого давления от 100 мм рт.ст, 80 мм рт.. Разрешить MCA сегменты, чтобы сбалансировать для диаметров артериальной мера 10 мин. Уменьшения внутрисосудистого давления от 80 мм рт.ст 60 мм рт.. Разрешить MCA сегменты, чтобы сбалансировать для диаметров артериальной мера 10 мин. Уменьшить внутрисосудистого давления от 60 мм рт.ст, до 40 мм рт.ст.. Разрешить MCA сегменты, чтобы сбалансировать для диаметров артериальной мера 10 мин. Уменьшения внутрисосудистого давления от 40 мм рт.ст 20 мм рт.. Разрешить MCA сегменты, чтобы сбалансировать для диаметров артериальной мера 10 мин.

Representative Results

Средняя bTBI избыточного давления для всех животных, исследования был ±1.14 20.9 psi (138 кПа ±7.9). Средняя продолжительность выпрямляющий подавление рефлекса (ОР) для крыс, подвергаются воздействию shockwave ABS bTBI (5.37 мин ±2.1) не был значительно дольше (p = 0,36, bTBI против Шам) чем в группе Шам (5.10 мин ±1.6). В обоих 30 и 60 мин Шам группах MCA диаметров увеличилась приподнят над как внутрипросветная давление было сокращено с 100 до 20 мм рт.ст.. По сравнению с их соответствующими группами Шам, MCA проволочек ответы на непрерывном введенных уменьшения внутрисосудистого давления в наблюдаемых 30 мин (p = 0,01, bTBI против Шам) и 60 мин (p = 0.02, bTBI против Шам) ABS bTBI группы были значительно снижены после воздействия взрыва (рис. 5). Для более подробного обсуждения этих результатов см. Родригес et al.39. Эти исследования показали, что мягкая bTBI значительно нарушениями мозгового компенсационного расширитель ответы для уменьшения внутрисосудистого давления в сегментах MCA 30 и 60 мин после мягкой bTBI то время как уровни мягкая ударной волны, используемые в этих исследованиях привели к длительности подавление RR (< 30 s) аналогичны в Шам ранения крыс. Статистические анализы с программным обеспечением. Миогенных ответ на изменения в внутрисосудистого давления оценивалась путем расчета процентное изменение от базовой (100 мм.рт.ст.) для каждого уровня внутрипросветная давления (80, 60, 40 и 20 mmHg). Непарных студент t тесты были использованы для оценки различий между bTBI и Шам группы исходных линий. Различия в ответах расширитель MCA между группами bTBI и Шам были оценены с использованием Бартлетт и неоднократные односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) Дуннетт несколько сравнений испытания равные дисперсии. Из-за уменьшения статистической мощности, что результаты от повторных испытаний, сравнений в каждой конкретной точке давления в MCA экспериментов (например, между 100 и 80 мм рт.ст, а также между 60 и 40 мм рт.ст., и т.д.) не проводились. Значение было принято в p ≤ 0,05 уровне. Все данные в текст, таблицы и фигура выражается как средства ± стандартные ошибки средств (SEM). Рисунок 5 : Влияние bTBI на среднего артериального церебрального (MCA) ответы на уменьшения внутрисосудистого давления. Расширитель ответы прогрессивного сокращения в внутрисосудистого давления выставлены зрением сосудорасширяющих ответы и были значительно сокращены в 30 мин (p = 0,01, bTBI против Шам) и 60 мин (p = 0.02, bTBI против Шам) bTBI группы (n = 6/группа) после взрыва воздействия по сравнению с обеих групп Шам (n = 12). В обоих 30 и 60 мин Шам группах MCA диаметров увеличилась приподнят над как внутрипросветная давление было сокращено с 100 до 20 мм рт.ст.. Значения выводятся как средства ± SEM. *p < 0,05 против Шам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Как с всеми протоколами и инструкции, это важно точно следовать определенные шаги для протокола в рамках этого конкретного исследования и как можно точнее. После первоначального интубации крысы важно подтвердить, что это дыхание стабильно и без затруднений. Ошибочно Вставка эндотрахеальную трубку в пищевод вместо трахеи приведет к скрипучий, трудно вдохов, кровотечение и последующего зажигательные крысы из-за недостаточной обезболивающий доставки в легкие.

Когда лентой листы мембраны майлара над центром открытия между зале водителя и расширения, важно, что листы сосредоточены и охватывают весь открытие⁴¹³⁹^,. Misaligning листы за открытие приведет к утечки воздуха из камеры драйверов, падение в требуемое давление разрыва мембраны-потенциал и отказ администрации взрыва травмы. Располагающий надлежащим образом и надежно монтаж аксессуаров стали блока против ручного гидравлического насоса блок и водитель камеры также важно, как ужесточение рукоятку ручного гидравлического насоса и подтверждающие драйвер камеры остается под давлением без утечек. Правильное размещение стали блока позволяет для драйвера камеры плотно закрыть против расширения камеры, таким образом создавая обязательных печатью требуется палаты, открытие листов майларовый мембраны и между зале водителя и расширения.

Во время подготовки до экстракции судно MCA, газообразования PSS с необходимой смеси 21% O₂ и 5% CO₂ в балансе N₂ уравновешивает решение и облегчает потребовалось нейтральных физиологических рН, необходимой для работа PSS решение²¹^,^,³³³⁴.

Equilibrating сегментов при постоянном давлении для 60 мин²¹^,³²^,^,³³³⁴ чрезвычайно обязательным, поскольку этот шаг позволяет сегменты сжиматься следующее максимальное дилатация отображается во время их первый основной наддув. Это событие свидетельствует возникновение спонтанного тон, наводящий здоровые артерии³²^,^,³³³⁴свойства. Хотя уровни ассорти давления для уравновешивания сегмента были использованы в других исследованиях по³³^,³⁴^,⁴², это исследование и Мэтью et al.²¹, Голдинг et al.³⁵ и Голдинг et al.⁴³ достижение равновесного уровня сегментов на 50 мм рт.ст.. Хотя equilibrating собраны сегментов где-то между 40 мм рт.ст. – 100 мм рт.ст³² позволяет определенную гибкость и изменения для этого протокола, час уравновешивания период в рамках этих параметров давления в конечном итоге подтверждает здоровых артерий, необходимые для продолжения эксперимента.

Принимая крайнюю осторожность при удалении мозг из черепа и MCA сегментов слева и справа от круг Уиллис при сохранении этих судов является, пожалуй, наиболее важным этапом всего протокола. Прокалывание мозга с rongeurs кости, разрыв или тяжелой растяжения из сегментов во время удаления или случайно потянув судов с хирургической шпатель при раскопках в мозг из черепа в конечном счете приведет к уничтожение собранного MCA, вызывая непригодного сегментов и прекращено использование набора артерий, в конечном счете аннулирования всего эксперимента для этого животного.

Хотя измерения церебральной сосудистой ответы на проволочки или constrictory стимулов в MCA сегментов ex vivo , собранные после удара или взрыв TBI в естественных условиях принесло успех, методология, не без его трудности и/или ограничений. Возможно одна из более заметных сложностей, связанных с изучения последствий TBI на циркуляцию мозгового сосудистую отсоединение явные последствия ЧМТ судов от неявного эффекты, понесенные из-за различных материалов и элементы, формируемые потерпевшего мозга⁴⁴. Это мыслимо растерянность могут потенциально уклонился, анализируя ex vivo vasoconstrictory и сосудорасширяющих реакции собирают, открытию и/или под давлением Аму. В попытке уменьшить продолжительность времени, которое церебральных артерий в естественных условиях подвергаются локально сбрасываются Паренхиматозный вазоактивных материал до смерти коллекция церебральных артерий непосредственно после ЧМТ может уменьшить степень такого длительного воздействия эффекты. Ex vivo исследований на изолированных MCA дополнительно представить перспективу анализа механизмов травматического повреждения сосудов с помощью конкретных рецепторов агонистов и антагонистов или известных автомобилей сосудистых повреждений, что бы не позволить контроля как эффективно или как дискриминационный в естественных условиях. Впоследствии это ex vivo метод может сочетаться с ex vivo воздействия наркотиков для тестирования результате миогенных ответы (вазоконстрикция или дилатация судна сегмента воздействием наркотиков внутрисосудистого или внесосудистой).

Другие ограничения включают в себя примерно или нетерпеливо удаление MCA из собранного мозга, что может привести к преждевременной разрыв сосудов, таким образом аннулирования их использования. Кроме того давая более чем на несколько минут пройти между эвтаназии животного, коллекция судов и их размещение в приготовленный раствор PSS может также отвергать их жизнеспособность. Когда должным образом выполнены и после, методы, описанные в этом протоколе для тестирования миогенных ответы Аму после bTBI занимает несколько часов от начала до конца и попытки сократить продолжительность времени, необходимого для успеха может привести к экспериментальной провал. Однако, этот метод выполняется в пробирке и использует значительно более экономичным приборов и оборудования, чем в естественных условиях с высоким разрешением магнитный резонанс (МР) изображений⁴⁶ ⁴⁵^,или обычных доплеровская сонография / velocimetric методы⁴⁷^,⁴⁸^,⁴⁹ которой также работают для исследования судна.

Эти выводы, что мягкая bTBI травмы связан с нарушением мозгового проволочек ответы для уменьшения внутрисосудистого давления потенциально может быть функцией спазм сосудов⁶^,⁷ и VSMC hyperconstriction⁵⁰ ранее сообщалось, после взрыва воздействия в конечном итоге приводит к возникновениям, такие как снижение относительной церебральной перфузии. Кроме того взрыв индуцированного повреждения, препятствуя нормальной проволочек реакции мозга сосудистую возможно могли бы способствовать дальнейшему сокращений в церебральной перфузии при сочетании с артериальной гипотензией, частых случаев во время боевых действий.

Эти результаты показывают, что bTBI приводит к изменению механизмов содействия артериальных сосудов управления. Хотя наблюдались острая фаза церебральной сосудистой обесценение артериальной миогенных ответ на сокращение внутрисосудистого давления для по крайней мере час после травмы, там остаются пробелы в информации, окружающих острой фазы, после bTBI. Важность определения, какие биохимические и физические недостатки травмы мозга сосудистую и подверженности bTBI, что причин может помочь в определении уровня лечебных или реабилитационных успех довольно сразу после травмы головного мозга.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Исследования были завершены как часть команды, поддерживаемые проектом Moody поступательные травматических повреждений исследования мозга и премии W81XWH-08-2-0132 от медицинских исследований армии США и материал команды – Министерство обороны.

Materials

Advanced Blast Simulator (ABS)	Dyn-FX Consulting, Ltd. and ORA, Inc.	N/A	Blast-simulating shock tube used to induce primary blast injuries
Adult, male, Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories	N/A	Experimental animals
Arteriograph	Living Systems Instrumentation, Inc.	Arteriograph	Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter
Bone rongeurs, large	FST Fine Science Tools	Friedman Rongeur	Brain extraction from skull
Bone rongeurs, small	FST Fine Science Tools	Boynton Rongeur	Brain extraction from skull
CaCl₂	Sigma	Calcium chloride	Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Ear plugs	3M	Foam Ear Plugs 1100 Class AL	Prevent injury of ear tympanic membrane when in the blast machine
Glucose	Sigma	D-[+]-Glucose	Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Isoflurane	Piramal Enterprises Limited	Isoflurane, USP	Anesthetic
KCl	Sigma	Potassium chloride	Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
MgSO₄•7H₂O	Sigma	Magnesium sulfate	Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Microforceps	Buxton Biomedical Inc.	Micro Tying Fcps, 180mm	Brain extraction from skull
Mylar sheets	Texas Art Supply	Mylar	Membrane used for compressed air build-up during blasting
NaCl	Sigma	Sodium chloride	Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
NaHCO₃	Sigma	Sodium bicarbonate	Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Nylon suture	Ethicon	10-0 Ethilon nylon suture black monofilament 5" (13 cm)	Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter
Scalpel blade #10	Bard-Parker	10 Stainless Steel Surgical Blade	Brain extraction from skull
Surgical spatula	Delmaks Surgico	Cement Spatula	Brain extraction from skull
Thermometer	Physitemp Instruments, Inc.,	Thermalert Monitoring Thermometer	Monitoring of experimental animal's core body temperature
Volume ventilator	Harvard Apparatus, Inc.	Small Animal Ventilator	Constant and steading breathing of the intubated experimental animal
Water blanket	Gaymar Industries, Inc.	Mul-T-Pad Temperature Therapy Pad	Maintenance of experimental animal's body temperature

References

DeWitt, D. S., Prough, D. S. Blast-induced brain injury and posttraumatic hypotension and hypoxemia. Journal of Neurotrauma. 26 (6), 877-887 (2009).
Overgaard, J., Tweed, W. A. Cerebral circulation after head injury. Part 1: CBF and its regulation after closed head injury with emphasis on clinical correlations. Journal of Neurosurgery. 41 (5), 531-541 (1974).
Wei, E. P., Dietrich, W. D., Povlishock, J. T., Navari, R. M., Kontos, H. A. Functional, morphological, and metabolic abnormalities of the cerebral microcirculation after concussive brain injury in cats. Circulation Research. 46 (1), 37-47 (1980).
Wei, E. P., Kontos, H. A., Patterson, J. L. Dependence of pial arteriolar response to hypercapnia on vessel size. The American Journal of Physiology. 238 (5), 697-703 (1980).
Lewelt, W., Jenkins, L. W., Miller, J. D. Effects of experimental fluid percussion injury of the brain on cerebrovascular reactivity of hypoxia and to hypercapnia. Journal of Neurosurgery. 56 (3), 332-338 (1982).
Bauman, R. A., et al. An introductory characterization of a combat-casualty-care relevant swine model of closed head injury resulting from exposure to explosive blast. Journal of Neurotrauma. 26 (6), 841-860 (2009).
Armonda, R. A., et al. Wartime traumatic cerebral vasospasm: recent review of combat casualties. Neurosurgery. 59 (6), 1215-1225 (2006).
Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. Explosive blast neurotrauma. Journal of Neurotrauma. 26 (6), 815-825 (2009).
Bouma, G. J., Muizelaar, J. P. Relationship between cardiac output and cerebral blood flow in patients with intact and with impaired autoregulation. Journal of Neurosurgery. 73 (3), 368-374 (1990).
Lewelt, W., Jenkins, L. W., Miller, J. D. Autoregulation of cerebral blood flow after experimental fluid percussion injury of the brain. Journal of Neurosurgery. 53 (4), 500-511 (1980).
DeWitt, D. S., et al. Effects of fluid-percussion brain injury on regional cerebral blood flow and pial arteriolar diameter. Journal of Neurosurgery. 64 (5), 787-794 (1986).
Engelborghs, K., et al. Impaired autoregulation of cerebral blood flow in an experimental model of traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 17 (8), 667-677 (2000).
Mchedlishvili, G. Physiological mechanisms controlling cerebral blood flow. Stroke. 11 (3), 240-248 (1980).
Kontos, H. A. Regulation of the cerebral circulation. Annual Review of Physiology. 43, 397-407 (1981).
Golding, E. M., Robertson, C. S., Bryan, R. M. The consequences of traumatic brain injury on cerebral blood flow and autoregulation: a review. Clinical and Experimental Hypertension. 21 (4), 299-332 (1999).
DeWitt, D. S., Prough, D. S. Traumatic cerebral vascular injury: the effects of concussive brain injury on the cerebral vasculature. Journal of Neurotrauma. 20 (9), 795-825 (2003).
Paulson, O. B., Strandgaard, S., Edvinsson, L. Cerebral autoregulation. Cerebrovascular and Brain Metabolism Reviews. 2 (2), 161-192 (1990).
Lang, E. W., Diehl, R. R., Mehdorn, M. Cerebral autoregulation testing after aneurysmal subarachnoid hemorrhage: the phase relationship between arterial blood pressure and cerebral blood flow velocity. Critical Care Medicine. 29 (1), 158-163 (2001).
Soehle, M., Czosnyka, M., Pickard, J. D., Kirkpatrick, P. J. Continuous assessment of cerebral autoregulation in subarachnoid hemorrhage. Anesthesia and Analgesia. 98 (4), 1133-1139 (2004).
Roy, C. S., Sherrington, M. B. On the regulation of the blood-supply of the brain. The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).
Mathew, B. P., DeWitt, D. S., Bryan, R. M., Bukoski, R. D., Prough, D. S. Traumatic brain injury reduces myogenic responses in pressurized rodent middle cerebral arteries. Journal of Neurotrauma. 16 (12), 177-186 (1999).
Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).
Johnson, P. C., Henrich, H. A. Metabolic and myogenic factors in local regulation of the microcirculation. Federation Proceedings. 34 (11), 2020-2024 (1975).
Johnson, P. C. The myogenic response and the microcirculation. Microvascular Research. 13 (1), 1-18 (1977).
Atkinson, C. L., et al. Opposing effects of shear-mediated dilation and myogenic constriction on artery diameter in response to handgrip exercise in humans. Journal of Applied Physiology. 119 (8), 858-864 (1985).
Johnson, P. C. The myogenic response in the microcirculation and its interaction with other control systems. Journal of Hypertension. 7 (4), 33-39 (1989).
Allen, S. P., Wade, S. S., Prewitt, R. L. Myogenic tone attenuates pressure-induced gene expression in isolated small arteries. Hypertension. 30 (2), 203-208 (1997).
Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiological Reviews. 84 (3), 767-801 (2004).
Ahn, D. S., et al. Enhanced stretch-induced myogenic tone in the basilar artery of spontaneously hypertensive rats. Journal of Vascular Research. 44 (3), 182-191 (2007).
Demay, J. G., Gray, S. D. Endothelium-dependent reactivity in resistance vessels. Progress in Applied Microcirculation. 8, 181-187 (1985).
Nilsson, H., Sjöblom, N. Distension-dependent changes in noradrenaline sensitivity in small arteries from the rat. Acta Physiologica Scandinavica. 125, 429-435 (1985).
Halpern, W., Kelley, M. In vitro methodology for resistance arteries. Blood Vessels. 28, 245-251 (1991).
Bryan, R. M., et al. Stimulation of α2 adrenoreceptors dilates the rat middle cerebral artery. Anesthesiology. 85, 82-90 (1996).
Golding, E. M., et al. Endothelial-mediated dilations following severe controlled cortical impact injury in the rat middle cerebral artery. Journal of Neurotrauma. 15 (8), 635-644 (1998).
Golding, E. M., Contant, C. F., Robertson, C. S., Bryan, R. M. Temporal effect of severe controlled cortical impact injury in the rat on the myogenic response of the middle cerebral artery. Journal of Neurotrauma. 15 (11), 973-984 (1998).
Golding, E. M., et al. Cerebrovascular reactivity to CO(2) and hypotension after mild cortical impact injury. The American Journal of Physiology. 277 (4), 1457-1466 (1999).
Speden, R. N. The use of excised, pressurized blood vessels to study the physiology of vascular smooth muscle. Experientia. 41, 1026-1028 (1985).
Yu, G. X., et al. Traumatic brain injury in vivo. and in vitro. contributes to cerebral vascular dysfunction through impaired gap junction communication between vascular smooth muscle cells. Journal of Neurotrauma. 31 (8), 739-748 (2014).
Rodriguez, U. A., et al. Effects of mild blast traumatic brain injury on cerebral vascular, histopathological and behavioral outcomes in rats. Journal of Neurotrauma. 35 (2), 375-395 (2018).
Friedlander, F. G. The diffraction of sound pulses; diffraction by a semi-infinite plane. Proceedings of the Royal Society of London. Series A, Mathematical and Physical Sciences. 186 (1006), 322-344 (1946).
Tompkins, P., et al. Brain injury: neuro-inflammation, cognitive deficit and magnetic resonance imaging in a model of blast induced traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 30 (22), 1888-1897 (2013).
Cipolla, M. J., Vitullo, L., McKinnon, J. Cerebral artery reactivity changes during pregnancy and the postpartum period: a role in eclampsia. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), 2127-2132 (2004).
Golding, E. M., Robertson, C. S., Bryan, R. M. Comparison of the myogenic response in rat cerebral arteries of different calibers. Brain Research. 785 (2), 293-298 (1998).
DeWitt, D. S., Prough, D. S. Assessment of cerebral vascular dysfunction after traumatic brain injury. Animal Models of Acute Neurological Injuries II: Injury and Mechanistic Assessments. , (2012).
Degnan, A. J., et al. MR angiography and imaging for the evaluation of middle cerebral artery atherosclerotic disease. American Journal of Neuroradiology. 33 (8), 1427-1435 (2012).
Liu, Q., et al. Comparison of high-resolution MRI and CT angiography and digital subtraction angiography for the evaluation of middle cerebral artery atherosclerotic steno-occlusive disease. The International Journal of Cardiovascular Imaging. 29 (7), 1491-1498 (2013).
Newell, D. W., Winn, H. R. Transcranial Doppler in cerebral vasospasm. Neurosurgery Clinics of North America. 1 (2), 319-328 (1990).
Schenone, M. H., Mari, G. The MCA Doppler and its role in the evaluation of fetal anemia and fetal growth restriction. Clinics in Perinatolgy. 38 (1), 83-102 (2011).
Morris, R. K., Say, R., Robson, S. C., Kleijnen, J., Khan, K. S. Systemic review and meta-analysis of middle cerebral artery Doppler to predict perinatal wellbeing. European Journal of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Biology. 165 (2), 141-155 (2012).
Alford, P. W., et al. Blast-induced phenotypic switching in cerebral vasospasm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12705-12710 (2011).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Rodriguez, U. A., Zeng, Y., Parsley, M. A., Hawkins, B. E., Prough, D. S., DeWitt, D. S. Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries. J. Vis. Exp. (146), e58792, doi:10.3791/58792 (2019).

Automatically Generated