加圧齧歯動物に及ぼす影響の爆発による頭部外傷の中間の大脳動脈

実験的プロトコルをすべて機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) テキサス医学部、評価会の大学によって承認された、実験動物管理 (AAALAC) 認定認定施設。 1. 動物腹筋爆発怪我に備えて 齧歯動物ボリュームを機械的人工呼吸器をオンにし、呼吸率は 40-45 分あたり呼吸の間を設定します。 スイッチはサーモスタット制御地球温暖化の毛布に、青いパッドの上にテープします。 ベンチレーター ホースを人工呼吸器に接続します。 気管内挿管のそり、喉頭鏡、長いピックアップ ピンセット、スタイレット、気管内チューブを収集し、綿棒が 0.05 mL の 1% リドカイン塩酸整理青いパッドの上で浸漬します。 齧歯動物麻酔「バブル」商工会議所、人工呼吸器、空気室とイソフルラン チャンバー ホースを安全に接続し、それぞれのプラグやソケットに接続されているを確認します。麻酔泡箱クランプすべきオープン。人工呼吸器のクランプを閉じる必要があります。 空気室の 2 L/分、1 L/分の酸素のためのつまみに部屋の空気のためのつまみを設定します。 イソフルランをオンにし、ボリュームの混合物の 4% にノブを設定します。 タイマーを開始し、4-6 分間麻酔の泡箱のヤング アダルト (≈3 ヶ月)、雄 Sprague-dawley ラット (350-400 g) を配置します。 2 分のマークでラットの重量を量る。 ラット後肢のつま先を軽くつまんで麻酔をかけられ完全に確認してください。足撤退を認められなかった場合、部屋の空気を減らすし、1 L/分、0.4 L/分の酸素、ボリューム混合の 2% にイソフルランにノブを設定します。 直腸 telethermometer 温度モニターをオンにします。 人工呼吸器にクランプを開き、麻酔の泡箱にクランプを閉じます。 ラットを麻酔泡箱と気管内挿管のそりの上の位置から削除します。 ラットを挿管します。動物の口の中で喉頭鏡を置き、方法のうち、舌の位置に長いピックアップ ピンセット、喉の内側に沿って綿棒リドカインに浸した綿綿棒の先端を使用して、ゆっくりラットの気管に気管内チューブを含むスタイレットを挿入します。 挿管、気管内チューブの外側の端に人工呼吸器のホースの端を挿入し、観察し、呼吸ラットでは着実に、難なくご確認ください。 場所は舌は結び目から無料世話に気管内チューブを固定します。 Telethermometer 直腸プローブに白色ワセリンを適用し、尾のすぐ下に挿入します。 試料室から abs 樹脂試験片トレーを取り外し、トレイにラット配置される前に地球温暖化の熱ランプの下で。 目の上と下にラットの頭皮の上を剃る耳の間。 標準サイズの泡耳プラグをハサミで同一の半分に切る。プラグの底面の中心で始まり、丸みを帯びた先端までまっすぐカットします。鼓膜に接触が行われるまでまず外耳道に沿って各耳の先端に半分の部分を挿入します。 直腸の温度を監視します。37 ° C の温度に達すると、ネズミは abs 樹脂試験片トレーにロードする準備ができています。 Abs 樹脂試験片トレーにラットを保護します。気管内チューブから人工呼吸器ホースを外し、すばやく、そっと優しく導くヘッド ホルダーを開くとゴムの襟を頭、トレイの上端にラットをスライドします。気管内チューブにベンチレーター ホース取り付け直しますチェックそれは確実にないようにゴム首輪首周りにしっかりとラットが側腹臥位 (図 3) で敷設されていることを確認し、。 オフに、イソフルラン、気管内チューブからベンチレーター ホースを取り外します。 ロック、abs 樹脂標本室に麻酔下のラットを含む ABS 試験片トレーを固定します。 優しくピンチ後肢足長いピンセットを使用してつま先のすべての 3 s まで撤退の反射的な反応が引き出されます。 2. 腹筋爆発デバイス作製とブラスト TBI 誘導 注:プロトコル手順 2.1-2.10 は通常手順 1.1-1.22 と同時に完了したので ABS は爆風損傷管理権利の準備ができて後ラットが読み込まれ、標本室に確保します。 ドライバー室 (図 4B) から脱出し、そのシールからチャンバーを緩めるに残留空気を可能にするために油圧の手ポンプ (図 4A) ノブを緩めます。 ドライバー室を取り巻くすべてのスレッド棒 (図 4D) からキャップ ナット (図 4C) を緩め、左とチャンバー (図 4E) からチャンバーをスライドさせます。 2 つのすべてのスレッドの棒とドライバーの間にマイラー シートの配置を可能にするためにドライバー室と拡張室の上部にある彼らの対応するキャップ ナットを完全に削除します。 スタックとテープの上端から 4 の事前カットに沿って一緒と中古 (長さ 30 cm、幅 20 cm、0.004 インチ厚い) マイラー シート (成形、マイラー ‘ 膜’) 2.54 cm 部分のマスキング テープを使用しています。ドライバーと拡張室 (図 4F) 間の開口部の中央に膨張空洞の上部にマイラー膜の上端をテープ テープの 2 番目の部分を使用して、安全に。 商工会議所と手締めの上部に 2 つのすべてのスレッドの棒の商工会議所を取り巻くすべてのキャップ ナットを取り付け、マイラー膜に対してドライバー室を固定します。 しっかりと合うまで油圧手ポンプ ブロックとドライバー室に対してアクセサリー鋼ブロックを移動します。 油圧手ポンプを締め、油圧計の定圧しきい値を観察することによってドライバー室まま漏れと加圧を確認します。 ABS 爆発デバイス コンピューター上の abs 樹脂ブラスト装置圧力トレースを記録するトリガー取得ファイルを開きます。 圧縮空気タンクの (図 4G) 主なノブ十分な気道を少し開くことを緩めます。 ゲージ インジケーター ≈5、000 の psi の必要なチャンバー圧力レベルを示す赤い矢印に到達するまでは、油圧手動ポンプを動作します。 セキュリティで保護されたと外側腹臥位 (図 3) で abs 樹脂試験片トレー (図 4H) に麻酔下の動物を配置し、(図 4私) abs 樹脂標本室に試験片トレーをロックします。 すべての 3 の長いピンセットを使用して軽くピンチ、後肢足 s 撤退の反射的な反応が引き出されるまで。 ABS ブラスト装置コンピューターで開かれた取得ページを開始をクリックします。 ‘Acquisitioning’ ウィンドウが画面に表示されたらを押し ABS ブラスト装置トリガー爆発消灯、マイラー膜を破裂し、ラットの ABS の爆発損傷 (20.9 psi ±1.14, 138 kPa ±7.9) の管理まで。爆発爆発直後後は、どのくらい時間 (分および秒) が受傷後経過を追跡する 2 番目のタイマーを開始します。 Abs 樹脂試験片トレーからラットを削除、青パッドと完全に立ち直り反射抑制の評価のための彼の背中に彼を置く地球温暖化の毛布に戻ります。 立ち直り反射のリターンのための時間を記録します。2 番目のタイマー、分と秒連続 3 彼の胃の上に背中からロールをラットにかかる受傷後、時間の長さの文書を観察します。ラットを麻酔の泡箱に戻ります。 ドライバー室を緩めると動きを可能にするために油圧の手ポンプ ノブを緩めます。 気道を閉じるために、圧縮空気タンクの主なノブを締めます。 図 3: ラット配置 ABS 試験片トレーと ABS. 内方向と ABS の内部研究動物の向き。ABS に置かれ、動物は衝撃波の方向 (赤矢印) に垂直の頭の背側表面で横の腹臥位では。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 4:高度なブラスト シミュレータ (ABS) ショック チューブ デバイスの概略図。ABS の主要なコンポーネントです。A = 油圧ハンドポンプ。B = ドライバー室;C = ナット;D = すべてのスレッド棒; E = チャンバー;F = のマイラー膜の配置場所G = 圧縮空気ボンベH = 試験片トレー。私 = 標本室。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。  3. 齧歯動物 MCA PSS 溶液の調製 注:プロトコル手順 3.1-3.3 は通常同時に完了した手順 1.1-1.22 PSS ソリューションが使用可能に。 準備し、次の組成と濃度の 1,000 mL 生理食塩水 (PSS) をミックス: 130 mM NaCl;4.7 mM KCl;1.17 mM MgSO4∙7H2O;5 mM グルコース;1.5 mM CaCl2;15 mM NaHCO3。 21% O2と N2のバランスで 5% CO2の混合ガスで PSS を平衡します。ソリューションは、pH 7.4 の読み取り準備ができてです。注:すべてのガスは、上記濃度圧縮ガスボンベから取得されます。 リザーバー ボトルやチューブ準備 PSS ソリューションを埋める、残りの溶液を冷やしなさい。 4. 齧歯動物 MCA セグメントの抽出 立ち直り反射時間の長さを記録後、ラットを麻酔の泡箱に戻ります。人工呼吸器、クランプを閉じ、商工会議所にクランプを開きます。ボリュームの混合物の 4% にイソフルランを切り、深く麻酔までの 2-3 分のために部屋でネズミを維持します。 ラットを麻酔すると、一度人工呼吸器にクランプを開き、麻酔の泡箱にクランプを閉じます。ボリュームの混合物の 2% に、イソフルランを減らすし、泡チャンバーから彼を削除します。地球温暖化の毛布の上に彼の胃に彼の場所、気管内チューブの外側の端に人工呼吸器のホースの端を再挿入します。 30 分または 60 分の呼吸率は 40-45 分あたり呼吸とボリュームの混合物の 2% で麻酔の間に機械換気を維持すぐにポスト bTBI 傷害。 いずれか 30 分または 60 分の生存時間の補完増加量の混合物の 4% にイソフルランと深くすぐに 5-6 分の麻酔後、斬罪に齧歯動物固有のギロチンを使用して安楽死させます。注:これらの実験で我々 動物の麻酔や立ち直りのリターンに続く換気反射まで保った斬首。 研究は、長い生存縦長を必要とする場合、麻酔から出現する前に動物に鎮痛薬を投与すべき。 繊細な頭蓋骨から脳を削除します。#10 メス刃を使用して、後頭顆まで坊主の頭皮の上から中央、1.5 インチ垂直、骨に深い切開を行います。 小さな骨 rongeurs を使用して開き、頭蓋の骨から頭皮皮膚を分離します。 大きな骨 rongeurs を使用して、カットし、後頭、interparietal、および脳を包む頭骨の下半分を抽出します。 脳が周囲骨の無料頭蓋骨から脳を慎重に発掘するのに手術のヘラを使用します。注:頭蓋の壁からセグメント頭蓋骨から脳を分離すると、不必要にタグボートにジャークや、繊細な MCA を引くときは、細心の注意を取る。 小さいガラスは固体の氷ブロックの上に直接休んでいるペトリ皿に含まれるチルド PSS ソリューションに収穫された脳を入金します。 ウィリス動脈輪から左と右 MCA 始まる両方を慎重に取り外します。約 4-5 mm の横方向と背側にセグメントを削除を続けます。 優しくきれいに microforceps を使用して任意の結合組織の長さ 4-5 mm 程度の収集した MCA セグメント。 により、MCA をマウントします。最初ガラス マイクロ ピペット (直径 ≈70 μ m) と各セグメントの近位端を cannulate、10-0 ナイロン縫合糸で固定します。 そっと、内腔から任意の残留血液やその他の内容を削除する PSS ルミナを灌流します。 MCA のセグメントをストレッチすることがなく 2 番目のピペットで各セグメントの遠位端を cannulate、10-0 ナイロン縫合糸で固定します。 MCA のセグメントの成功実装後血管の倍率の倒立顕微鏡のステージの上にチャンバーを配置します。顕微鏡付けビデオ カメラ、モニター、ビデオ スケーラ血管径測定のための光学マイクロメータの校正 各セグメント、周囲によりバスを室温から 37 ° C に加温し、21% O2と N2のバランスで 5% CO2の混合ガスと平衡循環継続的に PSS で埋めます。 60 分 50 mmHg の圧力で MCA セグメントは、セグメント上の適切な高さにマイクロ ピペットに接続されているリザーバー ボトルを上げることによって平衡します。マイクロ ピペットとリザーバー ボトル間にある圧力トランスデューサーは、目的 50 mmHg の圧力を達成するかを示す MCA セグメント内経壁圧を評価します。 平衡期間の結論の後さまざまな高さでリザーバー ボトルを設定することによって 100 mmHg に血管内の圧力を高めます。 (血管収縮の確認) のための 30 ミリメートル K+を提供を介して内腔液と動脈の直径を測定します。約 10 分後 10-5 M Ach (血管拡張) を提供し、動脈の直径を測定します。 容器の緩慢な応答を確認します。80 mmHg に 100 mmHg から血管内の圧力を減らすためにリザーバー ボトルを下げます。10 分測定動脈径の平衡に MCA セグメントを許可します。 60 mmhg 80 mmHg から血管内の圧力を減らします。10 分測定動脈径の平衡に MCA セグメントを許可します。 40 mmHg に 60 mmHg から血管内の圧力を減らします。10 分測定動脈径の平衡に MCA セグメントを許可します。 20 mmHg に 40 mmHg から血管内の圧力を減らします。10 分測定動脈径の平衡に MCA セグメントを許可します。