JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Hidrofobik ve hidrofilik bileşikler polimer nano tanecikleri Kapsülleme için NanoPrecipitation flash

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58757
, , , ,
1Department of Chemical and Biological Engineering,Princeton University

Summary

Flash NanoPrecipitation (FNP) polimer çekirdek-kabuk nano tanecikleri üretmek için ölçeklenebilir bir yaklaşımdır. Laboratuvar ölçekli formülasyonları hidrofobik veya hidrofilik therapeutics Kapsülleme için açıklanmıştır.

Abstract

Tedavi edici bir bileşik formülasyonu nano tanecikleri (NPs) içine benzersiz özellikleri aktarabilir. Kötü suda çözünen ilaç için NP formülasyonları bioavailability geliştirmek ve ilaç dağıtım bünyesinde değiştirin. Peptidler veya proteinler gibi hidrofilik ilaçlar için kapsülleme NPs içinde de doğal temizleme mekanizmaları koruma sağlayabilir. Ölçeklenebilir polimer NPs üretimi için bazı teknikler vardır. Flash NanoPrecipitation (FNP) kullanan bir işleme karıştırma geometrileri dar boyutu dağılımları ve 30 ve 400 nm arasında ayarlanabilir boyutlarıyla birlikte NPs üretmek için tasarlanmış olduğunu. Bu iletişim kuralı, çekirdek-kabuk polimer nano tanecikleri FNP kullanarak bir hedef boyutu laboratuvar ölçekli üretim için yönergeler sağlar. Protokol yalnızca küçük değişiklikler ile hidrofilik ya da hidrofobik bileşikler kapsüllemek için uygulanabilir. Teknik kolayca laboratuvar miligram ölçekli ekran formülasyonları için istihdam edilebilir. Müşteri adayı sayısı doğrudan gram ve kilogram-ölçekli için ölçeklendirilebilir. Sürekli bir süreç olarak, artık bu karıştırma işlemi çalıştırmak zaman yerine çeviri yeni süreç gemiler için ölçek-up içerir. FNP tarafından üretilen NPs ile tedavi son derece zengin, yoğun bir teskin polimer fırça şekil ve boyutu tekrarlanabilirlik ± % 6 var.

Introduction

Geç 1990’lardan beri klinik denemeler Nanomalzemeler1,2istihdam sayısı sürekli bir artış olmuştur. Yükselen faiz Nanomalzemeler vaadi hidrofobik ilaçların bioavailability geliştirmeye ve Tercihli içinde vücut3hedeflemeyi etkinleştirmek için yansıtır. Polimer nano tanecikleri (nano tanecikleri veya NPs burada anılacaktır) Bu sınıf malzemeler2giderek artan bir oranda temsil eder. Çünkü onlar-si olmak son derece ayarlanabilir özellikleri boyut, kompozisyon ve yüzey functionalization4gibi NPs ilgi topladı sahip. Kötü çözünür uyuşturucu yönetim için uygulandığında, NPs sık nerede tedavi hidrofobik çekirdeğin içinde kapsüllenir ve hidrofilik polimer fırça, kabuk oluşur bir çekirdek-kabuk yapısı var. Hidrofilik poly(ethylene glycol) (PEG) engellemek, hangi polimer fırça oluşturur ve bu yapıyı oluşturmak için basit bir yol parçacık çekirdek bölümünü oluşturan, parçalanabilir hidrofobik bloğu, oluşan bir amfifilik diblock kopolimer (BCP) istihdam ve steric sabitleme4,5kazandırır.

Çünkü basit ve değil enerji yoğun6Nanoprecipitation polimer nano tanecikleri için ortak bir imalat tekniği kullanıyor. En basit haliyle nanoprecipitation pipet karıştırılmış su aşırı bir birimine aseton gibi organik bir çözücü içinde NP bileşenler tarafından ek içerir. Sulu sulu çözüm için solvent değişikliği çözünmez çekirdek bileşeni yağış sonuçlanır. Sabitleyici bu büyüyen parçacık yüzeyinde toplanır tarafından daraltılmış hidrofobik blok7,8,9,10adsorpsiyon yönetti. Solvent ve su hızla homojen bir çözüm oluşturmak için karıştırdığında bir üniforma parçacık boyutu dağılımı elde edilir. Karıştırma çekirdekleşme ve derleme bileşenleri sonuçlar daha büyük, daha fazla polydisperse parçacık nüfus yavaştır. Basit bir test için kolayca erişilebilir rağmen karıştırılmış toplu yaklaşım tutarsızlık karıştırma nedeniyle geniş değişkenlik sonuçlanır ve ölçek-up6,11‘ e müsait değildir. Havacilik sürekli çalışacak NP üretim için başka bir cadde olarak ortaya çıkmıştır. Bu üretim araçlarının son zamanlarda Ding vd tarafından gözden geçirilmiş 11 . Ortak bir yaklaşım laminar akış solvent uzunluk ölçek alt mikron değerleri için azaltmak için odaklanan kullanır. Küçük akışı boyutları Tekdüzen parçacıklar11,12sağlamak çok önemlidir bu yüzden antisolvent karıştırma difüzyon tarafından oluşur. Parallelization birden fazla mikrosıvısal odalarının ölçek-up için büyük üretim birimleri için problemlidir.

Havacilik üniforma nanoprecipitation lehine hızlı karıştırma koşulları sınırlı, türbülanslı akış içinde dönüşümlü olarak üretilebilir. Bu koşullar altında mümkün Havacilik ile daha yüksek hacimsel flowrates elde etmek için özel karıştırma geometrileri Flash NanoPrecipitation (FNP) kullanır. Çözücü/anti-solvent lamellae difüzyon11,13uzunluk ölçek üzerinde formu giriş akışı kurşun girdaplar, üretimi için çalkantılı koşullar altında bir karıştırma odası girin. Böylece, tek tip çekirdekleşme ve terapötik gelişmesi kısa bir zaman ölçeğinde karıştırma elde edilir. Mikser sınırlı geometri akışı nerede çalkantılı enerji kaybı oluşur ve sistemin tamamı aynı işlem tarihi13deneyimleri bölge atlayarak izin vermez. Çekirdekleşme düzgün karıştırma odasında oluşur ve yüzey9,14üzerine BCP Meclisi tarafından durduruldu parçacık büyüme kadar ilerler. İstikrarlı parçacıkları içeren karışık akış sonra Ostwald bastırmak için ek antisolvent ile seyreltilmiş parçacıklar15,16,17ve olgunlaşma.

Sınırlı bir çarpan jet (CIJ) Mikser FNP için basit karıştırıcı tasarım ve Şekil 1A13‘ te gösterildiği gibi ölçeklenebilir ve sürekli bir şekilde iki akışların karıştırma izin verir. Bir çoklu giriş girdap Mikser (MIVM) hala Şekil 1B18içinde gösterildiği gibi tek tip parçacık oluşumu için gerekli hızlı micromixing elde ederken en çok dört farklı akış girdileri etkinleştirmek için geliştirilmiştir. FNP kolayca ticari ölçekli üretim için tercüme edilebilir basit formülasyonu tarama sağlar. İşleminin sürekli yapısı nedeniyle, büyük toplu iş boyutu oldukça uzun çalışma zamanlar, aynı ekipman tren kilogram-ölçekli üretim için etkinleştirme basit çeviri yeni gemiler gerektirmez.

Hidrofilik bileşikler peptidler ve proteinler (‘destekte’) gibi aynı zamanda işlem adlandırılan ters Flash NanoPrecipitation (iFNP) içinde kapsüllü. Teknik bir amfifilik burada bir blok hidrofobik, diğer bir polyacid19BCP gerektirir. İlk adım biyolojik içeren bir dimetil sülfoksit (DMSO) akış ve BCP diklorometan veya kloroform gibi lipofilik bir çözücü karşı hızlı karıştırma içerir. Hidrofobik blok fırça ile stabilize parçacıkların oluşumu sonuçlanır. Burada, böyle bir mimari bir ‘ters’ NP olarak adlandırılan. İonically olduğunu polyacid, çekirdek içerir multivalent katyon kullanarak çapraz. Bu edebiyat19,20,21‘ bildirilmiştir teknikleri tarafından microparticles veya PEG kaplı nano tanecikleri şeklinde sulu bir ortam içine işlenmek parçacıklar stabilize.

Bu iletişim kuralı veya hidrofilik hem de hidrofobik bileşikler Kapsüllenen polimer çekirdek-kabuk nano tanecikleri laboratuvar ölçekli üretim için istihdam edilebilir. Protokol alt her iki Mikser sınıflar – CIJ ve MIVM kullanımı hakkında yönergeler sağlar. Okuyucu romanı çekirdek bileşenleri için protokol uyum ve tekrarlanarak akış girdileri için uygun Mikser kullanarak istenen boyuta nano tanecikleri oluşturmak gerekir. Üç örnek formülasyonları FNP ve iFNP kullanarak aşağıda sunulmuştur. İki CIJ karıştırıcı istihdam ve MIVM15,22gerektirir. Kapsülleme bir modelinin ilk formülasyonu gösterir hidrofobik FNP tarafından bileşik. İkinci formülasyon kapsülleme modeli gösterir hidrofilik CIJ karıştırıcı iFNP tarafından bileşik. Son formülasyon bir MIVM kullanarak iFNP tarafından örneği protein kapsülleme sağlar. Bu üçüncü formülasyon için protokol küçük ölçekli, el MIVM ‘μMIVM’ olarak adlandırdığı kullanımını açıklar Mikser tasarım Basitleştirilmiş formülasyonu tarama için izin vermek için küçük ama ölçekleme davranışını anlaşılamamıştır ve karıştırıcı bir mikrosıvısal aygıt22değil. Protokol son kısmında ölçek-up kurşun formülasyonları tarama tespit üzerine bazı notlar bulunur. Bu formülasyonları öğrenme süreci için erişim noktası sağlar ve sonuç olarak parçalanabilir poli (Stiren) kullanmak için tasarlanmıştır-polimerler dayalı. Alternatif stabilizatörleri biyouyumlu ticari seçenekleri kullanılabilir14,23,24sayı ile literatürde tarif edilmistir.

Protocol

1. hidrofobik bileşikler polimer NPS’de CIJ Mikser kullanarak kapsülleme Hazırlamak ve ekipmanları temiz. Tedarik ve CIJ Mikser doğrulamak.Not: Ek bilgiler Bölüm 1 İnşaat rehberlik için bkz. En düşük CAD dosyalar de Ek bilgi kullanılabilir. Her kullanımdan önce tüm parçaları üzerinde CIJ karıştırıcı rahat ve çıkış hortumu bükülmüş veya sıkışmak emin olun. Bir duman başlık, 2-3 mL çözücü için her giriş bağdaştırıcısı içeren bir 5 mL radarı kilit şırınga iliştirin. Son Karıştırıcısı’nda kullanılan herhangi bir bileşikleri temiz olacak bir çözücü (Örneğin, aseton) seçin.Not: Tipik seçimleri aseton veya tetrahydrofuran (THF) vardır. Sadece kullanım polipropilen şırınga leaching gibi çözücü uyumluluk sorunları önlemek için. Şırınga Kauçuk O-ring mühür itici ile kullanmayın. CIJ derleme bir atık konteyner üzerinde ayarlayın.Not: Bu karıştırıcı sağladığını ve şırıngaları kolay kullanım sağlar iyi bir şişesi CIJ vücut daha küçük bir açılış ile çalışır. Sürekli şırınga itici karıştırma odası aracılığıyla içeriği üzerinde birkaç saniye boş düşürmek. Şırıngaları kaldırmak.Not: Şırınga muhafaza ve birden fazla mermi FNP çalışmaları arasında temizlik için yeniden kullanılabilir. N2 akışı kullanarak CIJ Mikser iç kuru. N2 satırın sonuna bir erkek radarı bağdaştırıcısında etkilidir.Not: temizlik solvent değilse (Örneğin, DMSO), uçucu tekrar adımları 1.1.3-1.1.5 aseton veya THF 1.1.6 adıma geçmeden önce. Koş, koş tutarlılık için kalan solvent kaldırmak çok önemlidir. Hedef besteleri, solvent ve antisolvent akışları hazırlayın. Hidrofobik bileşik (Örneğin, E vitamini), 10 mg/mL yeterli miktarda unstabilized THF FNP ishal için istediğiniz sayıyı tamamlamak için geçiyoruz. Hazır olun biraz daha fazla çalışma için gerekli.Not: Bu adımda, tartışma bölümünde kısıtlamaları tabi diğer çözücüler kullanılabilir. Çünkü butylated hydroxytoluene sulu düşük çözünürlük THF istihdam, solvent sabitleyici-Alerjik önerilir. Dikkatli olun (dahil peroksit test) peroksit birikimini önlemek ve peroksitler seviyesinin düşük (Örneğin, boya beyazlatma) belirli NP uygulamaları ile girişime neden olabilir unutmayın. E vitamini çözüm üzerinde bir girdap Mikser eriyene kadar karıştırın.Not: bazı bileşikler için banyo sonication için 1-2 dk çözünmüş bir çözüm oluşturmak için yardımcı olabilir. Tüm NP bileşenler tatlı çözünmüş önemlidir. Blok kopolimer sabitleyici dağıtılması (yani, poly(styrene) -b- poly(ethylene glycol), PS1.6 k-b-PEG5 k) Polimer çözüm oluşturmak için THF 10 mg/mL adım 1.2.1 olduğu gibi yaklaşık aynı seste, içinde.Not: Diğer solventler, tartışma bölümünde ayrıntılı kısıtlamaları tabi kullanılabilir. Polimer çözüm eriyene kadar bir girdap mikser ile karıştırın. Gerekirse, çözüm sonication banyo katı dağılmasına yardımcı olmak 1-2 min için yerleştirin.Not: Polimer micellar formda olamaz. Dinamik ışık saçılma (DL) yeni bir akış oluşturma bu kriteri karşılayıp karşılamadığını belirlemek için yararlı bir araç olabilir. 5 mg/mL E vitamini ve sabitleyici (% 50 E vitamini yükleme) ilk pipetting 0.25 mL tarafından E vitamini çözeltisi içeren bir 1,5 mL santrifüj tüpüne solvent giriş akışı oluşturun. O zaman 0.25 mL polimer çözeltisi aynı tüpüne pipet.Not: 0.5 mL başına daha büyük birimleri farklı şırınga boyutlarıyla mümkün. 10 mL ses giriş düzeyini, bir şırınga pompa kullanmak pratiktir. İsteğe bağlı olarak 5-10 s. bir girdap Mikser üzerinde iyi karıştırın, tekrarlanabilirlik CIJ çalıştırma arasında geliştirir kap sıkışmış herhangi bir sıvı kurtarmak 5-10 s için 1000 x g de tüp santrifüj kapasitesi. 0.525 mL deiyonize su ikinci 1,5 mL santrifüj tüpüne antisolvent akışı olarak pipet.Not: Solvent akışı asla antisolvent mevcut olmadan karıştırma odasına girer sağlar aşırı antisolvent olması daha iyi. Nerede çözücü/antisolvent karışımı tuz çözünürlük değil sınırlama bazı durumlarda, tamponlu sulu sistemleri kullanılabilir. 4 mL deiyonize su 20 mL mercek şişe veya uygun diğer konteyner quench duş pipet. Bir küçük manyetik heyecan bar şişe yerleştirin.Not: Sertleştirme banyo cilt15,17tarafından son solvent içeriği % 10 için düşürerek olgunlaşma Ostwald azaltır. Bu birim adresi işlem kısıtlamaları için ayarlanabilir ve doğrudan giriş akışı güç ile ölçeklendirilebilir. NPs tarafından FNP CIJ Mikser kullanarak üretmek. Temizlenmiş CIJ karıştırıcı bir duman başlıklı bir heyecan tabakta aşağıda açık sertleştirme banyo şişe yerleştirin. Pratik bir yapılandırma bir 50 mL tüp raf blok CIJ mikser ile şişe ve şişe yönetmen çıkış boru desteklemek için kullanır. Şekil 1A yönlendirme için bkz. Begin sertleştirme banyo yolu ile karıştırarak yaklaşık manyetik heyecan barda max hız. Bir künt uçlu iğne ile donatılmış 1 mL polipropilen kullanarak, tam birim antisolvent tüpünden çizin.Not: uyumluluk sorunları önlemek için bir lastik O-ring mühür içeren şırıngalar kullanmayın. Daha büyük giriş birimleri için bir uygun boyutlu radarı kilit şırınga kullanın. Şırınga çıkış şırınga ekseni üzerinde ortalamak veya depresyon sırasında kararsız olacaktır. Dikkatle tüm hava kabarcıkları şırıngadan çıkarın ve bir “Sharps” kap içinde atılması künt ucu iğne kaldırın. Böylece akış sadece şırınga açılışına gelen pistonu Başbakan. Şırınga CIJ giriş bağlantı parçaları birine iliştirin. Adımları 1.3.3-1.3.5 çözücü çözüm için yineleyin. Hızlı, sorunsuz ve düzgün şırıngaları aynı anda itici kişisel tercihinize bağlı olarak üst kısımları üzerinde topu el, elin avuç veya bir başparmak koyarak düşürmek. Sertleştirme banyo şişe atık toplama.Not: 0.5 mL giriş depresif 0,5 az s. CIJ Mikser hâlâ bağlı şırınga ilebir kenara. Heyecan çubuğu kaldırmak ve şimdi bir çekirdek-kabuk parçacık yapı (Şekil 1 c) ile NP dağılım içeren flakon kap. Karıştırıcı bir atık çözüm konteyner üzerinde tutun ve şırıngaları kaldırmak. Soygun birimi (yaklaşık 0.25 mL) sonra drenaj olacaktır. Kullanılan şırınga elden ve sonraki FNP deneme önce 1.1 temizlik adımı yineleyin.Not: boş soygun birime bu olumsuz örnek tekdüzelik olarak NPs içeren flakon izin vermez. Analiz ve NP dispersiyonu post-işleme gerçekleştirin. DLS kullanarak NP boyutunu tanımlamak için bir plastik küvet içine NP dispersiyonu 100 μL pipet ve sertleştirme banyo solvent (Örneğin, su) 900 μL ekleyin.Not: Daha küçük birimler düşük hacimli cuvettes için kullanılabilir. 10 kat seyreltme genellikle yeterlidir. De yukarı ve aşağı pipetting veya hafif sallayarak karıştırın. Örnek analiz etmek enstrüman özgü yönergeleri izleyin.Not: zeta potansiyel analiz veya elektron mikroskobu olarak yürütülen gibi alternatif karakterizasyonu teknikleri gerekir. NP dağılım uygulama tarafından dikte edildiği gibi daha fazla işlenen ve tartışma bölümünde gözden. 2. kapsülleme ters NPS’de CIJ Mikser kullanarak hidrofilik bileşiklerin Çözücü, antisolvent, hazırlamak ve duman hood çözümlerinde gidermek. Adımda 1.1, ikinci bir durulama ile THF tamamlamak için bir çözücü temizlik ve 1.1.6. adımda not yapıştırma olarak DMSO kullanarak açıklanan temizlik ve hazırlama yordamları tamamlayın. Hidrofilik bileşik dağıtılması (yani, Maltodekstrin (MD) dekstroz eşdeğer (DE), 4-7, ortalama molekül ağırlığı ile 3,275 g/mol, “3 k MD” =) FNP için istediğiniz sayıyı tamamlamak için yeterli hacim 10 mg/mL, DMSO içinde çalışır.Not: Diğer solventler, tartışma bölümünde özetlenen kısıtlamaları tabi kullanılabilir. Maltodekstrin çözüm eriyene kadar bir girdap mikser ile karıştırın. Gerekirse, çözüm sonication banyo katı dağılmasına yardımcı olmak 1-2 min için yerleştirin. Bir blok kopolimer sabitleyici oluşturun (Örneğin, poly(styrene) -b- poli (akrilik asit), PS5 k-b- PAA4,8 k) stok THF çözümde 11.1 mg/mL, yaklaşık aynı ses adım 2.1.2 polimer çözüm oluşturmak için olduğu gibi .Not: Diğer maddeleri ve sabitleyici konsantrasyonları kullanılabilir. DMSO kolayca bir çözücü THF yerine kullanılabilir. Polimer çözüm eriyene kadar bir girdap mikser ile karıştırın. Gerekirse, çözüm sonication banyo katı dağılmasına yardımcı olmak 1-2 min için yerleştirin.Not: Polimer giriş micellar bir formda olamaz. DLS yeni bir akış oluşturma bu kriteri karşılayıp karşılamadığını belirlemek için kullanılabilir. Solvent akışı giriş (0.5 mL) 1,5 mL santrifüj tüpü içinde sırayla aşağıdakileri birleştirerek hazırlamak: 0.250 mL 3 k MD çözeltisi, Polimer çözüm ve 0.025 mL deiyonize su 0,225 mL.Not: Bu akış su içeriği NP boyutu ve polydispersity üzerinde güçlü bir etkisi vardır. Genellikle içinde 2.5-10 vol % aralığı20çalıştırmak en iyisidir. Değerleri aralığının yüksek ucunda büyük molekül ağırlıklı bileşiklerin kapsülleme yardımcı olabilir. 5-10 s a girdap Mikser üzerinde iyi karıştırın. İsteğe bağlı olarak, herhangi bir sıvı tekrarlanabilirlik CIJ çalıştırma arasında geliştirir kap sıkışmış kurtarmak 5-10 s için 1000 x g de tüp santrifüj kapasitesi. Kalsiyum klorür (CaCl2) dihydrate, 25,0 mg/mL metanol içinde crosslinker çözeltisi hazırlamak.Not: Crosslinker 1:1 ücret oranında PAA bloğundaki asit gruplarına eklenir. Konsantrasyonu farklı bir crosslinker kullandıysanız veya farklı PAA blok boyutu veya polimer konsantrasyon kullanılan20,21ise buna göre ayarlayın. Antisolvent akışı tarafından pipetting 0.5 mL kloroform ve crosslinker çözüm (0.55 mL toplam) 0,05 mL microcentrifuge tüpüne hazırlayın.Not: Kabul edilebilir diğer antisolvents blok kopolimer isteyerek dikte ve çoğunlukla diklorometan veya aseton içerir. Crosslinker bunun yerine crosslink oluşumu20için izin vermek için NP dispersiyonu ek yaşlanma ile Sertleştirme banyo eklenebilir. 5-10 s a girdap Mikser üzerinde iyi karıştırın. İsteğe bağlı olarak, herhangi bir sıvı tekrarlanabilirlik CIJ çalıştırma arasında geliştirir kap sıkışmış kurtarmak 5-10 s için 1000 x g de tüp santrifüj kapasitesi. Antisolvent (yani, kloroform) 4 mL sertleştirme banyo oluşturmak için 20 mL mercek şişe ekleyin. Bir küçük manyetik heyecan bar şişe yerleştirin.Not: Bu birim adresi işlem kısıtlamaları için ayarlanabilir. NP oluşumu için protokolü 1.3 adımda anlatıldığı gibi tamamlayın. Analiz ve NP dispersiyonu post-işleme gerçekleştirin. DLS kullanarak NP boyutunu tanımlamak için bir cam küvet içine NP dispersiyonu 100 μL pipet ve quench duş almak için kullanılan çözücü 900 μL ekleyin. De yukarı ve aşağı pipetting veya küvet ışık ajitasyon karıştırın. Örnek analiz etmek için yazılım yönergeleri izleyin.Not: NPs polietilenin niteliksel DLS Dilüent20DMSO veya dimethylformamide (DMF) gibi iyi bir çözücü kullanarak DLS tarafından tespit edilebilir. Çapraz stabil olan parçacıklar bir çözücü otokorelasyon işlevinde parçacık boyutu en az değişiklikle sergileyecek. Kötü çapraz parçacıklar şişmeye ve zayıf otokorelasyon işlevi ve saçılma gücü21. İsteğe bağlı olarak, bir temel, amonyak iyonik complexation sürücü ve parçacık temel crosslinking güçlendirmek için gibi ekleyin. İsteğe bağlı olarak, amonyak gravimetrically amonyum hidroksit çözüm (genellikle 30 wt % amonyak) kullanarak metanol içinde 3.48 mg/mL solüsyon hazırlamak. 50 μL (yani, polimer asit gruplarında göre 0.6 eşdeğerleri) dropwise ile karıştırarak ekleyin.Not: Eşdeğerleri ya konsantrasyonu değişen tarafından istenirse ayarlanabilir veya birimin25eklendi. İsteğe bağlı olarak, Yaş en az 30 dk crosslinking gerçekleşmesi için hafif karıştırarak ile. İşlem microparticles veya kaplamalı NPs edebiyat19,20,21′ açıklandığı gibi üretmek için NP dağılım. 3. Ovalbumin ters NPS’de bir μMIVM kullanarak kapsülleme Solvent ve antisolvent çözümleri hazırlayın. Ovalbumin deiyonize su (“OVA”) 50 mg/mL çözeltisi hazırlamak. 0.75 mL çözeltisi A 1,5 mL santrifüj tüpü içinde sulandrarak 75 μL OVA çözüm DMSO hacimce % 10 su içeren DMSO OVA bir 5 mg/mL çözüm üretmek için 0.675 mL ile hazırlayın. Mix iyi ve daha önce açıklandığı gibi kısaca santrifüj kapasitesi.Not: adım 2.1.6 su efektleri ile ilgili bakın. Önceki bölümlerde olduğu gibi çözüm birimleri yukarı veya aşağı doğru uygun malzeme ihtiyaçlarını ölçeklenebilir. Çözüm B blok kopolimer sabitleyici çözülerek hazırlamak (Örneğin, poly(styrene) -b- poli (akrilik asit), PS5 k-b- PAA4,8 k) 6 mg/mL, DMSO içinde. Mix iyi ve gerekirse çözülmeye solüsyon içeren temizleyicide. 0.75 mL bir 1,5 mL santrifüj tüpüne pipet. THF (Çözüm C) 0.75 mL 1,5 mL santrifüj tüpü içine pipet. Kloroform (çözüm D) 1.85 mL cam mercek şişe pipet. 60,0 mg/mL metanol içinde kalsiyum klorür dihydrate crosslinker çözüm hazırlamak. Bir girdap Mikser kullanarak karıştırın. 4.17 mg/mL amonyak çözüm 2.3.4. adımda açıklandığı gibi metanol içinde hazırlamak. Kloroform 5,25 mL 15 mL santrifüj tüpü sertleştirme banyo ekleyin. Mikser derleme hazırlamak ve stand. Geometri disk, en iyi disk, anahtar anahtarı ve bir O-ring karıştırma alt alıcı toplamak. Bileşenleri ve mikser stand terminoloji şematik için bkz: Şekil 2 .Not: Ek bilgiler (Bölüm 1) ve edebiyat22MIVM inşaat ile ilgili ayrıntılar bulunabilir. En düşük CAD dosyalar de Ek bilgi kullanılabilir. O-ring iyi uyuyor ve aşınma veya hasar belirtisi vardır oluk içine yerleştirin.Not: Normal çalışma yıpranmış veya solvent şişmiş O-halkaları için yol açacaktır. O-ring gergin veya deforme görünüyorsa, Kuru gecede kullanmadan önce hava sağlar. Şekli gecede kurtarmaz, O-ring atın. Bu tüketim bir parçası olarak büyük bir hisse senedi tutmak. Dikkatli bir şekilde karıştırma diski en iyi disk üzerindeki mandal hizalayın ve birlikte itin. O-ring iki adet floş oturmak kontrol ederek yerlerinden olur değil emin olun. İki adet ters çevir ve el ile onları alt alıcısı ile bir araya. Böylece tam disk sıkma ile müdahale değil çıkış boru montaj gevşetti emin olun.Not: derleme sırasında iş parçacığı yakalar dikkatlice sökün ve uygularsanız bir gıda veya ilaç-sınıf anti-değerlendir threading sinir bozucu önlemek için. El sıkma sonra en iyi disk mandal için anahtar anahtarı uygun ve rahatça derleme sıkın. Sonra sıkıca karıştırma geometri alt yüzüne karşı oturur böylece çıkış boru montaj sıkın. Şırınga parçaları en iyi disk üzerinde rahat olduğundan emin olun. Çıkış boru destek plaka uzanır monte karıştırıcı Mikser stand üzerine yerleştirin. Çalışma alanı yolu dışında bekletilir mobil plaka destekleyecek. İsteğe bağlı olarak, mekanik stop hizalamasını denetlemek için ilk boş cam şırınga Mikser girişleri ekleyin.Not: Hacimsel flowrates şırıngaları aynı anda aynı lineer h∂z depresyonda mısın bu yana farklı Namlu çapı, şırınga kullanılarak çeşitlidir. İlk ve son Dikey Yükseklik tüm şırınga için aynı olması gerekir ve piston mili22vurdu set vida kullanılarak ayarlanabilir. Mekanik durur emin olmak için cam şırınga aşırı hasar meydana gelmez. İsteğe bağlı olarak, düşük bu yüzden mobil plaka üzerinde mekanik durur dinlenmek için geliyor. Plaka da hemen boş şırınga ( Şekil 2′ de görüldüğü gibi) başvurmadan önce dinlenmek için geliyor bunlar hizalandığından emin olun. İsteğe bağlı olarak, mekanik durur ve yeniden konumlandırmak, gerekirse gevşetin. Cam şırıngaları kaldırmak ve mobil plaka yoldan sıfırlamak.Not: plastik şırınga ile işlem için mekanik durur gerekli değildir. Açık sertleştirme banyo atık toplamak için çıkış boru altında yerleştirin. Çözüm A bir künt ucu iğne kullanarak 1 mL gaz geçirmez enjektör çizin. Tüm hava kabarcıkları kaldırmak ve elden iğne. Çözüm şırınga radarı montaj sonuna Başbakan. Çözümler B ve c için bu işlemi yineleyin Çözüm D bir künt ucu iğne kullanarak 2.5 mL gaz geçirmez enjektör çizin. Tüm hava kabarcıkları kaldırmak ve elden iğne. Çözüm şırınga radarı montaj sonuna Başbakan.Not: ilk şırınga dalgıç yükseklikleri aynı olması, bu birimlerin seçildi. Birimleri değiştirdiyseniz, hala bu yükseklik koşulları karşılaması gerekir. Mikser alfabetik sıraya göre saat yönünde bir moda üzerine dört şırınga bir araya getirin. Şekil 1B nihai görünümü ve şırınga yönlendirme şematik için bkz.Not: hiçbir şırınga yükseklik diğerlerinden önemli ölçüde farklı olduğundan emin olun ve gerektiği şekilde giderebilirsiniz. Mikser işlemi ve temizleme gerçekleştirmek. Kavrama taşıyan konut mobil plaka her iki tarafında. Çünkü bu bir tutam tehlikesi karşı mekanik durur parmaklarını gövdenin alt yüzünde koymayın. Böylece eşit zar zor şırıngaları dokunmadan ama dinleniyor mobil plaka yavaşça indirin. İşlemi tamamlamak için amaçlayan plaka, sürekli ve sorunsuz düşürmek 0.5-1 tanesi s bunlar için akış birimleri22. Kaldırmak ve şimdi NP dağılım içeren sertleştirme küvet kap. Mikser hâlâ bağlı şırınga ile alın ve bir atık konteyner üzerinde tutun. Konteyner içine boşaltmak soygun birimi izin şırıngaları kaldırmak. Mikser derleme ters tutun ve anahtar anahtarı kullanarak Bataryası sökmeye. Bir sprey şişesinde kullanarak, çıkış boru çeşitli çözücü (Örneğin, aseton) mililitre ile durulayın ve kuru hava veya azot ile. İyi bir çözücü (deiyonizeÖrneğin, su veya DMSO) ile karıştırma geometri durulama ve birkaç mililitre bir sprey şişesinden kullanarak aseton ile durulayın. Kuru bir hava veya azot akışı ile. O-ring stream deiyonize suyla durulayın ve kuru leke. Üst diskin aseton solvent bir şişe kadar görsel olarak temiz kullanarak birkaç mililitre ile iyice durulayın. Bir hava veya azot akışı ile Kuru yüzey ve şırınga parçaları. Birkaç iyi bir çözücü (deiyonizeÖrneğin, su veya aseton) mililitre her şırınga çözücü bir şişeden durulayın. Aseton birkaç mililitre bir son durulama geçerli ve sonraki kullanmadan önce kuru hava. Post-işleme ve çözümlemesi gerçekleştirin. Kalsiyum klorür dihydrate crosslinker çözüm karıştırma sırasında dropwise 50 μL yaklaşık % 75 eklemek maksimum hız. Karıştırma sırasında dropwise amonyak çözümün 50 μL % 75 maksimum hızda ekleyin. Yaş en az 30 dk için. NP boyutu 2.3.1 ve 2.3.2 adımlarda açıklandığı gibi karakterize. İşlem microparticles veya kaplamalı NPs edebiyat19,20,21′ açıklandığı gibi üretmek için NP dağılım. 4. değişiklikleri formülasyonu ölçek-up için Solvent ve antisolvent çözümler adım 1, 2 veya 3 istenen kompozisyon ve gerekli formülasyonu boyutu için yeterli hacim açıklandığı şekilde hazırlayın. İsteğe bağlı olarak, gerekirse, temiz ve mikser yerde NP oluşumu önce uygun bir iletişim kuralı kullanılarak sterilize.Not: CIP 100, su (için nötr pH), CIP 200, su (için nötr pH) ve uygun bir çözücü sıralı durular geçmişte istihdam edilmiştir. Ayrıca, steril filtreleri nerede son partikül büyüklüğü sterilizasyon engellemektedir durumlarda Mikser girişleri filtrasyon tarafından eklenebilir. Çözümleri uygun birim gaz geçirmez şırınga yük ve üstünde belgili tanımlık son donatılmış radarı bağdaştırıcımda politetrafloroetilin (PTFE) boru ekleyebilirsiniz. Çözümler hortumunun sonuna manüel. Şırıngaları bir şırınga pompa yüklemek ve şırıngaları CIJ veya gerektiği gibi MIVM Mikser girişleri ekleyin.Not: Alternatif olarak, akış kontrolcüler laboratuar veya pilot ölçek bir şırınga pompa daha büyük ses yetenekleri sağlamak için kullanılabilir. Başarılı işlem sürekli akış ve basınçlı kaplar üzerinde çıkış akış ölçümü ile büyük ölçekli üretim için en uygun seçim demektir yeterli basınç düşmesi gerekir. Gerekirse, çıkış boru altında quench duş yeterli biriminin içeren bir koleksiyon gemi yerleştirin. El ile elde uyum için hacimsel debi ayarla (Örneğin, 30-60 mL/dk akış başına hakkında).Not: CIJ kullanıyorsanız, pompa akış hızı aynı olmalıdır. MIVM kullanıyorsanız, farklı alıcılar farklı akış oranları olabilir. Aynı anda pompalar başlar. Atık yaklaşık 5-10 mL (Bu bir “başlangıç” birimdir) küçük bir şişe atık olarak toplamak ve daha sonra quench banyoda toplama başlar. Karakterize ve karşılık gelen formülasyonu yukarıdaki bölümde açıklandığı gibi işlemek.

Representative Results

NP formülasyonları FNP ile tarama hızlı ve küçük miktarlarda malzeme (sırasına 1-10 mg) gerektirir. E vitamini (adım 1) sonuçları istikrarlı bir açık veya hafifçe altındaydı NP dağılım gibi hidrofobik bileşikler kapsüllemek için FNP protokolü. Dinamik ışık saçılma (DL) partikül büyüklüğü karakterize etmek için güçlü bir araç sağlar. Şekil 3′ te gösterildiği gibi işlem tekrarlanabilir biçimde düşük bir polydispersity ile NPs üretir. Tipik polydispersity dizin (PDI) 0,20, daha az olduğunu gösteren bir nispeten monodisperse nüfus. PDI otokorelasyon işlevinden elde edilir ve genellikle araç yazılım uygulanır. Bu bir ilk andan, ikinci nerede 0.1 değerleri genellikle monodisperse parçacıklar26için alınır oranıdır. Dört E vitamini/PS-b-PEG formülasyonu çoğaltır bildirdi, değeri 0,12 ± 0,02 ve ortalama çapı 107 ± 7 nm oldu. Bir tipik “kendiliğinden patlar” şırıngaları ikisinden biri düzensiz depresyon veya yavaş depresyon hız nedeniyle Şekil 3′ de bildirilmektedir. Polydispersity etkilenmedi ama boyutu biraz daha büyük (135 mil). Bu örnek de dahil olmak üzere, 113 ± 14 nm partikül büyüklüğü için yeni ölçümlerdir. Bir tutukluk içinde dönem-in zaman nerede odası yalnızca bir tek akış içeriyorsa oluşur. Tüm akış karıştırıcı içinde organik ve sulu akışların göreli birimleri ve aynı işlem tarihi deneyimler önemlidir. Bir sabitleyici görünür toplamları ile opak bir çözüm üretilir. Bu örnek için DLS otokorelasyon işlev monoton olmayan ve sorunsuz olarak Şekil 3 ilave görülen çürüme değil. Parçacık boyut kontrolü FNP tarafından Şekil 4′ te gösterilen temel malzeme-poly(styrene)1.8 k bu durumda-ve PS -bgöreli miktarda değişen nerede-PEG sabitleyici sonuçlandı 49-152 nm arasında değişiyordu parçacıklar boyutlarda. Bu parçacık boyutları ile çekirdek bir toplam kütle konsantrasyonu ve sabitleyici olarak 20 mg/mL, içeren THF akarsu % 25, % 50 veya % 75 toplu poly(styrene) çekirdek materyali neredeydi üretildi. Nano tanecikleri polydispersity her zaman 0,15 az oldu. Partikül büyüklüğü FNP tarafından üretilen parametre efektleri geniş tartışma edebiyat10bulunabilir. Yükleme çözücü birim sabit tutarak ve çekirdek ve sabitleyici hisse senedi çözümleri göreli birimleri değişen ayarlanabilir. Benzer şekilde, toplam kütle konsantrasyonu 10 mg/mL dışındaki değerler stok çözümleri hazırlayarak çeşitli olabilir. Belirli koşullar altında bir boş micelle nüfus DLS27tarafından gözlemlemek mümkündür. Bu ölçülen parçacık boyutu dağıtım genişleyen dışında herhangi bir zararlı etkisi yok. Zaman boyutu benzer gelir, bu iki ayrı doruklarına yerine tek bir geniş tepe olarak tezahür. Aynı CIJ Mikser de hidrofilik bileşikler kapsüllemek için tarafından iFNP, ancak 2 iletişim kuralı örneği olarak kullanılabilir. Parçacıklardır bildirilen formülasyonu üretilen yaklaşık 65 nm 0,08 düşük bir polydispersity ile. Boyut dağılımı Şekil 5A (kesikli çizgiler) görülebilir. Crosslinking PAA karboksilik asit kalıntıları parçacık istikrar üzerinde gösterdi DLS analizde DMSO gibi güçlü bir çözücü tarafından Şekil 5Biçinde gösterildiği gibi etkisi. Otokorelasyon işlevi iyi çapraz parçacıklar için değeri 1 ve damla keskin 0 olarak karakteristik teker partikül büyüklüğü (düz çizgi) ile ilgili başlamak. Kapsamlı şişer veya dağıtılması parçacıklar çapraz değil ve en az otokorelasyon sinyal (noktalı çizgi) göstermektedir. İFNP için başarısız denemeler FNP için yukarıda açıklandığı gibi benzer şekillerde tezahür. Görünür toplamları görülebilir ya da zavallı DLS otokorelasyon işlevi şekli görülmektedir. İkiden fazla giriş akışı çözünürlük veya kimyasal uyumsuzluk gibi sistem kısıtlamaları nedeniyle gerekli olduğunda MIVM FNP veya iFNP için kullanılabilir. MIVM (μMIVM) onun Mikser stand ile küçük ölçekli bir sürümü Şekil 2′ de gösterilmiştir. CIJ gibi bu karıştırıcı hidrofobik veya hidrofilik bileşikleri22kapsüllemek için kullanılabilir. 3. adımda bir protokol kapsülleme hidrofilik bir protein, OVA, iFNP tarafından tanımlanmıştır. Partikül büyüklüğü dağılımı Şekil 5A (düz çizgi) gösterilir. Boyutudur yaklaşık 125 nm PDI 0.16 ile. Enjektör pompa işlemi daha büyük ölçeklerde için genel bir protokol adım 4’te verilmiştir. Şekil 1: karıştırıcı derleme ve iç akış şemaları desen. (Sınırlı çarpanA) jetler (CIJ) Mikser ekli şırınga ile Sertleştirme banyo konumlandırılmış. Resimde değil sertleştirme banyo şişe ve bir heyecan tabak heyecan barda mısın. Karıştırma geometri odanın ortasına vurmak iki akarsu alıcılar gösterilen genişletilmiş görünümde tasvir edilir. (B) A çoklu giriş girdap Mikser (μMIVM) cam şırınga ile gösterilen ve stand bir sertleştirme Hamamı yukarıda konumlandırılmış. Mobil Plaka ve mekanik durur resimden kırpılmış. Genişletilmiş Görünüm girdap odası ve giriş kanalları şematik gösterir. (C) A çekirdek-kabuk NPs FNP tarafından üretilen şematik gösterimi. Kırmızı Küre olan, mavi daraltılmış polimer blok ile kombine tedavi temsil, NP çekirdeğini oluşturmaktadır. Sarı polimer blok için NPs. steric sabitleme imparting fırça katman oluşturur Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 2: μMIVM terminoloji ve derleme için bileşenleri. ΜMIVM dört şırıngaların Tekdüzen depresyon etkinleştirmek için bir mikser stand gerektirir. Bu durumda, şırınga dalgıç heights tüm tutarlı karıştırma sağlamak için tek tip olması gerekir. Alternatif olarak şırınga pompaları kullanarak çalıştırılabilir. Mikser stand etiketli bileşenleri ile rakam solda gösterilir. Sağ tarafta karıştırma geometri disk üzerinde yerinde O-ring ile sökülüp karıştırıcı olduğunu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3: Parçacık boyutu bir çekirdek e vitamini içeren polimer nano tanecikleri dağılımı ve PS -btarafından stabilize-PEG. Dinamik ışık saçılma (DL) NP çapı dağıtım gösteren yoğunluğu ağırlıklı boyutu dağıtımları sağlar. Eğrileri onaylatılacak analizleri her deneme için Ortalama vardır ve aynı en yüksek tepe yükseklikleri üretmek için boyutlandırılan. Dört çoğaltır (düz çizgi) yönteminin yüksek tekrarlanabilirlik gösterir (Standart sapma = 7 nm). Da temsilcisi anlaşılmamak (kesik çizgi), daha yavaş şırınga hızı veya daha büyük parçacık çapı sonuçları iki şırıngaların düzensiz depresyon gibi içerir. Anlaşılmamak dahil olmak üzere NP boyutu standart sapması 14 oldu nm. (Gömme) PS -bolmadan-PEG sabitleyici, büyük mikron çaplı toplamları (veya damlacıklar, durumunda bir yağ E vitamini gibi) oluşur. DLS otokorelasyon işlevi bir çalışma sabitleyici (noktalı çizgi) olmadan bir nanopartikül Çoğalt (düz çizgi) gelen bir temsilcisi otokorelasyon birlikte gösterilir. Otokorelasyon işlevi için polydisperse nüfus gösteren denetimi örneğini karakteristik zaman çizelgelerine sayısını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4: çekirdek sabitleyici için malzeme göreli oranları değişen aracılığıyla parçacık boyutu denetimi tarafından FNP. Üç formülasyonları ile poly(styrene) çekirdek boyutu yoğunluk-ağırlık dağılımları PS -btarafından stabilize-PEG tasvir. Toplam kütle konsantrasyonu THF içinde 20 mg/mL ve antisolvent su oldu. Formülasyonları CIJ karıştırıcı hazırlanmıştır. Çekirdek malzemeden oluşan kitle kısmını göstergede gösterilir. Örneğin, % 25 çekirdek numunesi 5 mg/mL poly(styrene) ve 15 mg/mL PS -byer-PEG. 25 (düz çizgi), (kesik çizgi) % 50 ve % 75 (karışık kesik çizgi) çekirdek yükleri için Ortalama boyutları olduğunu nm, 96 nm ve 152 nm, anılan sıraya göre. Tüm PDI değerleri 0,15 daha az olduğunu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 5: ters NPs bir CIJ mikser veya μMIVM yapılan karakterizasyonu. (A) DLS eğrileri onaylatılacak analizleri her formülasyon için Ortalama vardır. Kesikli çizgi düz çizgiyi OVA parçacıklar μMIVM yapılan boyut dağılımı ise CIJ Karıştırıcısı’nda yapılan 3 k MD parçacıkların boyutu dağılımı gösterir. (B) crosslinking gücünü DMSO eritici kullanarak DLS tarafından tespit edilebilir. DLS otokorelasyon işlevi ilk otokorelasyon değeri üzerinden crosslinking gücünü ve gözlem sıfır değerine temiz bir geçişin gösterir. Kesikli çizgi yok crosslinker ilk sinyali zayıf ve geniş çürüme zamanı gösteren bir parçacık için otokorelasyon işlevi gösteriyor. Düz çizgiyi otokorelasyon güçlü bir ilk sinyal ve tanımlanmış çürüme zaman ölçeği gösteren güçlü bir crosslinker (Bu durumda, tetraethylenepentamine), eklenmesinden sonra gösteriyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 6: Supersaturation, S, organik solvent suya göreli karışım oranları bir fonksiyonu olarak. (A)(○) boscalid, pestisit ve (■) peptid B, yedi-kalıntı modeli peptid için en yüksek ulaşılabilir supersaturation karşılaştırılması. Boscalid 230 mg/mL ve peptid B 200 mg/mL, onların doygunluk konsantrasyonu, konsantrasyon, organik akışı içeriyor. Her etkin ilaç malzeme (API) üzerinde bağlıdır en fazla bir supersaturation olduğunu / çözücü sistemi. (Boscalid organik akışı konsantrasyonu 20 azalır zamanB), hangi supersaturation ve nanoprecipitation elde koşullar sınırlı olmak. Bu rakam Elsevier9izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Adım 1 protokolünün olduğu gibi E vitamini gibi hidrofobik bileşiklerin kapsülleme yoğun olarak açıklanan9,14,28oldu. Karıştırma için zaman ölçeğini zaman ölçeği toplama ve parçacıkların büyüme için daha kısa olduğu için nispeten monodisperse partikülleri imal edilmektedir. Özellikle, karışık çözücü/antisolvent çözüm hızla çekirdekleşme aynı şekilde gerçekleşmesini sağlayan homojen, olur. O zaman blok kopolimer parçacık yüzeye montajı parçacık büyüme5durur steric istikrar sağlar. Karıştırma zamanı odası (türbülans) giriş akış oranları CIJ veya MIVM bir fonksiyonu olduğundan, çalkantılı karıştırma, geçiş sonra partikül büyüklüğü aslında sürekli13nerede oluşur bir giriş oranı vardır. Bu gibi bazı toplu iş toplu işlemi için ek sağlamlık sağlar giriş debisi (yani, şırınga depresyon hız) varyasyon tolere son NP boyutu için önemli etkisi olmadan Şekil 3görüldüğü gibi. Daha yavaş veya düzensiz giriş hızları daha büyük partiküller veya daha fazla polydisperse dağılımları, tutukluk örneğin görüldüğü gibi neden olabilir. FNP, ayrıca ters tarafından Flash NanoPrecipitation nano tanecikleri hidrofilik bileşikler kapsüllemek için uzatıldı. Bunlar nano tanecikleri can ters sonra microparticles oluşturmak ya da su dağılabilir nano tanecikleri25oluşturmak için PEG ile kaplı olması için kullanılabilir. Parçacık çekirdek crosslinking ekledi karmaşıklığı olsa temel derleme ilkeleri, değişmez. Bu parçacık bir sulu ortamda istikrar için gereklidir. İyonik etkileşimler tarafından pH ayarlama temel19, aracılığıyla teşvik genel olarak, polyacid engellemek için karşılaştırıldığında bir 1:1 ücret oranı yeterli olsa da. Bu protokol için yalnızca ilk işlem adımının ters formu NPS’ye tarif edilmiştir.

Hızlı karıştırma yanı sıra FNP veya iFNP tarafından başarılı formülasyonu bazı koşulların yerine9,14nerede olabilir örneklerine sınırlıdır. İlk olarak, tüm giriş akışı karışan olması gerekir. Emülsiyonlar NPs üretmek için kullanılan, FNP Mikser Tekdüzen çözüm aşamasında gerektirir. İkinci olarak, hızlı çekirdekleşme sürücü için çekirdek bileşeni (için CIJ, birim bir 50/50 karışımı) Mikser solvent koşullarında, yaklaşık çözünmez olmalıdır. Aksi takdirde, önemli bir bölümü unencapsulated kalacaktır veya antisolvent ile daha fazla seyreltme sonra çökelti. MIVM adres çekirdek malzeme çözünürlük sınırlamaları karıştırma odasına daha yüksek antisolvent içeriği etkinleştirebilirsiniz. Genellikle supersaturation eğrileri işlemi tasarım9rehberlik için solvent bileşimi bir fonksiyonu olarak çözünürlük verileri oluşturmak yararlıdır. Şekil 6 iki bileşikler için temsilcisi eğrileri göstermektedir. Karıştırma odası koşulları, düşük supersaturation genellikle MIVM kullanan farklı kompozisyonlar işletim yararları. Parçacık büyüme ama bir uyumsuzluk derleme zamanında çekirdek materyali üzerinden çekirdek bileşeni çekirdekleşme daha yüksek supersaturation yana ve sabitleyici tedavi, büyük toplamları neden olabilir. D’Addio ve Prud’homme uygulama detay9böyle supersaturation eğrilerinin inceledik. Son olarak, Kullanımıbcp tatlı solvent stream çözünmüş gerekir ve antisolvent akışı için bir blok seçici olması gerekir. BCP yeterince kuvvet parçacık yüzeyi ve parçacık steric istikrar vermek solvated engellemek için sabitleyici tutturmak daraltılmış bloğundan sürüş hem bir solvophobic sağlamak için amfifilik olması gerekir. Bu kısıtlamaları karşılamak sürece iletişim kuralında açıklanandan farklı çözücüler kullanılır.

Uygulama el ile şırınga işlemi ile başarı oranı tarama sırasında artırabilirsiniz. Yukarıda da belirtildiği gibi homojen, çalkantılı karıştırma koşulları geçiş yukarıda işlem akış hızı küçük değişimler içinde işlem28tolere edilir anlamına gelir. Ölçek pompası tahrik, bilgisayar kontrollü akar sonuçları daha büyük kazançlar için tutarlılık tekrarlanabilir giriş akış oranları nedeniyle içinde yukarı. Parçacıkların post-processing sırasında herhangi bir noktada, görsel muayene veya DLS analiz arızi toz ve parçacık istikrarsızlık nedeniyle olabilir büyük toplamları varlığını gösterebilir. Gerektiğinde, akış bir uygun filtre gözenek boyutu ile filtre uygulanabilir. Toplamları yokluğunda, bu daha az bulduk daha %5 kitle nominal filtre boyutu parçacık boyutu dağıtım büyükse, PEG kaplı nano tanecikleri filtreleme genellikle kaybolur. Toplamları filtre uygularken, kitle kayıp işlemi sırasında deneysel belirlenmesi gereklidir. Kütle kaybı miktar iki yoldan biriyle gerçekleştirilebilir. Toplam katı madde seviye, son verilen birime göre thermogravimetric analiz öncesi ve sonrası filtrasyon değişiklik kapsamını tanımlamak için belirlenebilir (2 Ek bilgiler bölümüne bakın). Alternatif olarak, parçacıklar ve iyi bir çözücü içinde çözünmüş kurtarılan (Örneğin, lyophilization tarafından) olabilir. Çekirdek materyali konsantrasyonu doğrudan ultraviyole görünür spectrophotometry veya Kromatografi gibi uygun bir tekniği ile ölçülebilir.

FNP için kalan 10 vol % organik çözücü (Örneğin, THF) sulu dağılım kaldırılması gerekir. Bu buharlaşma damıtma14,29, diyaliz30veya teğet akışı filtrasyon31,32tarafından yapılabilir. Her işlem adımını için pratik konuları sağlanan alıntıları açıklanmıştır. Daha büyük seçenekler kullanılabilir diyaliz için tipik membranlar 3,5 kDa veya 6-8 kDa cutoffs, vardır. Bu molekül ağırlığı kesim ne zaman 24 saat birkaç banyo değişiklikleri kullanarak diyaliz solvent kaldırma için yeterlidir. Bakım toplama membran yüzeyinde konsantrasyonu kutuplaşma nedeniyle inducing önlemek için alınması gereken gibi teğet akışı filtrasyon kullanımı bazı süreç geliştirme üzerine kuruludur. Bulduğumuz organik çözücü kompozisyon vol % 2-10 genellikle, bir sistem bağımlı değerinin altında azaltılması toplama membran yüzeyinde ortadan kaldırır. İşlemden sonra nano tanecikleri konsantrasyonu kolayca thermogravimetric analizi ile belirlenir (2 Ek bilgiler bölümüne bakın). Bu kez taşıma veya parçacıkların son derece kararlı bir formda depolamak için arzu edilir. Sulu dağıtıcılar sadece hızla kuru buz/aseton karışımı kullanarak ve sonra-80 ° C’de depolanan donmuş olabilir Alternatif olarak, kuru tozları lyophilization33,34 tarafından elde edilebilir ya da kurutma24sprey. Sık sık, bir cryoprotectant dondurma ya da kurutma sırasında nanopartikül toplama azaltmak için eklenmesi gerekir. Şeker (sükroz, trehalose, vb), poly(ethylene glycol) veya cyclodextrins etkinliği için konsantrasyonlarda bir dizi üzerinde DLS35,36,37tarafındanboyutu izleyerek ekranlı, 38. Ortak NP istikrar sorunları işleme sırasında kez düzenlenmesi nerede hareketliliği artar daha düşük bir enerji durumuna koşullar altında doğru sonuçlanan çekirdek çözünürlük veya faz ayrılmaya ilgilidir. Ortak çekirdek malzemeleri, alternatif Stabilizatörler veya değiştirilmiş Harici çözüm kompozisyon istikrar14,16,17,39,40iyileştirmeye yardımcı olabilir, 41.

Yukarıda da belirtildiği gibi MIVM yüksek supersaturation elde için gerektiğinde karıştırma odası daha yüksek antisolvent içeriği sağlar. Reaktivite veya çözünürlük kısıtlamaları talep ne zaman o da ikiden fazla akarsu içine türlerin segregasyon fiziksel için izin veririm. Zein nano tanecikleri protein stabilize antibiyotik clofazimine24oluşumu bir örnektir. Hidrofobik clofazimine bir aseton akışı tanıştırdı; Zein % 60 ethanolic sulu akışında giriliyor; Kazein, hangi kompleksleri ile zein, bir sulu tampon akışı ile getirilir ve aseton ve etanol için su oranını artırmak için ek arabellek dördüncü akışıdır. Clofazimine ve zein ortak bir çözücü içinde çözünür olmadığından iki çözelti akarsu gereklidir. Bu işlem bir iki-jet CIJ karıştırıcı başarılı değil. Bu protein stabilize formülasyonu Ayrıca FNP için BCP stabilizatörleri sınırlı değildir gösterir. Janus parçacıklar sabitleyici42 üretilen ve bir dizi düşük maliyetli stabilizatörleri sözlü uygulamaları24için gösterdi. Özellikle, HİDROKSİPROPIL methylcellulose gibi kopolimerler blok kopolimerler24yerine kullanılabilir. Çekirdek malzeme teknikleri bir dizi tarafından daha hidrofobik yapılabilir. Hidrofobik iyon eşleştirme orta çözünürlük43,44,45sahip bileşikler geniş bir kapsüllemek için uygulanmıştır. Son derece hidrofobik prodrugs-si olmak be oluşturulan ve46kapsüllenir. Nükleik asitler complexation katyonik lipidler47ile kapsüllü. Önemlisi, bu çalışmalar FNP parçacık yüzey kimyaları bir dizi üretmek göstermiştir. Ayrıca, karışık stabilizatörleri ile zincir ucunda hedefleme bir ligand olarak BCP bir kısmını içeren kullanılmıştır. Parçacık kompozisyon giriş akışı kompozisyon23,48yansıtan bu yana bu yüzeyi ligand içerik üzerinde tam denetim sağlar. Benzer şekilde, bu boyalar ve inorganik nano tanecikleri3,8de dahil olmak üzere birden çok çekirdek bileşenleri de, dahil etmek mümkündür.

Flash NanoPrecipitation polimer nano tanecikleri bir hidrofobik veya hidrofilik bir çekirdek oluşan ölçeklenebilir bir yaklaşımdır. Yukarıda sayılan şartlar yerine gelirse, genellikle üzerinde çekirdek materyali % 95’i yüksek kitle kısmını parçacık kapsüllenir. Burada sunulan üç örnek birkaç miligram malzeme ve yaklaşık 0.5 mL her giriş akışı gerektiren tezgah ölçekte gerçekleştirilmiştir. Bu parçacık koşulları formülasyonu optimizasyonu için hızlı tarama sağlar. Ölçek-up kurşun formülasyonları büyük toplu iş boyutu için hazır şırınga pompaları veya akış kontrolcüler kullanılarak gerçekleştirilebilir süreci daha uzun, çalışan bir mesele. Buna karşılık, toplu ek nanoprecipitation ölçek-up ek noktasında yeterli micromixing bakımı ve gemi geometrisi49değiştirme etkisini için muhasebe iyi belgelenmiş sorunlar karşı karşıya. Parçacıklar FDA gereksinimleri50karşılamak için tutarlı bir şekilde üretmek için çok önemli olduğundan, bu önemli bir engeldir. Havacilik teknikleri de üniforma, tekrarlanabilir nano tanecikleri üretmek ama sadece üretim miligram aralıktaki etkinleştirmek. Örneğin, Karnik vd. üretim oranları 0.25 mg/dk bir uyuşturucu serbest bırakılması için51çalışma bildirdi. Daha fazla ölçek-up genellikle yüksek Capital12mal parallelization üzerine kuruludur. FNP ile bir şırınga pompa ve mikser girişleri bağlamak için birkaç bağlantı parçaları ile nano tanecikleri 600 mg/dk 1 gram üretmek basittir. Sonuç olarak, FNP hem bir erişilebilir laboratuvar ölçekli tarama aracı hem de NP üretime translasyonel iş için ölçeklendirilebilir bir yaklaşım temsil eder.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser Optimeos yaşam bilimleri, National Science Foundation (CBET 1605816), Bill ve Melinda Gates Vakfı (BMGF, OPP1150755) ve Ulusal Bilim Vakfı lisansüstü araştırma verilen Bursu (DGE-1656466) fon tarafından desteklenmiştir K.D.R.

Materials

Confined Impinging Jets Mixer NA NA See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation
Luer fitting Idex Health & Science P-604 Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads
Plug fitting Idex Health & Science P-309 Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling)
Outlet fitting – CIJ Idex Health & Science P-205 Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet
Outlet ferrule – CIJ Idex Health & Science P-200 Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing)
Outlet tubing – CIJ Idex Health & Science 1517 Use tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn't protrodue into mixing chamber
Tetrahydrofuran (THF) Fisher Scientific T425-4 Use stabilizer-free THF to avoid solubility limits of BHT. Peroxides may interfere in some applications.
Norm-ject syringe (3 ml) VWR 53548-017
Vitamin E (α-tocopherol) Sigma-Aldrich 90669-50G-F Store cold
poly(styrene-b-ethylene glycol), PS1.6k-b-PEG5k Polymer Source P13141-SEO Other block sizes acceptable depending on application
poly(styrene)1.8k Polymer Source P2275-S Example hydrophobic core material
Scintillation vial DWK Lifesciences 74504-20
Luer-slip plastic syringes, 1ml (100 pk) National S7510-1
Maltodextrin DE 4-7 Sigma-Aldrich 419672-100G
poly(styrene-b-acrylic acid), PS5k-b-PAA4.8k Polymer Source P5917-SAA Other block sizes acceptable depending on application
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D159-4
Calcium chloride dihdyrate Sigma-Aldrich 223506-25G Hygroscopic.
Methanol Fisher Scientific A452-4
Ammonium Hydroxide Fisher Scientific AC423300250
Albumin from chicken egg white (Ovalbumin, OVA) Sigma-Aldrich A5503-1G
Multi-Inlet Vortex Mixer NA NA See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation
Outlet fitting – MIVM Idex Health & Science P-942 Combination with ferrule
Outlet tubing – MIVM NA NA Fit to ferrule ID.
O-ring (MIVM) C.E. Conover MM1.5 35.50 V75 Order bulk – consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source.
Mixer stand NA NA See Markwalter & Prud'homme for design.17
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bobo, D., Robinson, K. J., Islam, J., Thurecht, K. J., Corrie, S. R. Nanoparticle-Based Medicines: A Review of FDA-Approved Materials and Clinical Trials to Date. Pharmaceutical Research. 33 (10), 2373-2387 (2016).
  2. D’Mello, S. R., et al. The evolving landscape of drug products containing nanomaterials in the United States. Nature Nanotechnology. 12 (6), 523-529 (2017).
  3. Gindy, M. E., Prud’homme, R. K. Multifunctional nanoparticles for imaging, delivery and targeting in cancer therapy. Expert Opinion on Drug Delivery. 6 (8), 865-878 (2009).
  4. Chen, G., Roy, I., Yang, C., Prasad, P. N. Nanochemistry and Nanomedicine for Nanoparticle-based Diagnostics and Therapy. Chemical Reviews. 116 (5), 2826-2885 (2016).
  5. Johnson, B. K., Prud’homme, R. K. Mechanism for Rapid Self-Assembly of Block Copolymer Nanoparticles. Physical Review Letters. 91 (11), 118302-118302 (2003).
  6. Schubert, S., Delaney, J. J. T., Schubert, U. S. Nanoprecipitation and nanoformulation of polymers: from history to powerful possibilities beyond poly(lactic acid). Soft Matter. 7 (5), 1581-1588 (2011).
  7. Lebouille, J. G. J. L., Stepanyan, R., Slot, J. J. M., Cohen Stuart, M. A., Tuinier, R. Nanoprecipitation of polymers in a bad solvent. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. , 225-235 (2013).
  8. Akbulut, M., et al. Generic method of preparing multifunctional fluorescent nanoparticles using flash nanoPrecipitation. Advanced Functional Materials. 19 (5), 718-725 (2009).
  9. D’Addio, S. M., Prud’homme, R. K. Controlling drug nanoparticle formation by rapid precipitation. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (6), 417-426 (2011).
  10. Pagels, R. F., Edelstein, J., Tang, C., Prud’homme, R. K. Controlling and Predicting Nanoparticle Formation by Block Copolymer Directed Rapid Precipitations. Nano Letters. 18 (2), 1139-1144 (2018).
  11. Ding, S., Anton, N., Vandamme, T. F., Serra, C. A. Microfluidic nanoprecipitation systems for preparing pure drug or polymeric drug loaded nanoparticles: an overview. Expert Opinion on Drug Delivery. 13 (10), 1447-1460 (2016).
  12. Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles. Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).
  13. Johnson, B. K., Prud’homme, R. K. Chemical processing and micromixing in confined impinging jets. AIChE Journal. 49 (9), 2264-2282 (2003).
  14. Saad, W. S., Prud’homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
  15. Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
  16. Kumar, V., Wang, L., Riebe, M., Tung, H. H., Prud’homme, R. K. Formulation and stability of itraconazole and odanacatib nanoparticles: Governing physical parameters. Molecular Pharmaceutics. 6 (4), 1118-1124 (2009).
  17. Liu, Y., Kathan, K., Saad, W., Prud’homme, R. K. Ostwald Ripening of β -Carotene Nanoparticles. Physical Review Letters. 98 (3), 036102-036102 (2007).
  18. Liu, Y., Cheng, C., Liu, Y., Prud’homme, R. K., Fox, R. O. Mixing in a multi-inlet vortex mixer (MIVM) for flash nano-precipitation. Chemical Engineering Science. 63, 2829-2842 (2008).
  19. Pagels, R. F., Prud’homme, R. K. Polymeric nanoparticles and microparticles for the delivery of peptides, biologics, and soluble therapeutics. Journal of Controlled Release. 219, 519-535 (2015).
  20. Pagels, R. F., Prud'homme, R. K. Ch. 11. Control of Amphiphile Self-Assembling at the Molecular Level: Supra-Molecular Assemblies with Tuned Physicochemical Properties for Delivery Applications Vol. 1271 ACS Symposium Series. , 249-274 (2017).
  21. Markwalter, C. E., Prud’homme, R. K. Ch. 12. Control of Amphiphile Self-Assembling at the Molecular Level: Supra-Molecular Assemblies with Tuned Physicochemical Properties for Delivery Applications Vol. 1271 ACS Symposium Series. , 275-296 (2017).
  22. Markwalter, C. E., Prud’homme, R. K. Design of a Small-Scale Multi-Inlet Vortex Mixer for Scalable Nanoparticle Production and Application to the Encapsulation of Biologics by Inverse Flash NanoPrecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 107 (9), 2465-2471 (2018).
  23. Gindy, M. E., Ji, S., Hoye, T. R., Panagiotopoulos, A. Z., Prud’Homme, R. K. Preparation of poly(ethylene glycol) protected nanoparticles with variable bioconjugate ligand density. Biomacromolecules. 9 (10), 2705-2711 (2008).
  24. Zhang, Y., et al. Design and Solidification of Fast-Releasing Clofazimine Nanoparticles for Treatment of Cryptosporidiosis. Molecular Pharmaceutics. 14 (10), 3480-3488 (2017).
  25. Pagels, R. F. . Polymeric Nanoparticles and Microparticles for the Delivery of Hydrophobic and Hydrophilic Therapeutics. , (2018).
  26. Frisken, B. J. Revisiting the method of cumulants for the analysis of dynamic light-scattering data. Applied Optics. 40 (24), 4087-4091 (2001).
  27. Budijono, S. J., Russ, B., Saad, W., Adamson, D. H., Prud’homme, R. K. Block copolymer surface coverage on nanoparticles. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 360 (1-3), 105-110 (2010).
  28. Johnson, B. K., Prud’homme, R. K. Flash NanoPrecipitation of Organic Actives and Block Copolymers using a Confined Impinging Jets Mixer. Australia Journal of Chemistry. 56, 1021-1024 (2003).
  29. Kumar, V., Prud’homme, R. K. Nanoparticle stability: Processing pathways for solvent removal. Chemical Engineering Science. 64 (6), 1358-1361 (2009).
  30. Shi, L., Shan, J., Ju, Y., Aikens, P., Prud’homme, R. K. Nanoparticles as delivery vehicles for sunscreen agents. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. , 122-129 (2012).
  31. Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. Comparison of Diafiltration and Tangential Flow Filtration for Purification of Nanoparticle Suspensions. Pharmaceutical Research. 22 (12), 2152-2162 (2005).
  32. Pansare, V. J., Tien, D., Thoniyot, P., Prud’homme, R. K. Ultrafiltration of nanoparticle colloids. Journal of Membrane Science. 538, 41-49 (2017).
  33. D’Addio, S. M., et al. Novel Method for Concentrating and Drying Polymeric Nanoparticles: Hydrogen Bonding Coacervate Precipitation. Molecular Pharmaceutics. 7 (2), 557-564 (2010).
  34. Abdelwahed, W., Degobert, G., Stainmesse, S., Fessi, H. Freeze-drying of nanoparticles: Formulation, process and storage considerations. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1688-1713 (2006).
  35. Correa, S., et al. Highly Scalable, Closed-Loop Synthesis of Drug-Loaded, Layer-by-Layer Nanoparticles. Advanced Functional Materials. 26 (7), 991-1003 (2016).
  36. Figueroa, C. . Engineering Nanoparticles for Pharmaceutical Applications: Formulation and Freeze-drying Techniques. , (2014).
  37. Harada, A., Li, J., Kamachi, M. Preparation and properties of inclusion complexes of polyethylene glycol with alpha-cyclodextrin. Macromolecules. 26 (21), 5698-5703 (1993).
  38. Troiano, G., Song, Y. -. H., Zale, S., Wright, J., Van Geen Hoven, C. Stable Formulations for Lyophilizing Therapeutic Particles. United States patent. , (2013).
  39. Kumar, V., Adamson, D. H., Prud’homme, R. K. Fluorescent polymeric nanoparticles: Aggregation and phase behavior of pyrene and amphotericin B molecules in nanoparticle cores. Small. 6 (24), 2907-2914 (2010).
  40. Budijono, S. J., et al. Synthesis of stable block-copolymer-protected NaYF4:Yb3+, Er3+up-converting phosphor nanoparticles. Chemistry of Materials. 22 (2), 311-318 (2010).
  41. Chen, T., et al. Protected peptide nanoparticles: Experiments and brownian dynamics simulations of the energetics of assembly. Nano Letters. 9 (6), 2218-2222 (2009).
  42. Sosa, C., et al. Soft Multifaced and Patchy Colloids by Constrained Volume Self-Assembly. Macromolecules. 49 (9), 3580-3585 (2016).
  43. Pinkerton, N. M., et al. Formation of stable nanocarriers by in situ ion pairing during block-copolymer-directed rapid precipitation. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 319-328 (2013).
  44. Lu, H. D., Rummaneethorn, P., Ristroph, K. D., Prud’homme, R. K. Hydrophobic Ion Pairing of Peptide Antibiotics for Processing into Controlled Release Nanocarrier Formulations. Molecular Pharmaceutics. 15 (1), 216-225 (2018).
  45. Lu, H. D., et al. Encapsulation of OZ439 into Nanoparticles for Supersaturated Drug Release in Oral Malaria Therapy. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 970-979 (2018).
  46. Ansell, S. M., et al. Modulating the Therapeutic Activity of Nanoparticle Delivered Paclitaxel by Manipulating the Hydrophobicity of Prodrug Conjugates. Journal of Medicinal Chemistry. 51 (11), 3288-3296 (2008).
  47. Gindy, M. E., et al. Mechanism of macromolecular structure evolution in self-assembled lipid nanoparticles for siRNA delivery. Langmuir. 30 (16), 4613-4622 (2014).
  48. D’Addio, S. M., et al. Optimization of cell receptor-specific targeting through multivalent surface decoration of polymeric nanocarriers. Journal of Controlled Release. 168 (1), 41-49 (2013).
  49. . . Perry’s Chemical Engineers’ Handbook. , 19-20 (2007).
  50. Torrice, M. Does nanomedicine have a delivery problem?. ACS Central Science. 2 (7), 434-437 (2016).
  51. Karnik, R., et al. Microfluidic Platform for Controlled Synthesis of Polymeric Nanoparticles. Nano Letters. 8 (9), 2906-2912 (2008).

Tags

Flash NanoprecipitationIFNPInverse Flash NanoprecipitationPolymeric NanoparticlesHydrophobic CompoundsHydrophilic CompoundsCIJ MixerSyringe PumpsAnti-solventQuench BathVitamin EBlock Copolymer Stabilizer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Markwalter, C. E., Pagels, R. F., Wilson, B. K., Ristroph, K. D., Prud’homme, R. K. Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles. J. Vis. Exp. (143), e58757, doi:10.3791/58757 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image