À l’aide d’Ustilago maydis comme un cheval de Troie pour la livraison de la protéine maïs In Situ
Summary
Cet ouvrage décrit le clonage d’une souche de cheval de Troie Ustilago maydis pour la prestation in situe des protéines sécrétées de maïs en trois différents types de tissus de maïs.
Abstract
Inspiré par le mythe de cheval Troie Homer´s, nous avons conçu le pathogène maïs Ustilago maydis pour fournir des protéines sécrétées dans l’apoplaste maïs permettant une analyse phénotypique in vivo. Cette méthode ne s’appuie pas sur la transformation de maïs, mais exploite la génétique microbienne et des capacités sécrétoires des agents pathogènes. Il permet aux présentes, inspection in vivo livré des protéines sécrétées à haute résolution spatio-temporelle à différents types de tissus et de sites d’infection. La stratégie du cheval de Troie peut être utilisée en complément transitoirement maïs phénotypes de perte de fonction, afin de caractériser sur le plan fonctionnel des domaines protéiques, pour analyser les effets de la protéine hors cible, ou d’étudier un surdosage onside protéine, ce qui en fait un outil puissant études de protéine dans le système de récolte de maïs. Cet ouvrage contient un protocole précis sur la façon de générer une souche de cheval de Troie suivie de protocoles normalisés de l’infection à appliquer cette méthode à trois types de différents tissus de maïs.
Introduction
Le pathogène biotrophe Ustilago maydis est l’agent causal du maïs charbon maladie1. Il infecte tous les parties aériennes de maïs ayant pour résultat les grosses tumeurs qui renferment des spores mélanisées, noir. Au niveau mondial, U. maydis est estime susceptible de causer une perte annuelle d’environ 2 % du rendement du maïs, tandis que les tumeurs sont appréciés comme un délice gastronomique au Mexique. Infection des plantes est initiée par un appressorium qui sécrète des enzymes lyse de la paroi cellulaire pour pénétrer dans la première couche de cellules épidermiques de maïs. Partir d’un site d’infection primaire, U. maydis se développe dans les cellules et entre les cellules, envahir les cellules d’une à deux couches chaque jour1,2. Résultats infection réussie dans l’hypertrophie de plante qui se transforme en tumeurs visibles sur cinq jours après l’infection1,3,4. Durant tous les stades de l’infection, les hyphes fongiques invaginent la membrane de cytoplasme de plante sans aucun contact direct au cytoplasme hôte1,2. L’espace apoplasme serré entre les hyphes infectant et la membrane plasmique de la plante est réputé être le site interactif de l’hôte/pathogène, appelé la zone d’interaction biotrophe. Afin de surmonter le système immunitaire inné de plante, U. maydis sécrète un tableau des protéines effectrices dans biotrophe interaction zone1. Certains effecteurs sont absorbés par les cellules végétales, tandis que d’autres restent dans l’interaction biotrophe zone5,6,7,8. Un effecteur apoplastique est UmPit2, qui interagit avec des protéases apoplastique maïs pour éviter la sortie de la signalisation du peptide ZmZIP1 de ZmPROZIP par apoplastique protéase activité9,10.
Au cours des dernières décennies, U. maydis est devenu non seulement un modèle pour la génétique des champignons dans l’interaction plante-pathogène, mais aussi un outil précieux en matière de biotechnologie en raison d’un cycle de vie bien compris, facilité d’accès génétique et expression hétérologue de sécrétée protéines11,12,13. Signaux pour la sécrétion de ces deux protéines conventionnelles et non conventionnelles ont été déterminées en permettant le contrôle des modifications post-traductionnelles14. Récemment, U. maydis a été employée comme un outil de cheval de Troie pour étudier petit, sécrétée protéines de maïs en situ15. L’approche d’un cheval de Troie a été utilisé avec succès pour analyser la fonction de la protéine de petite, sécrétée ZmMAC1 qui est impliqué dans le développement de l’anthère. ZmMAC1 induit la division Péricline de cellules pluripotentes et la spécification des cellules nouvellement formé15sort des cellules. Selon la même méthode, la fonction biologique du peptide associés aux dommages maïs ZmZIP1 a été révélée. U. maydis sécrétant le maïs que zmzip1 entraîné avec facultés affaiblies tumeur formation10. Ainsi, le cheval de Troie approche représente un itinéraire alternatif précieux à la protéine de situ études à haute résolution spatio-temporelle qui ne fait ni exiger génération de lignes de transformation de maïs stable ni infiltration des tissus avec façon hétérologue protéines exprimées et purifiées. En particulier, la stratégie du cheval de Troie permet la sécrétion d’une protéine hétérologue dans l’apoplaste maïs et une comparaison directe des infectés contre les cellules végétales non infectés dans le même tissu.
Ce protocole illustre les principales étapes pour générer une souche de cheval de Troie d’u. maydis afin d’étudier une protéine d’intérêt. Il comprend également des informations précises sur les procédures de l’infection de trois types de différents tissus de maïs (les feuilles adultes, les glands et les oreilles) avec U. maydis, qui est une condition sine qua non pour l’étude de la fonction spatio-temporelle de l’infection de progression et de protéines dans ces tissus de cible. Aucune précisions ne sont donnée sur maïs amplification génique et microscopiques imaging techniques, étant donné que ces étapes sont spécifiques à la cible et instrument-dépendante. Ainsi, le présent protocole s’adresse aux utilisateurs expérimentés des techniques standard de biologie moléculaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Recherche sur les cultures modernes exige des protocoles pour l’analyse moléculaire sur la génétique et des niveaux de protéine. L’accessibilité génétique par transformation n’est pas disponible ou inefficaces et fastidieuse pour la plupart des espèces de cultures telles que le maïs. En outre, des outils génétiques fiables tels que les systèmes de journaliste promoteur sont rares, ce qui rend difficile d’étudier la fonction des protéines in situ avec une haute résolution spatio-temporelle …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimeraient remercier Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella et Armin Hildebrand pour la fourniture de matériel de laboratoire espace et. Le œuvre originale sur la méthode de cheval de Troie était soutenue par une bourse post-doc de Leopoldina et projet NSF IOS13-39229. Le travail présenté dans cet article a été soutenu par SFB924 (projets A14 et B14) de la DFG.
Materials
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 x 4 x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1–mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
References
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).
- Matei, A., et al. How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves. New Phytologist. , (2018).
- Doehlemann, G., et al. Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis. The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).
- Doehlemann, G., et al. Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells. PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).
- Redkar, A., et al. A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors. The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).
- Djamei, A., et al. Metabolic priming by a secreted fungal effector. Nature. 478, 395-398 (2011).
- Tanaka, S., et al. A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize. eLife. 3, e01355 (2014).
- Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2. PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).
- Ziemann, S., et al. An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize. Nature Plants. 4, 172-180 (2018).
- Juárez-Montiel, M., et al. The corn smut (‘Huitlacoche’) as a new platform for oral vaccines. PLoS One. 10, e0133535 (2015).
- Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K., Schmoll, M., Dattenböck, C. . Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 183-200 (2016).
- Monreal-Escalante, E., et al. The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse. Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- van der Linde, K., et al. Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ. The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).
- Bösch, K., et al. Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).
- Chavan, S., Smith, S. M. A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines. Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).
- Kelliher, T., Walbot, V. Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule. Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).
- Egger, R. L., Walbot, V. Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies. Maydica. 60, M34 (2015).
- Holliday, R., King, R. C. . Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. , 575-595 (1974).
- Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation. Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).
- Banuett, F., Herskowitz, I. Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).
- Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1. The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).
