ナノ粒子追跡によるひと血中の細胞小胞単一の急速な蛍光特性評価

デュッセルドルフ大学の機関の倫理委員会が本作で示した実験を承認 (参照数: 3381)。 1. EV ひと全血から分離 エキソソーム降水量ソリューションで Ev を分離します。 静脈穿刺による血清分離管 (SST) のひと全血の 2 mL を収集し、凝固が完了するまでに 15 分間室温 (RT) のチューブを孵化させなさい。 血清から細胞を分離し、血清 1 mL を反作用の管を 1.5 mL に転送する RT で 10 分の 1,700 x gで SST を遠心します。多血小板血漿 (PRP) を血小板を削除し、血小板貧しい血しょう (PPP) の 100 μ L を新しい 1.5 mL の反応管に転送 4 ° C で 15 分間 3,000 × gで遠心分離機します。 エキソソーム降水量ソリューション (4 部 PPP、1 パーツ エキソソーム降水量ソリューション) と渦の 25 μ L を徹底的に追加します。氷の上で 30 分間サンプルをインキュベートします。チューブを直立した保つと回転か潜伏期間中にチューブをミックスします。 EVs のペレットへの 4 ° C で 30 分間 1,500 × gのサンプルを遠心します。遠心分離後、EVs は、容器の底にベージュや白いペレットとして表示されます。上清を吸引し、1,500 × g 4 ° C で 5 分間のサンプルを遠心分離 流体のすべてのトレースを削除し、再上下によくピペッティングによるリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 100 μ L でペレットを中断します。分析をすぐに実行しない-80 ° C で EV サスペンションを格納します。注: プラズマから EVs を隔離するときフィブリノゲン、フィブリン妨げることができる効率的な回復と巻き上がりは重く、時間がかかります。 超遠心法で EVs を分離します。 冷蔵庫やクールなダウンの使用前に遠心から予冷ローター (TLA 55 固定角度) を取る。 キャップに適した 1.5 mL 遠心チューブに 1.25 mL (1.1 の手順で準備) PPP を転送し、4 ° C で 90 分 110,000 x gでサンプルを遠心分離開始する前にローター負荷バランスがとれていることを確認します。 上清をデカントと場所管逆さま 2 分のペーパー タオルの上 500 μ L の PBS でペレットを再停止や、90 分の 4 ° C で 110,000 x gでサンプルを遠心 上清を吸引し、50 μ L の PBS でペレットを再停止します。注: は、ローターと超遠心機、使用するために設計されたアクセサリーのみを使用します。回転子の管は、ロット間の管の強度が異なるために、水を使用して事前にテストします。 2. サンプルの染色 PKH67 試料を染色します。 50 μ L の希釈 C (キットに付属) を PKH67 エタノール色素溶液の 1 μ L の追加によっての染色液を 1.5 mL の反応管とミックスで徹底的に準備します。 染色液の 10 μ L を反応管に EV 停止 (1.1 の手順で準備) の 20 μ L に転送、混和、暗闇の中で室温で 5 分間インキュベートします。 15 mL の反応管内の水を 2.5 mL の蒸留水でステンド グラスの EV の懸濁液 50 μ L を希釈、徹底的に、ミックス、粒子計測のこの最終的な懸濁液を使用します。注: それは他の希釈剤 (例えばPBS) 測定を損なうことができるので EV サスペンションの希釈剤として水を使用する重要です。EV 懸濁液を保存を使用して、氷のサンプルを解凍し、染色する前に徹底的に混ぜます。 特定の抗体のサンプルを染色します。 徹底的に 50 μ L の純水 1.5 mL の反応管とミックスの EV 懸濁液 (1.1 の手順で準備) の 10-20 μ L を希釈します。 反応管に特異的抗体 (表 1) の 2.5 5 μ L を追加、徹底的に、ミックス、暗闇の中で室温で 30 分間インキュベートします。 2.5-10 mL の反作用の管を 15 mL の蒸留水 (表 1) にステンド グラスの EV 懸濁液 50 μ L を転送、徹底的に、ミックス、粒子計測用のこの最終的な懸濁液を使用します。注: いくつかの状況下で使用される抗体の集中する必要があります (表 1) を調整します。 3. サンプルの処理 注: このメソッドの基本広く記述されていた以前とプロトコル焦点を当てて下蛍光標識 EVs14の分析に必要な具体的な手順。 スタートアップ プロシージャを実行します。 蛍光フィルターを顕微鏡とカメラの光路に押し込みます。プログラムを起動し、自動実装の画面の指示に従います。 蛍光測定用「細胞チェック」のタブ (セル定義) で正しい携帯番号 (Z158_C1149_Fluor) を選択します。光学顕微鏡とレーザでは、共通のフォーカス (レーザー、顕微鏡をこの位置に自動的に移動) を確認するための参照位置を選択します。 蒸留水 10 ml 注射器でセルのチャネルをフラッシュします。測定セルを気泡の自由ことを確認し、システムに空気の泡を挿入しません。 粒子を含む均一 200 nm サイズの蛍光標識されたポリスチレン表面にカルボキシル基を持つ校正の懸濁液を準備します。990 μ の粒子の希薄の 10 μ L の蒸留水。必要な濃度を取得する蒸留水 10 mL で 15 mL チューブにこの粉液の 10 μ L を希釈しています。 セルのチャネルで希釈された粒子溶液 2.5 mL を注入し、「フォーカスを最適化する」をクリックして、カメラを調整します。 サンプルを測定します。 各試料の測定前に蒸留水 10 ml 注射器で複数回のセルのチャネルをフラッシュします。セルのチャネルにステンド グラスの EV の懸濁液 (ステップ 2 で作成) を挿入します。 必要な (表 2)、ソフトウェアの「セル チェック」タブで以下の主なカメラ パラメーターを調整します。基準位置を使用するか、パラメーターを調整する 0.41193 を配置します。 感度、最適な感度の範囲を見つける「粒子対感度の番号」ボタンをクリックして各画面別の感度レベルの測定粒子曲線を表示します。メモ: シャッターは、カメラが断固としたな間隔を通過する光を可能にする時間の期間を調整します。 買収後パラメーター選択 20、20 の最小サイズの最小の明るさ nm、および 500 の最大サイズ測定の nm。 ディスプレイからの視野でカウント検出されたパーティクルの数に注意してください。散乱バーは、オレンジ色の範囲 (50-300 粒) に緑でなければなりません。散乱のバーが赤の場合、散布図は個々 の粒子を融合し、彼らが偽の結果につながる 1 つの単一粒子としてカウントされます。このような場合は、さらに粒子の重複を避けるためにサンプルの希釈や感度を下げます。 測定を開始する前に「セル チェック」タブで「0 V で粒子ドリフトをチェックする」をクリックしてします。ドリフトが 5 μ m/s 以上の場合、サンプル測定を続行するフローが停止するまで待ちます。注: 測定の始めでドリフトが大きすぎる場合繰り返し測定できます異なるし、結果を高度化します。NTA の原則により関連するドリフトは、ソフトウェアによって計算された、断固とした粒径に影響を与えるをかもしれません。 「計測」タブで「ビデオ集録の実行」をクリックしては、実験 (3-5) の数とそれら (0 分) 間の遅延時間を選択します。 (個々 の subvolume-) (11) の位置の数と粒子を分析し、各測定位置でサイクル (測定) (10) の数を定義します。 フォルダーを選択、新しいファイル名を作成し、測定を開始する”OK”をクリックします。 4. 結果の解釈 「分析」タブで測定後結果とパラメーターを表示します。セルのチャネルをクリーニングする前に解析した後次のパラメーターをチェック: 位置、トレースされた粒子および粒子濃度、粒子 (x10、x50、x90 値) の分布幅の合計数あたり粒子の数の平均値の値平均と標準偏差。必要な場合は、サンプルの測定を繰り返します。注: 結果も .pdf ファイルまたは .txt ファイルとして保存されます。 サイズにより検出された粒子の分布を示します測定後計算グラフを表示する”分析] タブをクリックします。「分析」タブの「表示」をクリックして、アイコン使用調整し、特定の要件のグラフの設定を変更します。 5. 西部にしみが付くことによって検出を介してEV 検証 RIPA 溶解し抽出バッファーで EV ペレット (ステップ 1 で作成) を解散、徹底的にピペットし、ライセートを明確にし、上清を新しいチューブに転送する氷上で 30 分間 4 ° C で 10 分間遠心する 8,000 の x gでサンプル間加温します。 Lowry 蛋白質の試金キット総蛋白を測定します。RIPA バッファーの 49 μ L の分離 EV 懸濁液 1 μ L を希釈し、トリプリケートで 5 μ L を使用して、分析のため。EV 懸濁液 2 μ g/μ L と 95 ° C で 10 分間の熱の最終濃度 2 x Laemmli 読み込みバッファーを希釈します。 ウェルあたり蛋白質の 20 μ g をロードします。分離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動とタンクの標準的なプロトコルによるとしみが付くことによって蛋白質を転送します。 常温 1 時間牛のミルク パウダー (5%) を膜 (0.2 μ m ポリフッ化ビニリデン二フッ化) をブロックし、4 ° C で一晩特定の一次抗体 (CD9 や CD63、ビメンチン) と膜をインキュベート注: 一次抗体は、縮尺の希釈に使用されます。 Tbst 膜を洗浄する 3 × 5 分西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) の膜をインキュベートし、-共役二次抗体 (1:20, 000 TBST) 室温 60 分 Tbst 膜を洗浄する 3 × 5 分と化学発光イメージング システムの感度が高い基板ソリューションによって蛋白質を検出します。注: CD63 抗原は広範囲で、必ずグリコ、分子量は異なるが、40-65 kDa 間バンドを表示できるので。