אפיון מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית מהירה של יחיד חוץ-תאית שלפוחית בדם אנושי עם ניתוח מעקב ננו-חלקיק

המנהלים אתית מוסדית של האוניברסיטה של דיסלדורף אישר את הניסויים שהוצגו בעבודה זו (מספר אסמכתא: 3381). 1. EV בידוד של דם אנושי לבודד EVs exosome משקעים פתרון. לאסוף 2 מ”ל של דם אנושי שלם בסרום-הפרדת צינורות (SST) באמצעות venipuncture, דגירה הצינור למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) עד לסיום קרישת הדם. Centrifuge את SST ב x 1,700 g 10 דקות ב RT בתאים נפרדים מסרום ולהעביר 1 מ”ל של הנסיוב ל צינור התגובה 1.5 mL. Centrifuge טסיות דם עשיר פלזמה (PRP) ב x 3000 g למשך 15 דקות ב 4 ° C להסיר טסיות ולהעביר μL 100 של פלזמה טסיות-עני (PPP) ל צינור 1.5 mL התגובה. להוסיף 25 µL של פתרון משקעים exosome (PPP לארבעה חלקים, חלק 1 exosome משקעים פתרון), מערבולת ביסודיות. דגירה המדגם במשך 30 דקות על קרח. לשמור את הצינור זקוף ולא לסובב או לערבב את הצינור במהלך תקופת הדגירה. Centrifuge הדגימה ב x 1,500 g למשך 30 דקות ב- 4 ° C עד גלולה של EVs. לאחר צנטריפוגה, EVs מופיעים גלולה בז או לבן בתחתית הכלי. וארוקן את תגובת שיקוע, centrifuge את הדגימה ב x 1,500 g למשך 5 דקות ב 4 º C. להסיר כל עקבות של נוזל, מחדש להשעות את צניפה ב 100 µL של באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) מאת לעתים קרובות pipetting למעלה ולמטה. לאחסן את המתלים EV ב-80 מעלות צלזיוס כאשר ניתוח לא מבוצע באופן מיידי.הערה: כאשר בידוד EVs מ פלזמה, פיברינוגן, פיברין לטרפד שחזור יעיל, resuspension כבד ולוקח יותר זמן. לבודד EVs עם ultracentrifugation. קח הרוטור טרום מקורר (TLA-55 קבוע-זוויתי) מקרר, תרגע ultracentrifuge לפני השימוש. 1.25 מ של PPP (להכין בשלב 1.1) להעביר צינור ultracentrifugation מתאימים 1.5 מ עם מכסה, centrifuge את הדגימה ב x 110,000 g למשך 90 דקות ב 4 º C. ודא כי המטען רוטור מאוזן לפני שמתחילים. Decant את תגובת שיקוע ואת המקום צינור הפוך על מגבת נייר עבור 2 דק מחדש להשעות את צניפה ב μL 500 ל- PBS centrifuge הדגימה ב 110,000 x g למשך 90 דקות ב 4 º C. וארוקן את תגובת שיקוע, מחדש להשעות את צניפה ב- 50 μL ל- PBS.הערה: השתמש רק הרוטורים ואביזרים המיועדים ultracentrifuge הנמצאת בשימוש. Pretest הצינורות בתוך הרוטור באמצעות מים, כי כוחו של הצינורות עשויים להשתנות בין מגרשים. 2. צביעת של הדגימות כתם דגימות עם PKH67. להכין את הפתרון צביעת על-ידי הוספת 1 μL של הפתרון צבע ethanolic PKH67 μL 50 של diluent C (כלול בערכה) 1.5 mL התגובה שפופרת, לערבב ביסודיות. להעביר 10 μL של הפתרון מוכתמים μL 20 של ההשעיה EV (להכין בשלב 1.1) אל הצינור התגובה, לערבב ביסודיות, תקופת דגירה של 5 דקות ב RT בחושך. לדלל 50 μL של ההשעיה EV ויטראז’ים עם 2.5 מ ל מזוקקים מים בצינור תגובה 15 מ”ל, לערבב היטב ולהשתמש ההשעייה הסופי למדידה של חלקיקים.הערה: זה חיוני כדי להשתמש במים כמו diluent עבור EV ההשעיה, בגלל מדלל אחרים (למשל, PBS) עלול לפגום את המדידה. בעת שימוש המאוחסנים EV-השעיה, להפשיר את הדגימות בקרח ומערבבים ביסודיות לפני צביעת. כתם דגימות עם נוגדנים ספציפיים. לדלל 10-20 μL של ההשעיה EV (להכין בשלב 1.1) עם 50 μL של מים מזוקקים 1.5 mL התגובה שפופרת, לערבב היטב. להוסיף 2.5-5 μL של נוגדן ספציפי (טבלה 1) הצינור התגובה, לערבב היטב, וכן תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT בחושך. להעביר 50 μL של ההשעיה EV מוכתם 2.5-10 מ ל מים מזוקקים (טבלה 1) צינור תגובה 15 מ”ל, לערבב היטב ולהשתמש ההשעייה הסופי למדידה של חלקיקים.הערה: בנסיבות מסוימות, הריכוז של הנוגדן משומש חייב להיות מותאם (טבלה 1). 3. עיבוד של הדגימות הערה: העקרונות הבסיסיים של שיטה זו בהרחבה שתוארו קודם לכן ומתחת את מתמקדת פרוטוקול על המדרגות ספציפיים לצורך ניתוח של התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית EVs14. בצע את ההליך האתחול. לדחוף את המסנן קרינה פלואורסצנטית לתוך הנתיב אופטי של מיקרוסקופ, מצלמה. הפעלת התוכנית ובצע את ההוראות על המסך עבור אוטומטית מימוש. בחר את המספר הנכון תא (Z158_C1149_Fluor) “תא לבדוק” (הגדרה תא) על הכרטיסיה פלורסצנטיות מדידה. בחר את מיקום התייחסות לצורך אופטיקה לוודא כי לייזר במיקרוסקופ הינם מוקד משותף (לייזר ומיקרוסקופ לעבור עמדה זו באופן אוטומטי). לשטוף את הערוץ תא עם מזרק מלא 10 מ ל מים מזוקקים. ודא כי התא מדידה ללא בועות אוויר, לא להזריק בועות אוויר לתוך המערכת. להכין השעיה כיול המכיל אחיד 200 ננומטר בגודל מתויג פלורסצנטיות פוליסטירן חלקיקים בעלי קבוצות carboxylate על פני השטח שלהם. ΜL 10 שתדללו של החלקיקים עם 990 μL מים מזוקקים. ואז לדלל 10 μL של פתרון זה חלקיקים בשפופרת 15 מ”ל עם 10 מ”ל מים מזוקקים כדי להשיג את הריכוז הדרוש. להזריק 2.5 מ של הפתרון מדולל חלקיקים בערוץ התא ולחץ על “לייעל את המוקד” כדי להתאים את המצלמה. למדוד את הדגימה. לשטוף את הערוץ תא מספר פעמים עם מזרק מלא 10 מ”ל מים מזוקקים לפני כל מדידה לדוגמה. להזריק את המתלים EV ויטראז’ים (להכין בשלב 2) לתוך התעלה תא. להתאים את הפרמטרים הבאים המצלמה הראשית בכרטיסיה “תא לבדוק” בתוכנה כמו הצורך (טבלה 2). השתמש המיקום הפניה או הצב 0.41193 כדי להתאים את הפרמטרים. רגישות, למצוא את טווח רגישות אופטימלית על ידי לחיצה על לחצן “מספר של חלקיקים לעומת רגישות” להצגת עקומת של חלקיקים נמדד לפי המסך עבור רמות רגישות שונה.הערה: תריס, להתאים את תקופת הזמן שבו המצלמה מאפשר לאור לעבור עבור מרווח נחוש. עבור פרמטרים שלאחר הרכישה, לבחור הבהירות מינימלי של 20, בגודל מינימלי של 20 ננומטר, הגודל המרבי של 500 ננומטר למדידה. רשום את מספר החלקיקים שזוהו במניין את שדה הראייה של מהתצוגה. הבר פיזור חייב להיות ירוק למטווח כתומה (חלקיקי 50-300). אם הבר פיזור אדום, הפיזור נתיך חלקיקים בודדים, הם הנספרות בתור חלקיק בודד אחד, ובכך מוביל כוזב. במקרה כזה, עוד יותר לדלל את הדגימה כדי למנוע חפיפה של חלקיקי או להפחית את הרגישות. לחץ על “בדיקת חלקיקים להיסחף ב 0 V” בכרטיסיה “תא לבדוק” לפני שמתחילים את המדידה. אם הסחף הוא גבוה יותר מאשר μm 5/s, המתן עד המדגם יפסיק לזרום כדי להמשיך את המדידה.הערה: אם הסחף גבוהה מדי בתחילת המדידה, המידות חוזרות ניתן שונים, sophisticate את התוצאות. בשל עקרונות היסוד של נ. ת. סחיפה הרלוונטיים עשויים להיות לו השפעה גודל החלקיקים נחוש, כפי שמחשבת התוכנה. לחץ על “הפעל וידאו רכישה” היחידים “מדידה” בחר את מספר ניסויים (3-5) ואת משך ההשהיה ביניהם (0 דקות). הגדרת המספר (בודדים subvolume) משרות (11) ואת מספר מחזורים (מדידה) (10) במיקום כל מדידה, היכן צריך להיות מנותח חלקיקים בחר תיקיה ליצור שם קובץ חדש, לחץ על “אישור” כדי להתחיל את המדידה. 4. פרשנות של תוצאות להציג את התוצאות ואת הפרמטרים בכרטיסייה “ניתוח” לאחר המדידה. בדוק את הפרמטרים הבאים לאחר הניתוח לפני ניקוי התעלה תא: המספר הממוצע של חלקיקים לכל מיקום, המספר הכולל של חלקיקים עקיבה וריכוז החלקיקים, רוחב התפלגות החלקיקים (x10 x50, x90 ערכים), הערך של וסטיית. חזור על המדידה של המדגם במידת הצורך.הערה: התוצאות נשמרות גם בתור קובץ .pdf או. txt. לחץ על הכרטיסיה “ניתוח” כדי להציג את הגרף מחושב לאחר המדידה, אשר מציג את ההתפלגות של החלקיקים שזוהו על-ידי גודל. לחץ על “תצוגה” בכרטיסיה “ניתוח” ולהשתמש הסמלים כדי להתאים ולשנות את ההגדרות גרף עבור דרישות מסוים. 5. אימות באמצעות EV זיהוי על ידי סופג המערבי להמיס את צניפה EV (להכין בשלב 1) במאגר פירוק והפקת ריפה, פיפטה ביסודיות, דגירה על קרח במשך 30 דקות צנטריפוגה המדגם ב x 8000 g 10 דקות ב 4 ° C כדי להבהיר את lysate ולהעביר את תגובת שיקוע צינור חדש. למדוד את החלבון הכולל על ידי ערכת וזמינותו של חלבון לאורי. למהול 1 μL של ההשעיה EV מבודד עם 49 μL ריפה המאגר ושימוש 5 μL triplicates לניתוח. לדלל את המתלים EV באמצעות מאגר x Laemmli העמסה 2 כדי ריכוז סופי של 2 µg/μL, חום למשך 10 דקות ב 95 ° C. לטעון μg 20 של חלבון ליום טוב. להפריד ולהעביר את החלבונים על ידי אלקטרופורזה בג’ל לזיהוי ומיכל סופג על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. לחסום את הקרום (0.2 μm polyvinylidene difluoride) עם אבקת חלב פרה (5%) 1 h ב- RT, דגירה הקרום עם נוגדנים ראשי ספציפיים (CD9, CD63 ו vimentin) בן לילה ב 4 º C.הערה: נוגדנים העיקרי משמשים לדילול 1:1,000. לשטוף את הקרום עם TBST 3 x 5 דקות דגירה הקרום עם חזרת peroxidase (HRP)-נוגדנים משניים מצומדת (1:20, 000 TBST) עבור 60 דקות ב- RT. לשטוף את הקרום עם TBST 3 x 5 דקות, לזהות את החלבונים chemiluminescence עם פתרון המצע רגישות גבוהה במערכת דימות.הערה: בגלל CD63 אנטיגן זה בהרחבה, variably glycosylated, משקל מולקולרי יכול להשתנות, להקות יכולים להופיע בין 40-65 kDa.