توصيف واحد حويصلات خارج الخلية في الدم البشري مع تحليل تتبع نانوحبيبات المستندة إلى الأسفار السريع
Summary
في هذا البروتوكول، يصف لنا إكمال سير العمل لعزل السريع من حويصلات خارج الخلية من دماء كل البشر وتوصيف علامات محددة بتحليل تتبع نانوحبيبات المستندة إلى الأسفار. إظهار درجة عالية من إمكانية تكرار نتائج النتائج المعروضة ويمكن تعديلها ل supernatants ثقافة الخلية.
Abstract
حويصلات خارج الخلية (EVs)، بما في ذلك اكسوسوميس، هي حويصلات نانو الحجم الغشائي المتخصصة الموجودة في سوائل الجسم التي تصدر مؤثرا من العديد من أنواع الخلايا وتلعب دوراً محوريا في تنظيم الاتصالات خلية خلية ومجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية. وقد وصف العديد من أساليب مختلفة لتوصيف المركبات الكهربائية. ومع ذلك، معظم هذه الأساليب قد عيب أن إعداد وتوصيف للعينات التي تستغرق وقتاً طويلاً جداً، أو أنها صعبة للغاية لتحليل علامات محددة من الاهتمام نظراً لصغر حجمها، ونظرا لعدم وجود منفصلة والسكان. بينما أساليب لتحليل المركبات الكهربائية قد تحسنت إلى حد كبير خلال العقد الماضي، لا يزال هناك أي أسلوب موحد لتوصيف واحد ف. س. هنا، نحن تثبت أسلوب شبه الآلي لتوصيف المركبات الكهربائية واحدة بتحليل تتبع نانوحبيبات المستندة إلى الأسفار. البروتوكول الذي يرد يعالج مشكلة مشتركة للعديد من الباحثين في هذا الميدان وتقدم سير العمل كاملة للعزلة السريع للمركبات الكهربائية وتوصيف مع PKH67، رابط غشاء الخلية عامة، فضلا عن علامات محددة السطحية هذه كما CD63، CD9، فيمنتين، وغشاء الليزوزومية المرتبطة بالبروتين 1 (مصباح-1). وتظهر النتائج قدم مستوى عال في إمكانية تكرار نتائج، كما أكدت بأساليب أخرى، مثل النشاف الغربية. في التجارب التي أجريت، قمنا باستخدام المركبات الكهربائية المعزولة من عينات مصل الدم البشري حصرا، ولكن هذا الأسلوب هو أيضا مناسبة للبلازما أو سوائل الجسم الأخرى، ويمكن تعديلها لتوصيف المركبات الكهربائية من supernatants ثقافة الخلية. بغض النظر عن التقدم في المستقبل للبحث عن الأحياء EV، ينص البروتوكول على أن يرد هنا طريقة سريعة وموثوق بها لتوصيف السريع للمركبات الكهربائية واحدة مع علامات محددة.
Introduction
حويصلات خارج الخلية (EVs)، بما في ذلك اكسوسوميس، المتخصصة الغشائي نانو الحجم حويصلات (20-150 nm) الذي يحتوي على تركيبات معينة من الدهون، والالتصاق وجزيئات إرسال الإشارات بين الخلايا، فضلا عن المكونات الأخرى الفنية سيتوسوليك مثل ميكرورنا (ميرنا) ومرناً، وتلعب دوراً محوريا في تنظيم خلية خلية الاتصالات1،2. المركبات الكهربائية يتم الإفراج في بيئتهم من العديد من أنواع مختلفة من الخلايا، مثل خلايا بطانية، والخلايا المناعية والخلايا السرطانية، ويمكن الكشف عن في سوائل الجسم مثل السائل المنوي المصل أو البول، حليب الثدي، اللعاب أو النخاعي3، 4-زيادة إعداد الدراسات تسليط الضوء على مساهمة متنوعة من المركبات الكهربائية كالمؤشرات الحيوية المحتملة للتشخيص المبكر للعديد من الأمراض و/أو التنبؤ بتطور المرض5،6. كثيرا ما توصف اكسوسوميس بوجود الجزيئات التي ترتبط على وجه التحديد مع، بغض النظر عن نوع الخلية التي تجنيها من7. على سبيل المثال، تحتوي على تيتراسبانينس مختلفة (CD9، CD63، CD81) اكسوسوميس، الرئيسية الفئة المعقدة histocompatibility أنا (MHC أنا) الجزيئات، ومختلف البروتينات transmembrane، البروتينات سيتوسوليك نموذجي (tubulin واكتين)، جزيئات المتورطين في (هيئة مولتيفيسيكولار نشوء حيوي مفب) (TSG101 وأليكس)، حرارة صدمة بروتينات (HSP 70 و HSP 90)، والبروتينات التي تشارك في الإشارات تنبيغ (بروتين مؤنزم)8.
وقد وصف العديد من أساليب مختلفة لتوصيف المركبات الكهربائية9. هي الأساليب الأكثر شيوعاً وانتشارا المستخدمة لتحليل EV التدفق الخلوي10، المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)، وانتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM)11. هو أسلوب بيستيستابليشيد وتستخدم عادة لوصف المحتوى EV البيوكيميائية الغربية النشاف12،13. بينما تسمح تيم ووزارة شؤون المرأة للكشف عن المركبات الكهربائية عبر طيف كامل الحجم، محدودة للغاية تحديد البروتينات السطحية محددة وضع غير مؤات لهذه الأساليب. وفي المقابل، التدفق الخلوي أداة قوية لتحديد معالم السطح EV محددة، ولكن على عتبة هذا الأسلوب يحد مع التحليل للمركبات الكهربائية بحجم أكبر من 500 نانومتر. ومن ثم تحليل للمركبات الكهربائية المعزولة بالكشف عن علامات السطحية المحددة حاليا لا الوصول إليها من خلال أي من هذه الطرق الثلاث الراسخة. ونحن سابقا وصف طريقة أخرى حساسة للغاية لتصور وتحليل للمركبات الكهربائية، تحليل تتبع نانوحبيبات (NTA)14. باختصار، هذا الأسلوب يجمع بين اثنين من مبادئ فيزيائية مختلفة. أولاً، مبعثر جزيئات الضوء عندما كانوا هم المشع بشعاع ليزر، والمبدأ الثاني، يعرف باسم الحركة البراونية، يعني ضمناً أن نشر جزيئات مختلفة في تعليق سائل تناسبا عكسيا مع حجمها. أداة تحليل نانوحبيبات سطح المكتب شبه الآلي لعينات سائلة تتكون من الجسيمات تتبع محلل بتحليل يستند إلى البرامج، حيث يتم تسجيل الصور الرقمية الضوء المتناثرة من جزيئات مفردة. يتم الكشف عن الجسيمات وحركة الجسيمات مجهر نثر ليزر مع كاميرا فيديو. شعاع الليزر موجه عمودياً، بينما المحور الضوئي الأفقي ومركزة في القناة خلية مليئة العينة. البيانات المقدمة من مؤامرات للبقع الخفيفة المتناثرة وسرعة الحركة تمكين تحديد الجسيمات مجموع عدد وحجم التوزيع. بعد التشعيع بالليزر، مبعثر الجسيمات الضوء، ومسجل من قبل كاميرا الفيديو رقمية عن طريق المجهر14. النهوض باسلوبنا السابق هو إدراج عامل تصفية الوقف نانومتر طويلة الموجه-تمرير (LWP) 500 بين الليزر (الطول الموجي 488 نانومتر) وقناة الخلية، مما يتيح التحليل المباشر للجسيمات الفلورية المسمى (الشكل 1). لدينا بروتوكول يتناول الطلب المشتركة العديد من الباحثين في هذا الحقل لوصف سريع للمركبات الكهربائية واحدة، مثلاً، حسب أصلهم الأبوية. في هذا البروتوكول، يصف لنا إكمال سير العمل لعزل السريع للمركبات الكهربائية من دماء كل البشر وتوصيف سريع لعلامات محددة بالأسفار-على أساس تحليل تتبع جسيمات نانوية. ويمكن الكشف عن المركبات الكهربائية تلطيخ مع PKH67، رابط غشاء الخلية عامة، وكذلك مع علامات اكسوسومال محددة، مثلاً، CD63، CD9، وفيمنتين. أن البروتوكول أيضا مناسبة يدتا والبلازما سيتراتيد، فضلا عن غيرها من سوائل الجسم و supernatants ثقافة الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظهر بروتوكول مفصل لعزل المركبات الكهربائية من الدم كله وتوصيف سريع لعلامات السطحية محددة مع جسيمات نانوية تتبع التحليل القائم على الأسفار. في التجارب التي أجريت، قمنا باستخدام المركبات الكهربائية المعزولة من عينات المصل حصرا، ولكن هذا الأسلوب هو أيضا مناسبة للبلازما سيتراتيد وحمض الإيثيلين (يدتا) ويمكن أيضا توسيع لسوائل الجسم الأخرى مثل البول وحليب الأم واللعاب، النخاعي، والسائل المنوي. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل هذا البروتوكول لتوصيف المركبات الكهربائية من supernatants ثقافة الخلية. في هذا البروتوكول، بتعليق EV تم إنشاؤها من 100 ميكروليتر من المصل باستخدام كاشف اكسوسومي هطول الأمطار، الذي يتضمن بوليمر ملكية التي بلطف رواسب اكسوسوميس والمركبات الكهربائية وفقا لحجم كوربوسكولار تتراوح بين 30 نانومتر إلى 200 نانومتر، حيث 10-20 ميكروليتر وعين من المركبات الكهربائية لتوصيف كل علامة السطحية. ولسوء الحظ، خطوة العزل أمر لا مفر منه، لأن كمية عالية من البروتين في عينات مصل الدم (مثل الزلال والجلوبيولين) يتداخل مع جسم تلطيخ الداخلي ويؤدي إلى ارتفاع مستوى الخلفية ونتائج متطورة. وعلاوة على ذلك، استناداً إلى توافر اكسوسوميس في العينات البيولوجية، يجب تعديل المبلغ تعليق EV العاملين، فضلا عن إضعاف قبل المعالجة للمواد المصدر الأخرى. مقارنة عينات متعددة، من الضروري اتباع نهج موحد للتخفيف من عينات، فضلا عن اقتناء متسقة المعلمات (حساسية، مصراع، إلخ). هناك نقطة أخرى مهمة أن القياسات لم تبدأ حتى الانجراف منخفض (في أيدينا، < 5 ميكرومترات/s). إذا كان الانحراف عالية جداً، القياسات المتكررة للعينة أسفرت عن الانحراف المعياري عالية فيما بينها، ولكن مع انجراف منخفضة، تتفق والغاية البيانات الناتجة وأكدت على مستوى عال من إمكانية تكرار نتائج. من المهم أن الأجسام المضادة المحددة لها فلوروتشرومي مناسبة. يجب أن يكون مترافق الأجسام المضادة مع أليكسا فلور 488، سبب فيتك لديها نسبة عالية من تبييض الصورة. ربما فلوفوريس أكثر استقرارا التأكيد سيؤدي إلى المقايسة زيادة الاستقرار في المستقبل. عادة، استخدام العديد من الباحثين PBS كمخفف لف. س. لهذا البروتوكول، من الأهمية بمكان لاستخدام الماء المقطر مخفف لأن الإيقاف EV. عندما تتم تسمية المركبات الكهربائية مع الأصباغ الاستشعاع، أوسمولاليتي عالية وتركيز أيون منظفة الأخرى، مثل برنامج تلفزيوني، يمكن أن تتداخل مع القياس، وتؤدي إلى تغيير النتائج.
بينما أساليب لتحليل المركبات الكهربائية قد تحسنت إلى حد كبير خلال العقد الماضي، لا يزال هناك أي أسلوب موحد لعزل وتوصيف ف. س. أما العيب الرئيسي للتدفق الخلوي، حيث المركبات الكهربائية غالباً ما ترتبط الخرز لتوفير مساحة أكبر، هو أن العديد من المركبات الكهربائية قفص الاتهام إلى سطح لتوفير إشارة قوية وقابلة للاكتشاف10. تيم ووزارة شؤون المرأة قد عيب أن إعداد العينات مضيعة للوقت ويمكن تمييز المركبات الكهربائية فقط على حجم ومورفولوجيا11. حتى الآن، طريقة بيستيستابليشيد واستخداما للنوعية (أي، البيوكيميائية) هو توصيف EV الغربية النشاف، حيث يمكن أن تحلل البروتينات مع الأجسام المضادة المحددة12،13. ومع ذلك، عيوب كل هذه الأساليب تكمن في عدم القدرة على تحليل المركبات الكهربائية واحدة لعلامات سطح معين. وعلاوة على ذلك، أوقات المعالجة طويلة وإجراءات الغسيل/العزلة الطويلة المستخدمة من قبل العديد من البروتوكولات الحالية تنطوي على خطوات ذات العمالة الكثيفة، مما يجعلهم غير مناسب للعينة عالية الإنتاجية وتوصيف واحد ف. س. لدينا بروتوكول يوفر سير عمل كاملة لعزله سريعة وتوصيف المركبات الكهربائية واحدة مع علامات السطحية محددة مثل CD63، CD9، فيمنتين، و CD107a، ويمكن توسيعها لنطاق عريض من علامات أخرى السطحية تحديد منشأ صدر ف. س. بسبب تقدم تقني دائم لجهاز الإدارة الوطنية للسياحة، ونحن أكدت النتائج التي توصلنا إليها بالتعاون مع الشركة المصنعة مع محلل أحدث. البروتوكول الذي يرد هنا بغض النظر عن التقدم في المستقبل للبحث عن الأحياء EV، لا سيما فيما يتعلق اكسوسوميس، سوف توفر طريقة سريعة وموثوقة لتوصيف المركبات الكهربائية واحدة علامات محددة. نظراً لتجميع المركبات الكهربائية أثناء العزل والإجراء المصبوغة حتى الآن أمرا لا مفر منه، ينبغي أن تركز البحوث المستقبلية على تطوير أساليب لمنع التراكم EV وتمكين تحديد حجم دقيق المسمى فلوري داس.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الجسيمات Metrix GmbH لتغطية تكاليف نشر هذا العمل جزئيا.
Materials
| Serum-separation tube | BD | 366882 | BD Vacutainer |
| Ampuwa water | Fresenius Kabi | 10060 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Sigma | 56064C | |
| Falcon tube, 15 mL | Greiner Bio One | 188271 | |
| Falcon tube, 50 mL | Greiner Bio One | 227270 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Speciality tubes for ultra centrifugation |
| Tube with Snap-On Cap 1.5 mL | Beckman Coulter | 357448 | |
| Polybeads Microspheres 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 7304 | Alignment Solution |
| Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres beads 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 09834-10 | Alignment Solution |
| Syringe, 2 mL | Braun | 4606027V | |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606728V | |
| Exoquick | SBI | EXOQ20A-1 | EV precipitation solution |
| Laemmli Sample Buffer (2x) | BioRad | 1610737 | |
| DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | Lowry prtein assay |
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH67GL-1KT | For general membrane labelling |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD107a Antibody | BioLegend | 328609 | Lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP-1) |
| Human CD9-Alexa Fluor 488 | R&D Systems | FAB1880G | |
| Anti-CD9 Antibody | SBI | EXOAB-CD9A-1 | |
| CD63-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | MA5-18149 | |
| FITC anti-human CD63 Antibody | BioLegend | 353005 | |
| CD63. Antibody, polyclonal | SantaCruz | Sc-15363 | |
| Alexa Fluor 488 anti-vimentin Antibody | BioLegend | 677809 | |
| Anti-Vimentin Antibody | SBI | EXOAB-VMTN-1 | |
| Goat anti mouse IgG + IgM | Jackson Immuno | 315-035-048 | |
| Goat anti rabbit IgG | Dianova | 111-035-003 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | ThermoFisher | 34094 | |
| ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
| Chemiluminescence Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 |
References
- Ibrahim, A., Marban, E. Exosomes: Fundamental Biology and Roles in Cardiovascular Physiology. Annual Review of Physiology. 78, 67-83 (2016).
- Su, S. A., et al. Emerging role of exosome-mediated intercellular communication in vascular remodeling. Oncotarget. 8 (15), 25700-25712 (2017).
- Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. Journal of Translational Medicine. 9, 9 (2011).
- Li, M., et al. Analysis of the RNA content of the exosomes derived from blood serum and urine and its potential as biomarkers. Philosophical Transactions of The Royal Society B Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
- Lin, J., et al. Exosomes: novel biomarkers for clinical diagnosis. The Scientific World Journal. 2015, 657086 (2015).
- Properzi, F., Logozzi, M., Fais, S. Exosomes: the future of biomarkers in medicine. Biomarkers in Medicine. 7 (5), 769-778 (2013).
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
- Bianco, N. R., Kim, S. H., Morelli, A. E., Robbins, P. D. Modulation of the immune response using dendritic cell-derived exosomes. Methods in Molecular Biology. 380, 443-455 (2007).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7 (12), 5157-5166 (2008).
- Mehdiani, A., et al. An innovative method for exosome quantification and size measurement. Journal of Visualized Experiments. (95), 50974 (2015).
