Listeria monocytogenes Infección del cerebro
Summary
Durante la infección, la Listeria monocytogenes es capaz de atravesar la barrera hemato – encefálica para colonizar el cerebro. En este protocolo, se demuestra cómo evaluar la colonización bacteriana de los órganos después de la infección de ratones. Se proporciona un procedimiento para realizar la perfusión de órganos enteros para determinación específica de números bacterianos en la parenquimia del cerebro.
Abstract
Listeria monocytogenes es un patógeno bacteriano intracelular que se asocia frecuentemente a infecciones transmitidas por los alimentos. La capacidad de L. monocytogenes para cruzar la barrera blood – brain (BBB) es acerca de como puede llevar a la peligrosa meningitis y encefalitis. El BBB protege el microambiente de cerebro de varios metabolitos tóxicos y patógenos microbianos que se encuentran en la sangre después de la infección y por lo tanto apoya la homeostasis cerebral. Los mecanismos por el que L. monocytogenes presentes en el torrente sanguíneo cruzar el BBB para causar cerebro infecciones no son completamente entendidas y también hay una falta de un sistema robusto modelo para estudiar el cerebro de infecciones causadas por L. monocytogenes. Aquí, presentamos un modelo de infección del ratón simple para determinar si las bacterias han cruzado el BBB y para cuantificar la carga de bacterias que han colonizado el cerebro en vivo. En este método, por vía intravenosa estaban infectados con L. monocytogenes y animales fueron sacrificados humanitariamente por la exposición a CO2 seguido por dislocación cervical. La perfusión cardíaca de los animales fue realizada antes de la cosecha de órganos infectados. Se extrajo sangre antes de la perfusión y el número de bacterias por órgano o mL de sangre se determinó mediante diluciones de los homogenados en placas de agar sangre o el órgano de la galjanoplastia y contando el número de colonias formadas. Este método puede utilizarse para el estudio de las interacciones receptor-ligando novela que mejoran la infección del cerebro por L. monocytogenes y pueden ser fácilmente adaptado para el estudio de múltiples patógenos bacterianos.
Introduction
La bacteria gram-positiva Listeria monocytogenes es un patógeno intracelular facultativo y uno de los patógenos más mortales transmitidas por los alimentos en todo el mundo. Ingestión de alimentos de L. monocytogenes contaminados puede provocar listeriosis en humanos, una enfermedad invasiva grave dirigidos a mujeres en su mayoría embarazadas, recién nacidos, los ancianos y immunocompromised los individuos1. L. monocytogenes es una de las principales causas de muerte por un patógeno transmitidas por los alimentos en los Estados Unidos y tasas de mortalidad caso de listeriosis son tan altas como 20-30%, el más alto de todos los agentes patógenos transmitidos por los alimentos2. Actualmente no existe ninguna vacuna para L. monocytogenes y la capacidad de las bacterias efectivamente diseminado a órganos distales y el cerebro por cruzar la barrera blood – brain (BBB) puede conducir a meningitis potencialmente mortal y la colonización del cerebro3 , 4 , 5 , 6. la meningitis bacteriana es generalmente severa; mientras que la mayoría de las personas que reciben tratamiento se recupera, infecciones pueden causar complicaciones serias, por ejemplo, daño cerebral, pérdida de la audición o problemas de aprendizaje en los niños. L. monocytogenes se predice para tener en cuenta al menos el 10% de toda la comunidad adquirió meningitis en US7.
Una ruta importante para la diseminación bacteriana al cerebro y meninges es a través del torrente sanguíneo. Las bacterias circulando en los vasos sanguíneos en el cerebro son capaces de cruzar el BBB para causar infección en el cerebro. El BBB es un sistema altamente vascularizada de la barrera que protege el cerebro contra las partículas extrañas que circulan en la sangre. Las células endoteliales constituyen una capa que recubre la superficie interior de los vasos sanguíneos8,9. Además de L. monocytogenes, son capaces de colonizar varias bacterias patógenas como Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coliy Haemophilus influenzae tipo b (Hib) el cerebro atravesando la BBB3,4,5,6. Sin embargo, al examinar las cargas bacterianas en el cerebro de ratones infectados, es importante determinar que si las bacterias han cruzado el BBB, de lo contrario la carga bacteriana en el cerebro puede representar las bacterias que se encuentran todavía en los vasos sanguíneos del cerebro. Por lo tanto, es necesario inundar los ratones de toda la sangre antes de la determinación de unidades formadoras de colonias (UFC) de homogenados de cerebro.
En este estudio, describimos en vivo métodos para examinar infección de L. monocytogenes del cerebro. Para los métodos descritos aquí, se utilizó la cepa de L. monocytogenes 10403S. L. monocytogenes 10403S es una de las cepas de laboratorio más utilizados para el estudio de listeriosis sistémica en el modelo murino de infección10. Este protocolo se basa en la inyección intravenosa estándar de L. monocytogenes seguido de perfusión de los ratones. Un Resumen esquemático del protocolo infección en ratones se muestra en la figura 1. L. monocytogenes-cerebros infectados y otros órganos de los ratones sin perfusión o perfusión fueron recogidos y la carga bacteriana órgano determinado. Estos métodos son útiles para determinar no sólo la total colonización bacteriana del cerebro en los animales infectados, pero también son beneficiosos para determinar si las bacterias han penetrado el BBB en vivo para mediar una invasión del cerebro. Es importante destacar que este protocolo de laboratorio debe realizarse previa consulta con la gerencia de facilidad de animales y el Comité de bioseguridad institucional correspondiente.
Protocol
Representative Results
Discussion
L. monocytogenes es capaz de causar meningoencefalitis mortales en seres humanos. Estudios previos han demostrado la capacidad de las bacterias para cruzar la barrera blood-brain (BBB) y para colonizar el cerebro. Se han propuesto tres vías de invasión del cerebro durante la infección: directa penetración del BBB por bacterias, stealth transporte por bacterias contenidas dentro de las células mononucleares3y la migración axonal por las cepas de L. monocytogenes causantes de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el servicio de salud pública de los Estados Unidos otorgar AI103806 de los institutos nacionales de salud.
Materials
| Brain Heart Infusion media | Becton Dickinson | 237200 | |
| Streptomycin sulfate | Amresco | 0382-50G | |
| Petri dishes | VWR | 25384-342 | |
| Glycerol | VWR | 97062-832 | |
| IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer | IKA | 3352109 | Model: T18BS1 |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 series | |
| BALB/c mice | Jackson Laboratory | Model #000651 | |
| 1 mL syringes | Becton Dickinson | 309659 | |
| 26-gauge needles | Becton Dickinson | 305115 | |
| 21-gauge butterfly needles | Becton Dickinson | 367281 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60004 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| Round-bottom test tubes | VWR | 60819-546 | |
| Phosphate-buffered saline | Corning | 46-013-CM | |
| Stainless steel spatula | VWR | 82027-520 | |
| Stainless steel scissors (6.5 in) | VWR | 82027-592 | |
| Stainless steel scissors (4.5 in) | VWR | 82027-578 | |
| Stainless steel blunt forceps (4.5 in) | VWR | 82027-440 | |
| Stainless steel fine tip forceps (6 in) | VWR | 82027-406 |
References
- Radoshevich, L., Cossart, P. Listeria monocytogenes: towards a complete picture of its physiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 32-46 (2018).
- de Noordhout, C. M., et al. The global burden of listeriosis: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Infectious Diseases. 14 (11), 1073-1082 (2014).
- Drevets, D. A., Leenen, P. J., Greenfield, R. A. Invasion of the central nervous system by intracellular bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 323-347 (2004).
- Huang, S. H., Stins, M. F., Kim, K. S. Bacterial penetration across the blood-brain barrier during the development of neonatal meningitis. Microbes and Infection. 2 (10), 1237-1244 (2000).
- Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology, diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clinical Microbiology Reviews. 23 (3), 467-492 (2010).
- Thigpen, M. C., et al. Bacterial meningitis in the United States, 1998-2007. New England Journal of Medicine. 364 (21), 2016-2025 (2011).
- Durand, M. L., et al. Acute bacterial meningitis in adults. A review of 493 episodes. The New England Journal of Medicine. 328 (1), 21-28 (1993).
- Disson, O., Lecuit, M. Targeting of the central nervous system by Listeria monocytogenes. Virulence. 3 (2), 213-221 (2012).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
- Kirchner, M., Higgins, D. E. Inhibition of ROCK activity allows InlF-mediated invasion and increased virulence of Listeria monocytogenes. Molecular Microbiology. 68 (3), 749-767 (2008).
- Grubaugh, D., et al. The VirAB ABC transporter is required for VirR regulation of Listeria monocytogenes virulence and resistance to nisin. Infection and Immunity. 86 (3), 901-917 (2018).
- Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
- Ghosh, P., et al. Invasion of the brain by Listeria monocytogenes is mediated by InlF and host cell vimentin. MBio. 9 (1), e00160-e00118 (2018).
- Henke, D., et al. Listeria monocytogenes spreads within the brain by actin-based intra-axonal migration. Infection and Immunity. 83 (6), 2409-2419 (2015).
- Maury, M. M., et al. Uncovering Listeria monocytogenes hypervirulence by harnessing its biodiversity. Nature Genetics. 48 (3), 308-313 (2016).
