Листерий Инфекция мозга
Summary
Во время инфекции Listeria monocytogenes способна пересечения blood – brain барьер колонизировать мозга. В этом протоколе мы продемонстрируем оценить бактериальной колонизации органов после инфицирования мышей. Предусмотрена процедура для выполнения весь орган перфузии для конкретного определения бактериальной чисел в паренхиме мозга.
Abstract
Листерий является внутриклеточных бактериальных патогенов, который часто ассоциируется с пищевыми инфекции. L. моноцитогенес возможность пересечь гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) относительно как это может привести к жизни менингит и энцефалит. BBB защищает мозг микроокружения от различных токсических метаболитов и патогенных микробов в крови после инфекции и поэтому поддерживает гомеостаза головного мозга. Механизмы, которыми л моноцитогенес в кровь Креста BBB, чтобы вызвать мозг инфекции полностью не поняты и есть также отсутствие системы надежную модель для изучения мозга инфекций л моноцитогенес. Здесь мы представляем простой мыши инфекции модель для определения ли бактерии пересекли BBB и quantitate бремя бактерий, которые колонизировали мозга в естественных условиях. В этом методе животные были инфицированы внутривенно с L. моноцитогенес и были гуманно euthanized под воздействием CO2 следуют шейки матки дислокации. Сердца перфузии животных была выполнена до уборки инфицированных органов. Кровь была собрана до перфузии и количество бактерий на орган или мл крови определяется покрытие разведениях крови или орган гомогенатах на плитах агара и подсчитывать количество колоний сформирован. Этот метод может использоваться для изучения взаимодействия Роман рецептор лиганд, которые повышают инфекции мозга, L. моноцитогенес и может быть легко адаптирована для изучения нескольких бактериальных патогенов.
Introduction
Грамположительные бактерии листерий является факультативной внутриклеточных патогенов и один из наиболее смертоносных пищевых патогенов во всем мире. Проглатывание л моноцитогенес загрязненных продуктов питания может привести к листериоз в организме человека, тяжелой инвазивное заболевание ориентации основном беременных женщин, новорожденных, пожилым и ослабленным иммунитетом лица1. L. моноцитогенес является одной из ведущих причин смерти в результате пищевого патогена в США и летальности от листериоз достигает 20 – 30%, самый высокий для всех пищевых патогенов2. Для л моноцитогенес в настоящее время существует нет вакцины и способность бактерий, эффективно распространяться в дистальной органов и мозг через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) может привести к жизни менингит и колонизации мозга3 , 4 , 5 , 6. Бактериальный менингит обычно суров; Хотя большинство людей, которые получают лечение выздоравливают, инфекции может вызвать серьезные осложнения, например, повреждения головного мозга, потеря слуха или обучения инвалидов в детей. L. моноцитогенес прогнозам, приходится менее 10% всех сообщества приобрели менингита в США7.
Основным маршрутом для бактериального распространения мозга и мозговых оболочек — через кровь. Бактерии, циркулирующих в кровеносных сосудов в мозге могут пересекать BBB вызывают инфекции головного мозга. BBB является системой весьма васкуляризированной барьер, защищающий мозг от посторонних частиц, циркулирующих в крови. Эндотелиальные клетки образуют слой, что линии внутренней поверхности кровеносных сосудов8,9. В дополнение к л monocytogenesнесколько бактериальных патогенов, таких как Neisseria meningitidis, пневмококк, кишечная палочкаи Haemophilus influenzae типа b (Hib) способны колонизации мозг, перейдя в BBB3,4,5,6. Однако при изучении бактериальной нагрузки в головном мозге зараженных мышей, важно определить ли бактерии пересекли BBB, в противном случае бактериальной нагрузки в головном мозге может представлять бактерий, которые все еще находятся в кровеносных сосудов мозга. Таким образом это необходимо для perfuse мышей всех крови до определения формирования колонии единиц (CFU) гомогенатах мозга.
В этом исследовании мы описываем в vivo методы для изучения л моноцитогенес инфекции мозга. Для методов, описанных здесь мы использовали л моноцитогенес штамм 10403S. L. моноцитогенес 10403S является одним из наиболее широко используемых лабораторных штаммов для изучения системных листериоз в мышиной модели инфекции10. Этот протокол основан на стандартных внутривенным введением л моноцитогенес следуют перфузии мышей. Схематический план инфекции протокола в мышах показано на рисунке 1. L. monocytogenes-инфицированных мозги и других органов от-увлажненную или перфузии мышей были собраны и бремя бактериальных органа определяется. Эти методы являются полезными для определения не только общей бактериальной колонизации мозга в зараженных животных, но также являются полезными для определения, является ли бактерии проникли BBB в vivo посредником вторжения головного мозга. Важно подчеркнуть, что этот протокол лаборатория должна проводиться после консультаций с руководством Фонда соответствующих институциональных биобезопасности Комитета и животных.
Protocol
Representative Results
Discussion
L. monocytogenes способна вызвать менингоэнцефалит, угрожающих жизни людей. Предыдущие исследования показали способность бактерий пересечь blood-brain барьер (BBB) и колонизировать мозга. Были предложены три маршрута мозга вторжения во время инфекции: прямое проникновение BBB бактериями, стелс …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Служба общественного здравоохранения США Грант AI103806 от национальных институтов здоровья.
Materials
| Brain Heart Infusion media | Becton Dickinson | 237200 | |
| Streptomycin sulfate | Amresco | 0382-50G | |
| Petri dishes | VWR | 25384-342 | |
| Glycerol | VWR | 97062-832 | |
| IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer | IKA | 3352109 | Model: T18BS1 |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 series | |
| BALB/c mice | Jackson Laboratory | Model #000651 | |
| 1 mL syringes | Becton Dickinson | 309659 | |
| 26-gauge needles | Becton Dickinson | 305115 | |
| 21-gauge butterfly needles | Becton Dickinson | 367281 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60004 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| Round-bottom test tubes | VWR | 60819-546 | |
| Phosphate-buffered saline | Corning | 46-013-CM | |
| Stainless steel spatula | VWR | 82027-520 | |
| Stainless steel scissors (6.5 in) | VWR | 82027-592 | |
| Stainless steel scissors (4.5 in) | VWR | 82027-578 | |
| Stainless steel blunt forceps (4.5 in) | VWR | 82027-440 | |
| Stainless steel fine tip forceps (6 in) | VWR | 82027-406 |
References
- Radoshevich, L., Cossart, P. Listeria monocytogenes: towards a complete picture of its physiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 32-46 (2018).
- de Noordhout, C. M., et al. The global burden of listeriosis: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Infectious Diseases. 14 (11), 1073-1082 (2014).
- Drevets, D. A., Leenen, P. J., Greenfield, R. A. Invasion of the central nervous system by intracellular bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 323-347 (2004).
- Huang, S. H., Stins, M. F., Kim, K. S. Bacterial penetration across the blood-brain barrier during the development of neonatal meningitis. Microbes and Infection. 2 (10), 1237-1244 (2000).
- Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology, diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clinical Microbiology Reviews. 23 (3), 467-492 (2010).
- Thigpen, M. C., et al. Bacterial meningitis in the United States, 1998-2007. New England Journal of Medicine. 364 (21), 2016-2025 (2011).
- Durand, M. L., et al. Acute bacterial meningitis in adults. A review of 493 episodes. The New England Journal of Medicine. 328 (1), 21-28 (1993).
- Disson, O., Lecuit, M. Targeting of the central nervous system by Listeria monocytogenes. Virulence. 3 (2), 213-221 (2012).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
- Kirchner, M., Higgins, D. E. Inhibition of ROCK activity allows InlF-mediated invasion and increased virulence of Listeria monocytogenes. Molecular Microbiology. 68 (3), 749-767 (2008).
- Grubaugh, D., et al. The VirAB ABC transporter is required for VirR regulation of Listeria monocytogenes virulence and resistance to nisin. Infection and Immunity. 86 (3), 901-917 (2018).
- Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
- Ghosh, P., et al. Invasion of the brain by Listeria monocytogenes is mediated by InlF and host cell vimentin. MBio. 9 (1), e00160-e00118 (2018).
- Henke, D., et al. Listeria monocytogenes spreads within the brain by actin-based intra-axonal migration. Infection and Immunity. 83 (6), 2409-2419 (2015).
- Maury, M. M., et al. Uncovering Listeria monocytogenes hypervirulence by harnessing its biodiversity. Nature Genetics. 48 (3), 308-313 (2016).
